Macherey-Nagel NucleoMag kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Bioanalysis
Biologie
Moléculaire
User manual
Manuel
d’utilisation
Purification et sélection de taille NGS
n NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
Février 2023 / ​Rev. 07
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NGS clean up and size selection
Sommaire
1 Composition du kit
4
1.1 Composants
4
1.2 Consommables et équipement nécessaires
4
1.3 A propos de ce manuel
4
2 Description
5
2.1 Principe général
5
2.2 Caractéristiques du kit
5
2.3 Systèmes de séparation magnétiques
5
2.4 Manipulation des billes
6
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
7
4 Instructions de sécurité
7
5 Protocoles
8
5.1 Protocole de purification et sélection unique de taille d’ADN
8
5.2 Protocole pour éliminer les dimères d’adaptateur
12
5.3 Protocole de sélection double de taille d’ADN
13
5.4 Protocole de purification des produits PCR
18
6 Annexes
22
6.1 Guide de résolution des problèmes
22
6.2 Informations de commande
23
6.3 Restriction d’utilisation / garantie
24
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
3
NGS clean up and size selection
1
Composition du kit
1.1
Composants
NucleoMag® NGS Clean‑up and Size Select
50 – 100 preps*
744970.5
250 – 500 preps*
744970.50
2500 – 5000 preps*
744970.500
Suspension de billes
NucleoMag® NGS
Bead
5 mL
50 mL
500 mL
Manuel d’utilisation
1
1
1
REF
* Note : Le nombre de purification est calculé en fonction d’un volume d’échantillon de
50 – 100 µL et d’un ratio (suspension de billes / ​échantillon) de 1.0.
1.2
Consommables et équipement nécessaires
Réactifs :
•
Ethanol 80 % (non-dénaturé)
•
Tampon d’élution (10 mM Tris-HCl (pH 8) ou de l’eau)
Consommables :
•
Cônes jetables
Equipement :
•
Pipettes manuelles bien calibrées
•
Vortex
•
Système de séparation de billes magnétiques
par exemple, NucleoMag® SEP (REF 744900, voir paragraphe 2.3)
•
Plaque de séparation pour la séparation des billes magnétiques,
par exemple, microplaque de 96 puits de 0,3 mL (Elution Plate U-bottom ;
REF 740486.24)
•
Film adhésif pour plaque,
par exemple, feuille PE auto-adhésive (REF 740676)
1.3
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé aux personnes qui utilisent pour la première fois le kit NucleoMag®
NGS Clean-up and Size Select de lire le protocole détaillé du manuel d’utilisation. Les utilisateurs
expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Ce dernier est conçu pour
un suivi rapide des différentes étapes de la procédure.
Toute la documentation technique est disponible sur le site www.mn-net.com.
Merci de contacter notre service technique pour obtenir les éventuelles modifications apportées
à la version actuel du manuel par rapport aux précédentes révisions.
4
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
NGS clean up and size selection
2
Description
2.1
Principe général
Le NucleoMag® NGS Clean up and Size Select est conçu pour la purification rapide et la
sélection de taille des fragments d’ADN dans le processus de construction de librairies pour
le séquençage de nouvelle génération (NGS). La suspension de billes NucleoMag® NGS
contient des billes paramagnétiques en suspension dans un tampon de fixation spécial. Les
billes paramagnétiques lient sélectivement les fragments d’ADN en fonction du ratio de volume
entre la suspension de billes et l’échantillon. Après la séparation magnétique et l’élimination du
surnageant, les billes sont lavées à l’éthanol. Une courte étape de séchage est nécessaire pour
éliminer l’éthanol des étapes de lavage précédentes. Enfin, les fragments d’ADN hautement
purifiés sont élués avec un tampon d’élution à faible teneur en sel ou avec de l’eau et peuvent
ensuite être utilisée directement pour des applications en aval. La librairie de fragments d’ADN
purifiée est exempte de tout contaminant, comme les nucléotides, les amorces, les adaptateurs,
les dimères d’adaptateur, les enzymes, les additifs de tampon et les sels. Le kit NucleoMag®
NGS Clean up and Size Select peut être utilisé manuellement ou de manière automatisée sur
la plupart des robots pipeteurs ou séparateurs de billes magnétiques automatisés.
