Macherey-Nagel NucleoMag HMW DNA, high molecular weight DNA Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
Moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d'utilisation
ADN de haut poids moléculaire
n NucleoMag® HMW DNA
Février 2024 / Rev. 01
www.mn‑net.com
www.mn‑net.com
Contact MN
Germany and international
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.:
+49 24 21 969-0
Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only)
E-mail: info@mn-net.com
Technical Support Bioanalysis
Tel.:
+49 24 21 969-333
E-mail: support@mn-net.com
USA
MACHEREY-NAGEL Inc.
924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA
Toll-free: 888 321 6224 (MACH)
E-mail: sales-us@mn-net.com
France
MACHEREY-NAGEL SAS
1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France
Tel.:
+33 388 68 22 68
E-mail: sales-fr@mn-net.com
MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 €
Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531
Switzerland
MACHEREY-NAGEL AG
Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland
Tel.:
+41 62 388 55 00
E-mail: sales-ch@mn-net.com
www.mn‑net.com
ADN de haut poids moléculaire
Sommaire
1 Composition du kit
4
1.1 Composants
4
1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
4
1.3 A propos de ce manuel
5
2 Description du kit
6
2.1 Principe général
6
2.2 Généralités sur la manipulation de l’ADN de haut poids moléculaire
7
2.3 Lyse des échantillons
7
2.4 Manipulation des billes magnétiques
11
2.5 Automatisation
11
2.6 Procédure d’élution
12
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
4 Instructions de sécurité
4.1 Elimination des déchets
13
14
14
5 Protocole de purification de l’ADN de haut poids moléculaire avec le tampon de lyse
HM1
15
5.1 Résumé du protocole
15
5.2 Protocole détaillé
18
6 Protocole support pour la lyse d’échantillons avec les tampons HMb et HMc
6.1 Protocole détaillé
7 Annexes
23
23
25
7.1 Guide de résolution des problèmes
25
7.2 Informations de commande
28
7.3 Restrictions d’utilisation / ​garantie
29
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
3
ADN de haut poids moléculaire
1
Composition du kit
1.1
Composants
NucleoMag® HMW DNA
REF
1 × 96 preps
744160.1
NucleoMag® B-Beads
2 × 1.25 mL
Tampon de lyse HM1
75 mL
Tampon de lyse HMb
75 mL
Tampon de précipitation HMc
25 mL
Tampon de fixation HM2
40 mL
Tampon de lavage HM3
100 mL
Tampon de lavage HM4
125 mL
Tampon de rinçage HM5
60 mL
Tampon d’élution HM6
13 mL
Protéinase K liquide
2 × 1.25 mL
RNase A (lyophilisée)
2 × 100 mg
Notice d’utilisation
1
1.2
Réactifs, consommables et équipements à fournir par
l’utilisateur
Réactifs:
•
Ethanol 70 % (v/v) (éthanol absolu ou non dénaturé)
•
Optionnel: Enzymes lytiques et tampons de réaction associés (par exemple, lyticase,
zymolyase, lysozyme, cellulase, chitinase, pectinase, drisélase et autres).
•
Optionnel: Kit de réparation enzymatique de l’ADN pour réduire la quantité d’ADN
endommagé et augmenter la longueur moyenne des lectures pour les séquenceurs
de troisième génération.
Consommables:
•
Cônes jetables à embout large (les cônes de pipette avec filtre sont recommandés
pour éviter les contaminations croisées)
•
Microtubes de 2 mL
4
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
ADN de haut poids moléculaire
Equipements :
•
Bloc chauffant, incubateur ou bain-marie, alternativement : Thermomixer approprié
tel que Eppendorf ou Starlab Thermomixer
•
Microcentrifugeuse pour microtubes de 2 mL, capable d’atteindre 11 000 x g
•
Mortier / pilon et de l’azote liquide
Général :
•
Équipements de protection individuelle (par exemple, blouse de laboratoire, gants,
lunettes)
Produit
REF
Conditionnement
Aimant pour la séparation des billes magnétiques
p.e. NucleoMag® SEP Mini (adapté aux tubes de 1,5 et
2 mL)
744901
1
1.3
A propos de ce manuel
Nous recommandons vivement la lecture du protocole détaillé aux nouveaux utilisateurs
du kit NucleoMag® HMW DNA. Les utilisateurs expérimentés, quant à eux, pourront
utiliser le résumé du protocole. Ce dernier est conçu pour un suivi rapide des différentes
étapes de la procédure.
Toute la documentation technique est disponible sur notre site internet www.mn‑net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au manuel actuel par rapport aux révisions précédentes.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
5
ADN de haut poids moléculaire
2
Description du kit
2.1
Principe général
Le kit NucleoMag® HMW DNA est conçu pour la purification d’ADN de haut poids
moléculaire à partir de cellules, de tissus et de matériel végétal. En outre, la compatibilité
a été démontrée pour le sang total (EDTA), la salive, les écouvillons buccaux ainsi que les
échantillons de bactéries et de levures. La procédure est basée sur l’adsorption réversible
des acides nucléiques sur des billes paramagnétiques dans des conditions de tampon
appropriées. La lyse de l’échantillon est réalisée par digestion enzymatique à l’aide du
tampon de lyse HM1 ou HMb et de la protéinase K. Pour la fixation des acides nucléiques
aux billes paramagnétiques, le tampon de fixation HM2 et les NucleoMag® B Beads
sont ajoutés au lysat clarifié. Après la séparation magnétique, les billes paramagnétiques
sont lavées pour éliminer les contaminants et les sels à l’aide des tampons de lavage
HM3, HM4 et de l’éthanol à 70 %. L’éthanol résiduel des étapes de lavage est éliminé
à l’aide du tampon de rinçage HM5. L’ADN hautement purifié est ensuite élué avec le
tampon d’élution HM6 et peut être utilisé directement pour des applications en aval. Le
kit NucleoMag® HMW DNA peut être utilisé de manière manuelle ou automatisée sur les
robots pipeteurs ainsi que la plupart des séparateurs magnétiques automatisés.