2.2
Caractéristiques du kit
NucleoMag® NGS Clean‑up and Size Select est conçu pour la purification rapide, manuelle
et automatisée ainsi que pour la sélection de taille des fragments d’ADN à partir d’une variété
de mélanges réactionnels utilisés dans le processus de construction de librairies pour le
séquençage de nouvelle génération, tels que
•
Mélange de fragmentation
•
Mélange issu de la réparation de l’ADN
•
Mélange suite à la polyadénylation
•
Mélange de ligations d’adaptateur
•
Mélange d’amplifications PCR
La quantité d’échantillon typique de fragments d’ADN double brin est comprise entre 5 ng et
1 µg.
En utilisant la méthode de sélection de taille, il est possible d’obtenir des librairies de fragments
d’ADN d’une taille comprise entre 150 pb et 800 pb.
Pour garantir un pipetage précis, le volume de l’échantillon doit être ≥ 50 µL.
Le protocole NucleoMag® NGS Clean up and Size Select peut être entièrement utilisé à
température ambiante.
Réservé pour la recherche uniquement.
2.3
Systèmes de séparation magnétiques
Pour utiliser le kit NucleoMag® NGS Clean‑up and Size Select, le séparateur NucleoMag®
SEP (voir les informations de commande) est recommandé. La séparation est effectuée en
microplaque de 96 puits à fond en U de 300 µL. Le kit peut également être utilisé avec d’autres
systèmes de séparation courants.
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
5
NGS clean up and size selection
2.4
Manipulation des billes
Distribution de la suspension
Un pipetage précis de la suspension de billes NucleoMag® NGS Bead et de l’échantillon est
essentiel pour obtenir des résultats fiables. Les variations de volume affectent la performance
de la sélection de taille. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser des pipettes bien
calibrées et de nouvelles pointes après chaque puits (canal unique) ou chaque colonne (pipette
multicanaux). Une bonne technique pour pipeter la suspension de billes légèrement visqueuse
consiste à pipeter très lentement. Aspirer lentement et s’assurer qu’il n’y a pas de gouttelettes
de liquide à l’extérieur de l’embout et ne pas aspirer d’air. Distribuer lentement pour s’assurer
que la suspension de billes est complètement transférée dans les puits.
Une distribution homogène des billes magnétiques dans les différents puits de la plaque
de séparation est essentielle pour assurer une grande cohérence d’un puits à l’autre. Par
conséquent, avant de distribuer les billes, s’assurer qu’elles sont complètement remises en
suspension. Bien agiter le flacon de stockage ou le placer brièvement sur un vortex.
Temps de séparation magnétique
La capture des billes magnétiques sur les aimants dépend de la force magnétique des aimants,
de la plaque de séparation choisie, de la distance entre la plaque de séparation et les aimants
et du volume à traiter. Les temps individuels pour la capture complète des billes sur les barres
aimantées doivent être vérifiés et ajustés pour chaque système. Il est recommandé d’utiliser
les plaques ou les tubes de séparation spécifiés par le fournisseur du séparateur magnétique.