2.1.1 Caractéristiques du kit
Résumé des caractéristiques du kit
Paramètre
NucleoMag® HMW DNA
Technologie
Technologie des billes magnétiques
Format
Billes superparamagnétiques hautement réactives
Echantillons
Cellules, tissus et matériel végétal
Quantité
d’échantillons
(poids humide)
Cellules: jusqu’à 1 × 10⁶
Tissus: jusqu’à 20 mg
Plante: jusqu’à 50 mg
Bactéries: jusqu’à 25 mg (Gram négatives), jusqu’à 35 mg (Gram
positives)
Levure : jusqu’à 50 mg selon l’espèce
Rendement
Varie selon le type et la qualité de l’échantillon
Taille moyenne des
fragments
≥ 50 kb selon la qualité, la lyse et le traitement de l’échantillon
Volume d’élution
100 µL
Procédure
Manuelle ou automatisée
Temps de
préparation
Temps de préparation manuelle 1h pour 24 échantillons, 1,5h
pour 48 échantillons. Temps de préparation automatisée :
Environ 60 min sur un instrument à barreau magnétique
Utilisation
Uniquement pour la recherche
6
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
ADN de haut poids moléculaire
2.2
Généralités sur la manipulation de l’ADN de haut poids
moléculaire
L’ADN est facilement cisaillé et fragmenté par l’agitation mécanique. Manipuler l’ADN
extrait avec des cônes à embouts larges et éviter les forces de cisaillement comme le
mélange au vortex ou les pipetages répétés.
Les DNases sont éliminées lors de la préparation. Veiller à utiliser des tubes et des cônes
certifiés DNases-free.
En fonction de la procédure de lyse, l’ADN élué peut être endommagé, induisant une
longueur moyenne des reads plus faibles dans les réactions de séquençage de molécule
unique. L’utilisation d’un kit de réparation de l’ADN peut permettre de diminuer le nombre
de coupures et augmenter la longueur moyenne des reads. Consulter les informations du
fournisseur du séquenceur pour des informations quant aux kits recommandés.
L’ADN de très haut poids moléculaire va augmenter la viscosité des lysats provenant des
échantillons, en particulier lors de l’utilisation d’une lyse enzymatique qui permet d’obtenir
des molécules de très haut poids moléculaire. En combinaison avec une quantité
d’échantillon plus élevée, cette viscosité peut entraîner des difficultés lors de la remise en
suspension du culot de billes magnétiques. Ajouter du tampon HM1 supplémentaire si
des difficultés sont observées lors de la remise en suspension. Il est également possible
de réduire la quantité d’échantillon à 25 – 50 % de la quantité maximale, en particulier
lorsqu’on teste un échantillon pour la première fois.
2.3
Lyse des échantillons
2.3.1 Recommandations générales
La méthode de lyse cellulaire la plus douce et la plus recommandée est la lyse
enzymatique. Une incubation de l’échantillon dans le tampon de lyse HM1 avec de la
protéinase K entraîne la libération de l’ADN dans le mélange de lyse où l’ADN est stabilisé.
Indépendamment de la procédure d’homogénéisation et de lyse de l’échantillon choisie,
un temps d’incubation d’environ 30 minutes à 56 °C est suffisant pour la plupart des types
d’échantillons. Si nécessaire, le temps d’incubation peut être augmenté jusqu’à une
nuit sans effets négatifs sur l’intégrité et le poids moléculaire de l’ADN. Cela peut s’avérer
utile pour les plus gros blocs de tissus solides afin de garantir une lyse complète de
l’échantillon. Après la lyse complète, l’ARN résiduel est digéré par la RNase A.
En raison de l’hétérogénéité des échantillons, notamment en ce qui concerne les tissus
végétaux, deux systèmes de tampon de lyse sont inclus dans le kit. Le protocole standard
utilise le tampon de lyse HM1, basé sur la procédure CTAB déjà établie. De plus, le tampon
de lyse HMb à base de SDS est fourni, ce qui va nécessiter une précipitation ultérieure des
protéines à l’aide du tampon HMc.
Néanmoins, certains types d’échantillons nécessitent une enzyme lytique plus spécifique
(par exemple, le lysozyme pour les bactéries, la zymolyase pour les levures, non fournies
dans le kit). Les enzymes mentionnées ci-dessus seront actives dans le tampon de lyse
HM1, mais d’autres enzymes peuvent être inactivées. Lors de l’utilisation de ces dernières,
il est recommandé d’effectuer un test à petite échelle pour vérifier si l’enzyme est active
dans le tampon de lyse HM1, HMb ou si elle nécessite un tampon de réaction spécifique.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
7
ADN de haut poids moléculaire
En cas d’utilisation d’une enzyme lytique spécifique, utiliser le tampon de réaction
fourni ou recommandé par le fournisseur de l’enzyme et ajouter le tampon de lyse HM1 et
la protéinase K une fois la digestion enzymatique terminée.
Il convient de garder à l’esprit que des concentrations excessives de substrat (c’est-àdire trop d’échantillon) peuvent réduire la vitesse de la réaction enzymatique. Le rapport
optimal entre l’enzyme, le substrat (échantillon) et les cofacteurs nécessaires doit être
déterminé de manière empirique ou selon les instructions fournies par le fournisseur de
l’enzyme.
Veiller à ce que la surface de contact entre le tampon de réaction et l’échantillon soit aussi
élevée que possible et agiter le mélange réactionnel en continu si possible.
Les cellules constituées de parois épaisses, comme les cellules des feuilles de plantes, ne
peuvent être complètement lysées par voie enzymatique. Dans ce cas, il est recommandé
de broyer l’échantillon en présence d’azote liquide à l’aide d’un mortier et d’un pilon. Il
faut toujours utiliser du matériel préalablement refroidi et ne jamais laisser l’échantillon se
décongeler lors de la procédure. Le broyage de l’échantillon à l’aide d’un mortier et d’un
pilon en présence d’azote liquide entraîne une distribution de la longueur des fragments
en moyenne de 15 kb environ à 150 kb maximum.
Lors du broyage des bactéries à l’aide d’un mortier et d’un pilon en présence d’azote
liquide, il faut veiller à ne pas surcharger les billes magnétiques par la suite. Les cellules
intactes et une quantité excessive d’échantillon compliquent la remise en suspension
des billes magnétiques et peuvent entraîner des puretés et des rendements faibles. Il est
préférable de lyser les bactéries et les levures par voie enzymatique.
Le broyage avec des billes peut également être une option pour les cellules de bactéries
ou de levures. La longueur moyenne des fragments peut diminuer avec l’utilisation d’un
broyage mécanique des cellules jusqu’à environ 50 kb ou moins, mais le rendement total
augmente.