Ratio de volume
Les billes paramagnétiques NucleoMag® NGS lient sélectivement les fragments d’ADN
en fonction du ratio de volume de la suspension de billes et de l’échantillon. En général,
l’augmentation du ratio de volume favorise l’adsorption de fragments plus courts sur les billes
paramagnétiques. Ce manuel d’utilisation présente les protocoles les plus couramment utilisés
pour des profils de tailles distincts qui sont optimaux pour les applications NGS utilisant les
systèmes de séquençage Illumina. En modifiant le ratio de volume, il est possible de produire
des librairies de fragments d’ADN d’une taille comprise entre 150 pb et 800 pb pour n’importe
quelle plateforme de séquençage. La suspension de billes NucleoMag® NGS est similaire à
d’autres produits bien connus sur le marché. Vous pouvez donc utiliser les mêmes ratios de
volume que ceux recommandés dans votre protocole de préparation de kit de librairie NGS.
6
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
NGS clean up and size selection
A
B
Recouvrement des fragments d’ADN [%]
Size (bp) 0.5 : 1 0.55 : 1 0.6 : 1 0.65 : 1 0.7 : 1 0.75 : 1 0.8 : 1 0.85 : 1 0.9 : 1 0.95 : 1
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
150
0
0
0
0
0
0
3
5
6
8
200
0
0
0
2
3
6
9
20
32
42
250
0
1
2
4
8
21
31
54
77
86
300
0
0
3
10
21
53
66
82
95
97
400
0
5
14
49
75
95
93
94
99
99
500
3
20
48
90
109
103
98
99
103
102
600
7
45
81
96
96
99
93
96
98
98
700
18
70
92
95
95
97
91
93
96
96
800
40
81
93
94
94
95
89
91
95
94
900
64
84
93
94
95
96
89
91
95
95
1000
80
83
91
93
94
95
88
90
94
94
1:1
0
13
59
91
95
95
98
94
92
91
90
89
Cut-off côté gauche
Cut-off côté droit
300
250
200
Région des
tailles ciblées
150
100
50
0
35
100
200
300
400 500
700
2000
10380
Procédure NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select. (A) Purification de fragments de différentes tailles. Pour
la sélection de taille de l’ADN, 100 µL d’ADN (10 ng/µL) ont été ajoutés à différents volumes de billes du NucleoMag®
NGS Clean-up and Size Select afin d’obtenir les ratios indiqués (ratio = suspension de billes/échantillon). L’ADN utilisé
est constitué de fragments de taille compris entre 100 pb et 1000 pb. Les différentes purifications avec les ratios
appliqués (billes/ADN utilisé) sont indiquées en pourcentage [ %]. (B) Sélection de la taille du mélange de fragments.
Pour la sélection de taille d’un seul côté (gauche ou droite), l’échantillon est mélangé avec les billes selon un ratio afin
d’exclure les fragments plus grands ou plus petits en fonction du seuil choisi. Pour la sélection double de taille, deux
étapes de fixation sont effectuées, afin d’exclure les fragments plus grands au-dessus du seuil et les fragments plus
petits en dessous du seuil inférieur.
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
•
Le kit NucleoMag® NGS Clean up and Size Select est expédié à température ambiante.
La suspension de billes doit être stockée à 2 – 8 °C dès son arrivée et elle est stable dans
des conditions de stockage appropriées jusqu’à : voir l’étiquette de l’emballage.
•
La suspension de billes NucleoMag® NGS Bead est livrée prête à l’emploi.
4
Instructions de sécurité
Le kit NucleoMag® NGS Clean‑up and Size Select ne contient pas de substances
dangereuses.
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
7
NGS clean up and size selection
5
Protocoles
5.1
Protocole de purification et sélection unique de taille
d’ADN
Résumé de protocole
•
Pour les équipements supplémentaires et le matériel requis, voir les paragraphes 1.2 et
2.3, respectivement.
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 10.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Retirer la suspension NucleoMag® NGS Bead du réfrigérateur. Laisser reposer pendant
environ 30 minutes pour que la suspension de billes atteigne la température ambiante.