Les appareils à ultrasons ou à haute pression pour la lyse cellulaire entraîne également une
diminution de la longueur des fragments et ne sont donc pas recommandés.
2.3.2 Lyse de tissus et de cellules
Les cellules ou les tissus solides tels que les échantillons provenant de biopsie peuvent
être lysés directement dans le tampon de lyse HM1 sans broyage mécanique. Néanmoins,
l’échantillon solide doit être coupé en petits morceaux. Plus les morceaux de tissu sont
petits, plus la lyse cellulaire est rapide et moins l’influence des DNases et des radicaux
d’oxygène est importante.
2.3.3 Lyse d’échantillon de plante
Les cellules végétales (par exemple, les feuilles ou les racines) expriment une paroi
cellulaire épaisse qui peut être recouverte de cire ou de lignine. Si aucune enzyme lytique
spécialisée n’est disponible, il est recommandé de broyer les cellules à l’aide d’un mortier
et d’un pilon sous azote liquide.
Les plantes sont très hétérogènes et contiennent des quantités variables de polyphénols,
de composants acides ou de polysaccharides, ce qui peut entraîner une extraction d’ADN
8
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
ADN de haut poids moléculaire
ou des performances sous-optimales dans les applications en aval. C’est pourquoi deux
systèmes de tampons de lyse sont inclus dans ce kit. Le protocole standard utilise le
tampon de lyse HM1, basé sur la procédure CTAB déjà établie. En outre, le tampon de
lyse HMb à base de SDS, qui nécessite une précipitation ultérieure des protéines à l’aide
du tampon HMc, est fourni. Pour certaines espèces végétales, les tampons de lyse HM1
et HMb peuvent être utilisés avec des résultats similaires. Cependant, pour la plupart des
matériaux végétaux l’efficacité de la lyse est différente en raison de la charge négative du
SDS et de la charge positive du CTAB. De plus des agents réducteurs, tels que le TCEP,
peuvent être utilisés en complément du tampon HMb. Pour une grande variété d’espèces
végétales, le tampon de lyse HM1 donne de bons résultats.
2.3.4 Lyse d’échantillon liquide (p.e., échantillons de sang et de
salive)
Les échantillons liquides, tels que les échantillons de sang total (EDTA) ou de salive, peuvent
être directement soumis à une lyse enzymatique en combinaison avec les tampons de
lyse respectifs (par exemple HM1 pour la salive ou BQ1 pour les échantillons de sang
total (EDTA). Par conséquent, 200 µL d’échantillon de sang total EDTA sont combinés
avec 25 µL de protéinase K liquide et 200 µL de tampon de lyse BQ1 (REF 740923).
Le mélange est ensuite incubé pendant 10 min sous agitation modérée à température
ambiante. Procéder ensuite à l’étape 4 (digestion de l’ARN) du protocole détaillé au
paragraphe 5.2.
2.3.5 Lyse des bactéries
Les échantillons microbiens tels que les bactéries Gram positives et Gram négatives
peuvent être difficiles à lyser en raison de la solidité et de la complexité de leur paroi
cellulaire. Il est donc recommandé d’utiliser des enzymes spécifiques pour digérer ces
parois cellulaires. Les bactéries, en particulier les bactéries Gram positives, peuvent être
lysées par le lysozyme, qui n’est pas inclus dans le kit et doit être fourni par l’utilisateur.
Consulter le protocole fourni par le fabricant ou le vendeur de l’enzyme ou contacter
MACHEREY‑NAGEL (support@mn-net.com) en cas de doute sur l’utilisation d’enzymes
lytiques spécialisées.
Il est recommandé d’utiliser le lysozyme sous la forme d’une solution mère de 100 mg/ml.
Récolter les bactéries par centrifugation et remettre le culot en suspension (jusqu’à 25 mg
pour les bactéries Gram négatives, jusqu’à 35 mg pour les bactéries Gram positives) dans
600 µL de tampon de lyse HM1. Ajouter 25 µL de solution mère de lysozyme (100 mg/
ml), mélanger et incuber pendant au moins 30 à 60 min à 37 °C. Ajouter ensuite 25 µL de
protéinase K liquide et poursuivre l’incubation à 56 °C.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
9
ADN de haut poids moléculaire
2.3.6 Lyse des levures
Les échantillons de levures peuvent être difficiles à lyser en raison de la structure très
complexe et protéique de leurs parois cellulaires. Il est donc recommandé d’utiliser des
enzymes spécifiques pour digérer ces parois cellulaires. Les cellules de levure peuvent
être lysées par la zymolyase (lyticase), qui n’est pas incluse dans le kit et doit être
fournie par l’utilisateur. Consulter le protocole fourni par le fabricant ou le vendeur de
l’enzyme ou contacter MACHEREY‑NAGEL (support@mn-net.com) en cas de doute sur
l’utilisation d’enzymes lytiques spécialisées.
Il est recommandé d’utiliser la zymolyase sous la forme d’une solution mère de 100 mg/mL.
Récolter la levure par centrifugation et remettre le culot (jusqu’à 30 mg) en suspension
dans 600 µL de tampon de lyse HM1. Ajouter 10 µL de zymolyase (50 U), mélanger
et incuber pendant au moins 60 à 120 minutes à 37 °C, de préférence sous agitation
constante. Ajouter ensuite 25 µL de protéinase K liquide et poursuivre l’incubation à 56 °C.
2.3.7 Procédure de lyse alternative
En raison de la grande variété d’échantillons et d’espèces, qui entraînent des quantités
variables de polyphénols, de composants acides, de polysaccharides, d’acides gras ou
une composition variable des parois cellulaires, deux systèmes de tampons de lyse sont
inclus dans ce kit. Le protocole standard utilise le tampon de lyse HM1, basé sur la
procédure CTAB établie. De plus, le tampon de lyse HMb, basé sur le SDS, est fourni. Ce
tampon de lyse peut être combiné à une précipitation ultérieure des protéines à l’aide du
tampon HMc (recommandé pour le matériel végétal si l’on utilise le tampon HMb) ou peut
être utilisé seul comme tampon de lyse sans étape de précipitation (par exemple pour les
bactéries).