Fixer l’ADN cibles aux
billes NucleoMag® NGS
Bead
Mélanger jusqu’à obtenir une
suspension homogène
100 µL NucleoMag® NGS Bead
100 µL d’échantillon d’ADN
Mélanger par pipetages
successifs
Incuber pendant 5 min
Eliminer le surnageant après
5 min de séparation
2
1er lavage avec de
l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96-puits
sur le NucleoMag® SEP
200 µL d’éthanol 80 %
Incuber 30 s
Eliminer le surnageant avec
précaution
3
2ième lavage avec de
l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96-puits
sur le NucleoMag® SEP
200 µL d’éthanol 80 %
Incuber 30 s
Eliminer le surnageant avec
précaution
8
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
NGS clean up and size selection
4
Sécher les billes
5
Eluer l’ADN
5 – 15 min à TA
Retirer la plaque 96-puits
sur le NucleoMag® SEP
10 – 50 µL de tampon d’élution
Mélanger par pipetages
successifs
Incuber 2 – 5 min
Séparer pendant 5 min et
transférer les ADN dans une
nouvelle plaque 96-puits
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
9
NGS clean up and size selection
Protocole détaillé
Ce protocole peut être utilisé pour éliminer les contaminants (tels que les nucléotides, les
amorces, les adaptateurs, les enzymes, les additifs de tampon, les sels) et les petits fragments
d’ADN d’un échantillon. La méthode utilise une étape de sélection unique de taille (également
appelée sélection du côté gauche) : après avoir ajouté le volume approprié de suspension de
billes NucleoMag® NGS à l’échantillon d’ADN, les billes lient les fragments plus grands. Le
surnageant contient des fragments plus petits et des contaminants qui sont éliminés. Pour
la plupart des applications de séquençage NGS, il est optimal d’éliminer tous les fragments
inférieurs à 150 – 200 pb. Ceci peut être réalisé en utilisant un ratio de volume (suspension de
billes/échantillon) de 1,0, qui est décrit dans le protocole suivant (par exemple, ajouter 100 µL
de suspension de billes à 100 µL d’échantillon). Pour garantir un pipetage précis, le volume de
l’échantillon doit être ≥ 50 µL. Cependant, le ratio de volume peut être modifié pour s’adapter
à l’application spéciale du processus de construction de la librairie (voir paragraphe 2.4, page
6).
Avant de débuter la procédure :
•
1
Retirer la suspension NucleoMag® NGS Bead du réfrigérateur. Laisser reposer pendant
environ 30 minutes pour que la suspension de billes atteigne la température ambiante.
Fixer les ADN cibles aux billes NucleoMag® NGS Bead
Vortexer la suspension de billes NucleoMag® NGS Bead jusqu’à l’obtention d’une
couleur homogène. Ajouter 100 µL de la suspension de billes bien mélangée dans
chaque puits de la plaque de séparation.
Ajouter 100 µL d’échantillon d’ADN (le ratio de volume entre la suspension de billes
et l’échantillon est de 1,0). Ajuster la pipette à 200 µL et mélanger par une dizaine de
pipetages successifs.
Incuber la plaque de séparation à température ambiante pendant 5 minutes.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant la plaque 96 puits
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 5 minutes jusqu’à
ce que toutes les billes aient été capturées par les aimants ou jusqu’à ce que le liquide
soit clair.
Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
Le surnageant contient des contaminants indésirables de faible poids moléculaire et des
fragments d’ADN plus petits indésirables.
Note : ne pas perturber les billes capturées lors de l’aspiration du surnageant. Prélever
le surnageant du côté opposé du puits.
2
1er lavage avec de l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96 puits sur le séparateur magnétique pendant l’étape de lavage.
Ajouter 200 µL d’éthanol 80 % sans perturber le culot de billes. Incuber la plaque
de séparation à température ambiante pendant au moins 30 secondes. Retirer
soigneusement le surnageant en le pipetant.
10
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
NGS clean up and size selection
3
2ième lavage avec de l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96 puits sur le séparateur magnétique pendant l’étape de lavage.