Le tampon HM1 dénature de nombreuses protéines et réduit la vitesse de réaction
jusqu’à l’inhibition complète. Néanmoins, la vitesse de réaction s’est avérée suffisamment
élevée pour la protéinase K, la RNase A, la zymolyase et le lysozyme dans le tampon
HM1. En cas d’utilisation d’une enzyme différente, toujours utiliser un tampon de réaction
recommandé pour cette enzyme. Se référer aux recommandations du fabricant ou à la
littérature pour la composition du tampon et les rapports nécessaires entre l’échantillon et
l’enzyme ainsi que les conditions d’incubation. Ne pas combiner d’autres enzymes avec
la protéinase K. Pour éviter la dénaturation ou la dégradation de ces enzymes par les
composants du tampon HM1 (détergents, protéinase K), il est recommandé d’effectuer
la lyse dans le tampon de réaction fourni ou recommandé par le fabricant avant l’ajout du
tampon HM1 et de la protéinase K. Ne pas dépasser un volume total de lyse de 600 µL.
10
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
ADN de haut poids moléculaire
2.4
Manipulation des billes magnétiques
Distribution des billes
Une distribution homogène des billes dans les puits de la plaque de séparation est
essentielle pour une bonne reproductibilité. Avant de distribuer les billes, veiller à bien les
resuspendre. Agiter le flacon ou placer le sur un vortex brièvement. Le mélange préliminaire
des billes magnétiques avec le tampon de fixation permet une distribution plus homogène
des billes dans les différents puits de la plaque de séparation. Lors de l’automatisation,
une étape de mélange des billes et du tampon de fixation dans les réservoirs avant leur
distribution dans les plaques de séparation est recommandée afin de s’assurer que les
billes demeurent bien en suspension.
Resuspension des billes
La remise en suspension des billes magnétiques à chaque étape est essentielle pour une
extraction fiable. La remise en suspension peut être réalisée en mélangeant avec la pipette
et des cônes à embout large ou à l’aide d’un dispositif d’agitation. L’efficacité de la remise
en suspension sur un dispositif d’agitation dépend de la vitesse et du diamètre orbital. Il
est recommandé d’utiliser un dispositif d’agitation avec un diamètre orbital d’au moins 2
à 3 mm (par exemple, Eppendorf Thermoshaker). La partie supérieure du NucleoMag®
SEP Mini peut être utilisée pour faciliter la remise en suspension des billes magnétiques.
Les parties supérieures de deux NucleoMag® SEP Mini peuvent être combinées, ce qui
permet d’obtenir une empreinte de plaque de microtitration qui s’adapte aux dispositifs
d’agitation de plaques courants. La rotation des tubes de 2 mL avec la partie supérieure
du NucleoMag® SEP Mini et l’agitation facilitent une remise en suspension douce des
billes.
Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques en combinaison avec une plaque à puits
profonds pour les étapes de fixation, de lavage et d’élution, les réglages de vitesse doivent
être soigneusement ajustés pour chaque plaque de séparation et chaque agitateur
spécifique afin d’éviter la contamination croisée d’un puits à l’autre.
2.5
Automatisation
Système automatisé de manipulation de liquide
Le kit NucleoMag® HMW DNA peut être automatisé sur diverses plateformes de
manipulation de liquides en utilisant des cônes de pipette à embouts larges et le
NucleoMag® SEP (MN REF : 744900) en combinaison avec le Square-well Block (MN
REF : 740481) et un dispositif d’agitation approprié pour une remise en suspension
optimale et douce pendant les étapes de fixation, de lavage et d’élution. En outre, un bras
«gripper» est nécessaire pour une utilisation entièrement automatisée sur les stations de
travail de manipulation des liquides. Le bras doit transférer la plaque vers le séparateur
magnétique pour la séparation des billes, puis vers le module d’agitation pour la remise
en suspension des billes. La remise en suspension complète des billes magnétiques
au cours de l’extraction est essentielle pour une performance fiable et doit être vérifiée
lors de la validation sur les systèmes de manipulation des liquides. Les billes peuvent
également être remises en suspension dans le tampon par un pipetage sucessif doux à
l’aide d’embouts larges.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
11
ADN de haut poids moléculaire
Systèmes à barreau magnétique
Le kit NucleoMag® HMW DNA peut être automatisé sur des systèmes à barreaux
magnétiques tels que l’IsoPure Mini, le MagnetaPure32+ ou le KingFisher® en utilisant
des consommables compatibles.
Afin de réduire l’impact des forces de cisaillement, des mouvements doux des tiges
magnétiques sont recommandés.
Veuillez contacter notre service d’assistance pour obtenir de l’aide concernant
l’automatisation de nos kits.
2.6
Procédure d’élution
L’ADN purifié peut être élué directement avec le tampon d’élution HM6 fourni (5 mM
Tris/HCl, pH 8,5). L’élution peut être effectuée dans un volume ≥ 100 µL. Il est essentiel
de recouvrir complètement les billes NucleoMag® B Beads avec le tampon d’élution
pendant l’étape d’élution. Le volume de tampon d’élution distribué dépend du système
de séparation magnétique (par exemple, la position du culot à l’intérieur de la plaque de
séparation). Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être complètement
remis en suspension dans le tampon d’élution. Pour certains séparateurs magnétiques,
des volumes d’élution plus importants peuvent être nécessaires pour couvrir la totalité
du culot. Une aspiration lente et douce est recommandée pour éviter que les billes ne
soient entraînées dans l’éluat final. En outre, une deuxième séparation magnétique est
recommandée pour réduire la présence des billes dans l’éluat.
12
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
ADN de haut poids moléculaire
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention : Les tampons HM3 et HM4 contiennent des sels chaotropiques ! Porter des
vêtements de protection, des gants et des lunettes !
•
Conserver le tampon HM2 à 4 °C dès son arrivée.
•
Tous les autres composants du kit NucleoMag® HMW DNA doivent être conservés
à température ambiante (15 – 25 °C) et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette de
l’emballage.
•
Une fois les enzymes ouvertes, il est recommandé de les conserver à 4 °C.
•
Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi.
Avant de commencer le protocole NucleoMag® HMW DNA, préparer les éléments
suivants :
Tampon de lyse HM1 / ​
HMb : Vérifier qu’il n’y ait pas de précipité de détergent, en
particulier après un stockage à des températures inférieures à 20 °C. Si nécessaire,
incuber les flacons pendant plusieurs minutes à 30 – 40 °C et bien mélanger jusqu’à ce
que le précipité soit complètement redissous.
RNase A : Avant la première utilisation, ajouter 1 mL d’eau à chaque flacon de RNase A
lyophilisée. Conserver la RNase A à 4 °C.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
13
ADN de haut poids moléculaire
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® HMW DNA, portez des vêtements de
protection appropriés (par exemple, une blouse de laboratoire, des gants jetables et des
lunettes de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de
sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds).
Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon HM3 et le perchlorate de sodium
dans le tampon HM4 peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont combinés
à de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides
directement aux déchets de préparation d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoMag® HMW DNA n’ont pas été testés pour la
présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par
du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse
fortement dénaturant et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement
exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et
doivent être manipulés et éliminés conformément aux réglementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
14
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
NucleoMag® HMW DNA
5
Protocole de purification de l’ADN de haut poids
moléculaire avec le tampon de lyse HM1
5.1
Résumé du protocole
Lire attentivement le protocole détaillé (paragraphe 5.2) ainsi que le paragraphe 2 avant
de commencer la procédure. Ce protocole est conçu pour des séparateurs magnétiques
avec des aimants statiques (par exemple, NucleoMag® SEP Mini). Il est recommandé
d’utiliser des microtubes de 2 mL au lieu de tubes de 1,5 mL. La purification de l’ADN
peut également être effectué dans une plaque à puits profonds avec des séparateurs
magnétiques appropriés (par exemple, Square-well Block et NucleoMag® SEP). Ce
protocole est conçu pour une utilisation manuelle.
Pour les exigences matérielles et les consommables supplémentaires, se référer au
paragraphe 1.2.
•
Avant de commencer la préparation :
•
Consulter les paragraphes 2.2 et 2.3 pour plus d’informations sur la quantité de
matériel de départ et la préparation de l’échantillon.
•
Vérifier si des cônes de pipette à embout large et des microtubes de 2 mL sont
utilisés.
•
Vérifier la présence de précipités dans le tampon de lyse HM1 conformément au
chapitre 3.
•
Vérifier si l’éthanol 70 % a été préparé conformément au paragraphe 1.2.
•
Prendre des précautions et porter l’équipement de protection nécessaire lorsque
vous travaillez avec de l’azote liquide.
1
Préparation
et lyse de
l’échantillon
Préparer l’échantillon
600 µL HM1
25 µL de Protéinase K Liquide
Mélanger par inversion ou par pipetage
56 °C, 30 – 150 min, agiter avec précaution (p.e. 900 rpm)
Note : consulter les paragraphes 5.2 et 2.3. pour des
recommandations alternatives concernant la lyse.
2
Précipitation
des débris
11,000 x g, 1 min
Transférer jusqu’à 500 µL dans un nouveau microtube 2 mL
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
15
NucleoMag® HMW DNA
3
Digestion des
ARN
20 µL de RNase
Mélanger par inversion ou par pipetage
15 min, TA
Centrifuger brièvement le tube de 2 mL pour éliminer les gouttes
du couvercle.
4
Fixation
de l’ADN
aux billes
NucleoMag®
B-Beads
25 µL NucleoMag® B-Beads
400 µL HM2
Mélanger par pipetages successifs
(Optionnel : mélanger par agitation pendant 5 min, 1000 rpm à
température ambiante)
Note : Une formation de phase peut se produire au cours
de cette étape. Selon le type d’échantillon, une remise en
suspension complète peut ne pas être possible.
Retirer le surnageant après 5 min de séparation
5
Lavage avec
le tampon
HM3
Retirer le microtube du NucleoMag® SEP Mini
900 µL HM3
Resuspendre: Mélanger par pipetages successifs (10 x)
(Optionnel : mélanger par agitation pendant 2 min, 1000 rpm à
TA)
Retirer le surnageant après 2 min de séparation
6
Lavage avec
le tampon
HM4
Retirer le microtube du NucleoMag® SEP Mini
900 µL HM4
Resuspendre: Mélanger par pipetages successifs (10 x)
(Optionnel : mélanger par agitation pendant 2 min, 1000 rpm à
TA)
Retirer le surnageant après 2 min de séparation
7
1er lavage
avec l’EtOH
70 %
Retirer le microtube du NucleoMag® SEP Mini
900 µL d’EtOH 70 %
Resuspendre: Mélanger par pipetages successifs (10 x)
(Optionnel : mélanger par agitation pendant 2 min, 1000 rpm à
TA)
16
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
NucleoMag® HMW DNA
Retirer le surnageant après 2 min de séparation
8
2ième lavage
avec l’EtOH
70 %
Retirer le microtube du NucleoMag® SEP Mini
900 µL d’EtOH 70 %
Resuspendre: Mélanger par pipetages successifs (10 x)
(Optionnel : mélanger par agitation pendant 2 min, 1000 rpm à
TA)
Retirer le surnageant après 2 min de séparation
Rinçage des
billes
Laisser le microtube sur le NucleoMag® SEP Mini
600 µL HM5
Incuber pour 30 – 60 sec
Note: Ne pas remettre en suspension les billes dans le tampon
HM5
Retirer le surnageant
9
Elution de
l’ADN
Retirer le microtube du NucleoMag® SEP Mini
100 µL HM6
Resuspendre: Mélanger par pipetages successifs (10 x)
(Optionnel : mélanger par agitation pendant 2 min, 1000 rpm à
TA)
Séparer 2 min et transférer l'ADN dans la plaque d'élution.
Optionnel : Effectuer une seconde séparation pour éliminer les
billes magnétiques résiduelles de l’éluat.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
17
NucleoMag® HMW DNA
5.2
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques dotés d’aimants statiques (par
exemple, NucleoMag® SEP Mini). Il est recommandé d’utiliser des microtubes de 2 mL
au lieu de tubes de 1,5 mL. La purification de l’ADN peut également être effectué dans
une plaque à puits profonds avec des séparateurs magnétiques appropriés (par exemple,
Square-well Block et NucleoMag® SEP). Ce protocole est conçu pour une utilisation
manuelle.
Pour les exigences matérielles et les consommables supplémentaires, se référer aux
paragraphes 1.2.