Ajouter 200 µL d’éthanol 80 % sans perturber le culot de billes. Incuber la plaque
de séparation à température ambiante pendant au moins 30 secondes. Retirer
soigneusement le surnageant en le pipetant.
Note : éliminer complètement le surnageant, y compris les gouttelettes résiduelles.
4
Sécher les billes
Laisser la plaque 96 puits sur le séparateur magnétique et incuber à température
ambiante pendant 5 à 15 minutes afin de permettre l’évaporation des traces d’alcool
restantes.
Note : Laisser le culot sécher suffisamment pour qu’il n’y ait plus de gouttelettes visibles
du surnageant au fond des puits. Ne pas trop sécher les billes. Le rendement peut
diminuer car les fragments d’ADN plus longs élueront plus lentement.
5
Eluer les fragments d’ADN de la librairie
Retirer la plaque 96 puits du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 10 à 50 µL de tampon d’élution et remettre le culot de billes en suspension
par une dizaine de pipetages successifs ou en agitant (par exemple, à 1100 rpm à l’aide
d’un Thermomixer® eppendorf).
Incuber la plaque de séparation à température ambiante pendant 2 à 5 minutes.
Note : 10mM de Tris-HCl (pH 8), de l’eau ou un tampon d’élution MN (par exemple, le
tampon BE, voir les informations relatives à la commande) peuvent être utilisés comme
tampon d’élution.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant la plaque 96 puits
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 5 minutes jusqu’à
ce que toutes les billes aient été capturées par les aimants ou jusqu’à ce que le liquide
soit clair.
Transférer le surnageant contenant la librairie de fragments d’ADN purifiée dans une
nouvelle plaque 96 puits. Passer à l’étape suivante du processus de préparation de la
librairie.
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
11
NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
5.2
Protocole pour éliminer les dimères d’adaptateur
Ce protocole peut être utilisé pour éliminer les dimères d’adaptateur après une réaction
permettant d’ajouter des adaptateurs aux fragments d’ADN.
La méthode utilise deux étapes de purification successives conformément au protocole 5.1.
Dans la première étape, un ratio (suspension de billes/échantillon) de 1,0 est utilisé pour
éliminer les agents précipitants de l’ADN du tampon réactionnel de ligation qui interfèrent avec
le processus de sélection de taille. L’étape suivante élimine les dimères d’adaptateur en utilisant
la même procédure mais avec un ratio de 0,8.
1
Remplacer le tampon réactionnel de ligation
Effectuer la procédure de purification décrite au point 5.1 avec un ratio de 1,0 et éluer
dans 50 µL.
2
Supprimer des dimères d’adaptateur
Effectuer la procédure de purification comme décrit au point 5.1, mais avec un ratio de
0,8 (à 50 µL d’éluat de l’étape 1, ajouter 40 µL de suspension de billes NucleoMag®
NGS). Éluer dans 30 µL.
Passez à l’étape suivante du processus de construction de votre librairie.
12
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
5.3
Protocole de sélection double de taille d’ADN
Résumé du protocole
•
Pour les équipements supplémentaires et le matériel requis, voir les paragraphes 1.2 et
2.3, respectivement. Pour des informations détaillées sur chaque étape, voire page 15.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Retirer la suspension NucleoMag® NGS Bead du réfrigérateur. Laisser reposer pendant
environ 30 minutes pour que la suspension de billes atteigne la température ambiante.