Avant de commencer la préparation :
•
Consulter les paragraphes 2.2 et 2.3 pour plus d’informations sur la quantité de
matériel de départ et la préparation du matériel d’échantillonnage.
•
Vérifier si des cônes de pipette à embout large et des microtubes de 2 mL sont
disponibles.
•
Vérifier la présence de précipités dans le tampon de lyse HM1 conformément au
paragraphe 3.
•
Vérifier si l’éthanol à 70 % a été préparé conformément au paragraphe 1.2.
•
Porter l’équipement de sécurité nécessaire pour travailler avec de l’azote liquide.
1
18
Préparation des échantillons
•
Cellules : Récolter jusqu’à 1 × 10⁶ cellules cultivées dans un tube de 2 mL
(non fourni).
•
Tissu solide : Couper le tissu solide en petits morceaux et transférer jusqu’à
20 mg dans un tube de 2 mL (non fourni).
•
Tissu végétal : Homogénéiser environ 20 à 50 mg de matériel végétal et les
transférer dans un tube de 2 mL.
•
Bactéries : Récolter jusqu’à 25 mg (poids humide) de bactéries Gram
négatives ou jusqu’à 35 mg (poids humide) de bactéries Gram positives
dans un tube de 2 mL.
•
Levures : Récolter jusqu’à 30 mg (poids humide) de cellules de levure dans
un tube de 2 mL.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
NucleoMag® HMW DNA
2
Lyse de l’échantillon
Ajouter 600 µL de tampon de lyse HM1 à l’échantillon dans le tube de 2 mL et
le remettre doucement en suspension si nécessaire.
Ajouter 25 µL de protéinase K liquide, mélanger par agitation douce ou par
inversion et incuber pendant 30 à 150 min à 56 °C. Suivre les recommandations
ci-dessous pour les différents types d’échantillons :
•
Cellules : 60 min
•
Tissu solide : 150 min
•
Tissu végétal : 30 min
•
Bacteries : Incuber pendant au moins 30 min avec 25 µL de lysozyme
(solution mère de 100 mg/ml) à 37 °C avant d’ajouter la protéinase K liquide.
Ajouter la protéinase K liquide et incuber pendant 30 min à 56 °C.
•
Levure : Incuber pendant au moins 60 min avec 10 µL de zymolyase (50 U)
à 37 °C avant d’ajouter la protéinase K liquide. Ajouter la protéinase K liquide
et incuber pendant 30 min à 56 °C.
Une agitation continue et modérée (p.e. 900 rpm) du lysat est souhaitable, mais
pas forcément nécessaire. Mélanger les lysats par inversion ou rotation lente de
temps en temps.
Note : Voir la paragraphe 2.2 pour plus d’informations sur la quantité de matériel
de départ et la procédure de lyse recommandée.
3
Précipitation des débris
Centrifuger pendant for 1 min at 11,000 x g.
Transférer avec précaution jusqu’à 500 µL dans un nouveau microtube de 2 mL
(non fourni).
Note : Transférer autant de lysat que possible dans le tube de 2 mL. Éviter de
transférer du matériel provenant du culot ou du matériel qui flotte à la surface du
lysat. Les fibres ou les enveloppes présentes dans le surnageant peuvent obstruer
l’embout de la pipette. Aspirer le surnageant lentement et avec précaution.
4
Digestion des ARN
Ajouter 20 µL de RNase A à chaque échantillon et mélanger en retournant le tube
plusieurs fois.
Incuber pendant 15 min à température ambiante.
Centrifuger brièvement le tube de 2 mL pour éliminer les gouttes des
couvercles (centrifugation courte uniquement).
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
19
NucleoMag® HMW DNA
5
Fixation de l’ADN sur les billes NucleoMag® B Beads
Ajouter 25 µL de billes NucleoMag® B-Beads et 400 µL de tampon de fixation
HM2. Mélanger par pipetages successifs 10 fois à l’aide de cônes de pipettes à
embout large et incuber pendant 5 min à température ambiante.
Note : Remettre en suspension les billes NucleoMag® B-Beads avant de les
utiliser. Vortexer le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une suspension homogène
soit formée.
Note : La viscosité élevée du tampon HM2 peut entraîner la formation d’une
phase. En fonction du type et de la quantité d’échantillon, une remise en
suspension complète des billes peut ne pas être possible pendant toute la durée
de l’incubation.
Pipeter doucement afin d’éviter la formation de mousse. En cas d’utilisation de
pipettes électroniques, n’utiliser que 40 % du volume total comme volume de
mélange.
Alternativement, remettre en suspension les billes en agitant pendant 5 min à
1000 rpm en utilisant les deux parties supérieures du NucleoMag® SEP Mini (voir
paragraphe 2.4).
Note : consulter le paragraphe 2.4 pour les recommandations concernant la
remise en suspension des billes.
Placer les tubes de 2 mL dans le séparateur magnétique NucleoMag® SEP Mini ou
déplacer la partie supérieure du NucleoMag® SEP Mini contenant les échantillons
de l’agitateur sur la base du séparateur.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi du tube en plaçant le tube de 2 mL
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP Mini. Attendre au moins 5 min
jusqu’à ce que toutes les billes soient attirées par les aimants. Retirer et jeter le
surnageant à l’aide d’une pipette.
Note : Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’aspiration du surnageant.
Les billes sur l’aimant ne sont parfois pas visibles à cette étape. Prélever le
surnageant du côté opposé du tube.
20
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
NucleoMag® HMW DNA
6
Lavage avec le tampon HM3
Retirer la partie supérieure du NucleoMag® SEP de la base du support magnétique.
Ajouter 900 µL de tampon HM3 directement sur le culot de billes magnétiques
et remettre les billes en suspension par pipetage répété 10 fois à l’aide de cônes
de pipettes à embout large.
Il est également possible de remettre les billes en suspension par agitation
pendant 2 min à 1000 rpm.
Séparer les billes magnétiques en plaçant la partie supérieure sur la base du
support NucleoMag® SEP Mini. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes
les billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
7
Lavage avec le tampon HM4
Retirer la partie supérieure du NucleoMag® SEP Mini de la base du support
magnétique.
Ajouter 900 µL de tampon HM4 directement sur le culot de billes magnétiques
et remettre les billes en suspension par pipetages successifs 10 fois à l’aide de
cônes de pipette à embout large.
Il est également possible de remettre les billes en suspension en les agitant
pendant 2 min à 1000 rpm.
Séparer les billes magnétiques en plaçant la partie supérieure sur la base du
support NucleoMag® SEP Mini. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes
les billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
8
1er lavage avec de l’éthanol à 70 %
Retirer la partie supérieure du NucleoMag® SEP Mini de la base du support
magnétique.
Ajouter 900 µL de tampon à 70 % d’éthanol directement sur le culot de billes
magnétiques et remettre les billes en suspension par pipetages successifs 10 fois
à l’aide de cônes de pipette à embout large.
Il est également possible de remettre les billes en suspension en les agitant
pendant 2 min à 1000 rpm.
Séparer les billes magnétiques en plaçant la partie supérieure sur la base du
support NucleoMag® SEP Mini. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes
les billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
21
NucleoMag® HMW DNA
9
2ème lavage avec de l’éthanol à 70 %
Retirer la partie supérieure du NucleoMag® SEP Mini de la base du support
magnetique.
Ajouter 900 µL de tampon à 70 % d’éthanol directement sur le culot de billes
magnétiques et remettre les billes en suspension par pipetage répété 10 fois à
l’aide de cônes de pipette à embout large.
Il est également possible de remettre les billes en suspension en les agitant
pendant 2 min à 1000 rpm.
Séparer les billes magnétiques en plaçant la partie supérieure sur la base du
support magnétique NucleoMag® SEP Mini. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce
que toutes les billes soient attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à
l’aide d’une pipette.
Note : Retirer tout le surnageant. Utiliser un cône de pipette de faible volume pour
éliminer les traces d’éthanol à 70 %.
10
Rincer les billes magnétiques
Laisser la partie supérieure du NucleoMag® SEP Mini sur la base du support
magnétique.
Ajouter délicatement 600 µL de HM5 sur la paroi opposée du culot de billes
magnétiques et incuber pendant 45 à 60 s tout en laissant les billes sur l'aimant.
Aspirer et jeter le surnageant.
Note : Ne pas remettre les billes en suspension dans le tampon HM5.
Il est également possible de sécher les billes magnétiques à l’air (avec le
bouchon du tube ouvert) pendant 10 à 15 min à température ambiante.
11
Élution de l’ADN
Retirer la partie supérieure du NucleoMag® SEP Mini de la base du support
magnétique.
Ajouter le volume désiré de tampon d’élution HM6 (100 – 200 µL) directement
sur le culot de billes magnétiques et remettre les billes en suspension par
pipetages successifs 10 fois à l’aide de cônes de pipettes à embouts large et
incuber pendant 5 – 10 min à température ambiante.
Il est également possible de remettre les billes en suspension par agitation
pendant 5 min à 1000 rpm.
Séparer les billes magnétiques en plaçant la partie supérieure sur la base du
support magnétique NucleoMag® SEP Mini. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce
que toutes les billes soient attirées par l’aimant. Transférer le surnageant contenant
l’ADN purifié dans un nouveau tube.
22
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
NucleoMag® HMW DNA
6
Protocole support pour la lyse d’échantillons
avec les tampons HMb et HMc
6.1
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour une procédure de lyse alternative utilisant les tampons de
lyse HMb et HMc. Pour plus d’informations, se référer au paragraphe 2.3.
•
Consulter les paragraphes 2.2 et 2.3 pour plus d’informations sur la quantité de
matériel de départ et la préparation des échantillons.
•
Vérifier la présence de précipités dans le tampon de lyse HMb conformément au
chapitre 3.
1
Préparation de l’échantillon
Préparer l’échantillon conformément à l’étape 1 du protocole détaillé au paragraphe
5.2.
Ajouter 480 µL de tampon de lyse HMb à l’échantillon dans un tube de 2 mL et
remettre doucement en suspension l’échantillon si nécessaire.
Ajouter 25 µL de protéinase K liquide, mélanger par agitation douce ou par inversion
et incuber pendant 30 à 150 min à 56 °C.
Tissu végétal : 30 min
Bactéries : Incuber pendant au moins 30 min avec 25 µL de lysozyme (solution
mère de 100 mg/ml) à 37 °C avant d’ajouter la protéinase K liquide. Ajouter la
protéinase K liquide et incuber pendant 30 min à 56 °C.
Levures : Incuber pendant au moins 60 min avec 10 µL de zymolyase (50 U) à
37 °C avant d’ajouter la protéinase K liquide. Ajouter la protéinase K liquide et
incuber pendant 30 min à 56 °C.
Une agitation continue et modérée (par exemple à 900 rpm) du lysat est souhaitable,
mais pas forcément nécessaire. Mélanger les lysats par inversion ou rotation lente
de temps en temps.
Note : Voir le paragraphe 2.2 pour plus d’informations sur la quantité de matériel de
départ et la procédure de lyse recommandée.
2
Précipitation des contaminants
Ajouter 120 µL de tampon HMc à chaque échantillon, mélanger en retournant les
tubes 3 fois ou agiter pendant 5 min à température ambiante.
Incuber pendant 5 min à 2 – 8 °C (de préférence sur de la glace).
Note : L’omission de l’étape de précipitation peut être bénéfique pour certains
types d’échantillons, tels que les bactéries Gram positives. Dans ce cas, procéder
à l’étape de centrifugation afin d’éliminer les débris résiduels.
Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
23
NucleoMag® HMW DNA
3
Transfert du lysat
Transférer jusqu’à 500 µL de lysat dans un nouveau tube et passer à l’étape 3
du protocole détaillé au paragraphe 5.2.
Note : Éviter de transférer du matériel provenant du culot ou du matériel qui flotte
à la surface du lysat. Les fibres ou les enveloppes présentes dans le surnageant
peuvent obstruer l’embout de la pipette. Aspirer le surnageant lentement et avec
précaution.
4
Passer à l’étape 4 (digestion de l’ARN) du protocole détaillé au paragraphe 5.2
24
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
ADN de haut poids moléculaire
7
Annexes
7.1
Guide de résolution des problèmes
Problèmes
Causes possible and suggestions
Libération insuffisante des acides nucléiques pendant la lyse
•
Pour obtenir des rendements plus élevés d’acides
nucléiques, prolonger le temps d’incubation de la lyse à la
protéinase K (jusqu’à une nuit entière).