Éliminer les grands
fragments d’ADN non
souhaités
Mélanger jusqu’à obtenir une
suspension homogène
40 µL NucleoMag® NGS Bead
100 µL d’échantillon d’ADN
Mélanger par pipetages
successifs
Incuber pendant 5 min
Prélever et conserver le
surnageant après 5 min de
séparation
Transférer le surnageant dans
une plaque 96-puits
Jeter les billes
2
Éliminer les petits
fragments d’ADN non
souhaités
Ajouter 20 µL NucleoMag® NGS
Bead au surnageant de l’étape 1
Mélanger par pipetages
successifs
Incuber pour 5 min
Eliminer et jeter le surnageant
après 5 min de séparation
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
13
NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
3
1er lavage avec
l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96-puits
sur le NucleoMag® SEP
200 µL d’éthanol 80 %
Incuber 30 s
Eliminer le surnageant avec
précaution
4
2ième lavage avec
l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96-puits
sur le NucleoMag® SEP
200 µL d’éthanol 80 %
Incuber 30 s
Eliminer le surnageant avec
précaution
5
Sécher les billes
6
Eluer l’ADN
5 – 15 min à TA
Retirer la plaque 96-puits
sur le NucleoMag® SEP
10 – 50 µL de tampon d’élution
Mélanger par pipetages
successifs
Incuber 2 – 5 min
Séparer pendant 5 min et
transférer les ADN dans une
nouvelle plaque 96-puits
14
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
Protocole détaillé
Ce protocole peut être utilisé pour générer des librairies de fragments d’ADN d’une certaine
taille ou pour réduire la distribution de taille des fragments. La méthode est appelée double
sélection de taille, car les fragments les plus petits et les plus grands peuvent être éliminés.
Tout d’abord, un volume approprié de suspension de billes NucleoMag® NGS Bead est ajouté
à l’échantillon d’ADN. Cette étape permet de lier tous les fragments d’ADN plus longs que la
limite supérieure souhaitée de l’intervalle. Les billes contenant les fragments d’ADN plus grands
non désirés sont éliminées (sélection du côté droit). Le surnageant, qui contient des fragments
d’ADN plus courts que la limite supérieure de taille, est transféré dans un nouveau tube pour
effectuer la deuxième étape de sélection de taille (sélection du côté gauche) : une plus grande
quantité de suspension de billes est ajoutée au surnageant, de sorte que les fragments d’ADN
plus longs que la limite inférieure de l’intervalle soient liés. Après élimination du surnageant, les
fragments d’ADN situés dans l’intervalle de taille souhaité sont élués.
Le protocole suivant illustre la sélection de taille des librairies de fragments d’ADN dont la taille
est comprise entre 400 et 500 pb. En modifiant les ratios de volume, il est possible d’obtenir
des librairies de fragments d’ADN avec d’autres gammes de taille (voir paragraphe 2.4, page
6).
Avant de débuter la procédure :
•
1
Retirer la suspension NucleoMag® NGS Bead du réfrigérateur. Laisser reposer pendant
environ 30 minutes pour que la suspension de billes atteigne la température ambiante.
Éliminer les grands fragments d’ADN non souhaités
Vortexer la suspension de billes NucleoMag® NGS Bead jusqu’à l’obtention d’une
couleur homogène. Ajouter 40 µL de la suspension de billes bien homogénéisée dans
chaque puits de la plaque de séparation.
Ajouter 100 µL d’échantillon d’ADN (le ratio de volume entre la suspension de billes
avec le tampon de fixation et l’échantillon est de 0,4). Ajuster la pipette à 140 µL et
mélanger par une dizaine de pipetages successifs.
Incuber la plaque de séparation à température ambiante pendant 5 minutes.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant la plaque 96 puits
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 5 minutes jusqu’à
ce que toutes les billes aient été capturées par les aimants ou jusqu’à ce que le liquide
soit clair.
Transférer le surnageant dans une nouvelle plaque et jeter les billes qui contiennent les
grands fragments non souhaités.
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
15
NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
2
Éliminer les petits fragments d’ADN non souhaités
Vortexer la suspension de billes NucleoMag® NGS Bead jusqu’à l’obtention d’une
couleur homogène. Ajouter 20 µL de la suspension de billes bien homogénéisée à
chaque puits contenant les surnageants de l’étape 1 (le ratio du volume total de la
suspension de billes avec le tampon de fixation par rapport à l’échantillon d’origine est
maintenant de 0,6 ; 40 µL et 20 µL à 100 µL). Ajuster la pipette à 160 µL et mélanger
par une dizaine de pipetages successifs.