Précipités dans le tampon HM1 ou HMb
•
Vérifier l’absence de précipités dans les tampons HM1 ou
HMb avant utilisation. Incuber les flacons pendant plusieurs
minutes à 30 – 40 °C et bien mélanger jusqu’à ce que le
précipité soit complètement redissous.
L’échantillon contient trop d’ARN
Rendement faible
en ADN
•
Prolonger la digestion à la RNase jusqu’à 30 min et incuber
à 37 °C. En cas d’échec, augmenter la quantité de RNase.
•
Volume de tampon d’élution insuffisant
•
Les billes doivent être totalement recouvertes par le tampon
d’élution. Utiliser au moins 100 µL de tampon d’élution.
Performance insuffisante du tampon d’élution
•
Les tampons doivent être éliminés totalement après chaque
séparation magnétique. Les tampons résiduels diminuent
l’efficacité des lavages et de l’élution.
Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant
•
Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’aspiration du
surnageant, en particulier lorsque le culot de billes n’est pas
visible dans le lysat.
Aspiration et perte de billes
•
Le temps de séparation magnétique est trop court ou la
vitesse d’aspiration est trop élevée.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
25
ADN de haut poids moléculaire
Problèmes
Causes possible and suggestions
Procédure de lavage insuffisante
Faible pureté / ​
Performance
suboptimale de
l’ADN dans les
applications avales
•
Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de
séparateur et de tube, par exemple un microtube de 2 mL
en combinaison avec le NucleoMag® SEP Mini.
•
S’assurer que les billes sont remises en suspension de
façon presque complète pendant la procédure de lavage.
Contamination par de l’éthanol des tampons de lavage
•
Veiller à éliminer l’éthanol provenant des étapes de lavage,
l’éthanol résiduel impactant négativement les applications
avales.
Évaporation de l’éthanol des tampons de lavage
•
Fermer hermétiquement les flacons de tampons, éviter
l’évaporation de l’éthanol des flacons de tampons ainsi que
des tampons remplis dans les réservoirs. Ne pas réutiliser
les tampons des réservoirs.
Stockage des échantillons
Faible intégrité de
l’ADN
•
Utiliser des échantillons aussi frais que possible. Congeler
dans l’azote liquide et conserver la congélation en
permanence si l’acquisition et la préparation de l’échantillon
ne peuvent être effectuées en temps voulu.
•
Ne pas laisser décongeler les échantillons congelés. Utiliser
du matériel pré-réfrigéré pour peser l’échantillon.
•
Ajouter le tampon HM1 et la protéinase K liquide le plus
rapidement possible à l’échantillon.
•
Utiliser toujours du matériel tel que des cônes de pipette et
des microtubes à centrifuger certifiés DNase-free.
•
En cas d’utilisation d’un tampon de remise en suspension
fourni par le client, prendre les mesures appropriées pour
éviter l’introduction de DNases.
Pipetage excessif
•
26
Éviter les étapes de pipetage excessives et brutales. Utiliser
des cônes de pipette à embout large.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
ADN de haut poids moléculaire
Problèmes
Causes possible and suggestions
Temps de séparation magnétique trop court
•
Augmenter le temps de séparation pour permettre aux billes
d’être complètement attirées par les aimants avant d’aspirer
le liquide du puits.
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
Perte de billes
•
Une vitesse d’aspiration élevée au cours de l’étape d’élution
peut entraîner une perte des billes. Réduire la vitesse
d’aspiration pour l’étape d’élution.
Viscosité élevée de l’éluat
•
L’ADN de haut poids moléculaire augmente la viscosité des
solutions, ce qui accroît le risque de contamination par des
billes. Répéter la séparation magnétique après la première
étape d’élution et transférer l’éluat dans un nouveau tube.
Tampon de réaction inapproprié
•
Utiliser uniquement le tampon de réaction recommandé
par le fournisseur de l’enzyme. Ne pas effectuer de
digestion enzymatique dans le tampon de lyse HM1 car
les composants du tampon interfèrent avec l’activité
enzymatique.
La paroi cellulaire n’est pas sensible à l’enzyme sélectionnée
•
Vérifier que l’organisme qui vous intéresse peut être lysé
efficacement avec l’enzyme que vous utilisez.
Enzyme inactive
Lyse enzymatique
inefficace des
échantillons
microbiens
•
Vérifier que l’enzyme n’est pas périmée et qu’elle a été
conservée conformément aux recommandations du
fournisseur.
Protocole de digestion enzymatique inapproprié
•
Utiliser le protocole suggéré par le fournisseur de l’enzyme.
Trop de matériel de départ
•
La vitesse de réaction des enzymes dépend de la
concentration en substrat. Si la concentration en substrat
est trop élevée (trop d’échantillon), la vitesse de réaction
diminue.
•
L’ADN de haut poids moléculaire libéré contribue à la
viscosité de l’échantillon. Si la viscosité de l’échantillon est
trop élevée, l’efficacité de la lyse diminue car la distribution
des enzymes ne sera pas homogène.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
27
ADN de haut poids moléculaire
7.2
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
®
NucleoMag HMW DNA
744160.1
1 × 96 preps
NucleoMag® SEP Mini
744901
1
®
NucleoMag SEP
744900
1
Blocs 96 puits carrés ’Square-well Blocks’
740481
740481.24
4
24
Tampon BQ1
740923
125 mL
Visitez notre site web www.mn‑net.com pour des informations détaillées.
28
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
ADN de haut poids moléculaire
7.3
Restrictions d’utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils
sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description
de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits
MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode
d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du
produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications
et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du
produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et
descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants
de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par
un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et
elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente
de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la
société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent,
veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus
récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre
revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les
descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre
d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
Veuillez contacter :
MACHEREYNAGEL ‑GmbH & Co. KG
+49 24 21 969-333
support@mnnet.com
Marques déposées :
NucleoMag® sont des marques déposées de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG
KingFisher® est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux
marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
MACHEREY-NAGEL – 02/2024, Rev. 01
29
www.mn‑net.com
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
DE +49 24 21 969-0 info@mn-net.com
CH +41 62 388 55 00 sales-ch@mn-net.com
FR +33 388 68 22 68 sales-fr@mn-net.com
US +1 888 321 62 24 sales-us@mn-net.com
">