Incuber la plaque de séparation à température ambiante pendant 5 minutes.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant la plaque 96 puits
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 5 minutes jusqu’à
ce que toutes les billes aient été capturées par les aimants ou jusqu’à ce que le liquide
soit clair.
Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
Note : ne pas perturber les billes capturées lors de l’aspiration du surnageant. Prélever
le surnageant du côté opposé du puits.
3
1er lavage avec de l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96 puits sur le séparateur magnétique pendant l’étape de lavage.
Ajouter 200 µL d’éthanol 80 % sans perturber le culot de billes. Incuber la plaque
de séparation à température ambiante pendant au moins 30 secondes. Retirer
soigneusement le surnageant en le pipetant.
4
2ième lavage avec de l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96 puits sur le séparateur magnétique pendant l’étape de lavage.
Ajouter 200 µL d’éthanol 80 % sans perturber le culot de billes. Incuber la plaque
de séparation à température ambiante pendant au moins 30 secondes. Retirer
soigneusement le surnageant en le pipetant.
Note : éliminer complètement le surnageant, y compris les gouttelettes résiduelles.
5
Sécher les billes
Laisser la plaque 96 puits sur le séparateur magnétique et incuber à température
ambiante pendant 5 à 15 minutes afin de permettre l’évaporation des traces d’alcool
restantes.
Note : Laisser le culot sécher suffisamment pour qu’il n’y ait plus de gouttelettes visibles
du surnageant au fond des puits. Ne pas trop sécher les billes. Le rendement peut
diminuer car les fragments d’ADN plus longs élueront plus lentement.
16
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
6
Eluer les fragments d’ADN de la librairie
Retirer la plaque 96 puits du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 10 à 50 µL de tampon d’élution et remettre le culot de billes en suspension
par une dizaine de pipetages successifs ou en agitant (par exemple, à 1100 rpm à l’aide
d’un Thermomixer® eppendorf).
Incuber la plaque de séparation à température ambiante pendant 2 à 5 minutes.
Note : 10mM de Tris-HCl (pH 8), de l’eau ou un tampon d’élution MN (par exemple, le
tampon BE, voir les informations relatives à la commande) peuvent être utilisés comme
tampon d’élution.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant la plaque 96 puits
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 5 minutes jusqu’à
ce que toutes les billes aient été capturées par les aimants ou jusqu’à ce que le liquide
soit clair.
Transférer le surnageant contenant la librairie de fragments d’ADN purifiée dans une
nouvelle plaque 96 puits. Passer à l’étape suivante du processus de préparation de la
librairie.
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
17
NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
5.4
Protocole de purification des produits PCR
Résumé du protocole
•
Pour les équipements supplémentaires et le matériel requis, voir les paragraphes 1.2 et
2.3, respectivement.
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 20.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Retirer la suspension NucleoMag® NGS Bead du réfrigérateur. Laisser reposer pendant
environ 30 minutes pour que la suspension de billes atteigne la température ambiante.
Fixation de l’ADN cibles
aux billes NucleoMag®
NGS Bead
Mélanger jusqu’à obtenir une
suspension homogène
180 µL NucleoMag® NGS Bead
100 µL d’échantillon d’ADN
Mélanger par pipetages
successifs
Incuber pendant 5 min
Eliminer le surnageant après 5 min
de séparation
2
1er lavage avec
l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96-puits
sur le NucleoMag® SEP
200 µL d’éthanol 80 %
Incuber 30 s
Eliminer le surnageant avec
précaution
3
2ième lavage avec
l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96-puits
sur le NucleoMag® SEP
200 µL d’éthanol 80 %
Incuber 30 s
Eliminer le surnageant avec
précaution
18
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
NucleoMag® NGS Clean-up and Size Select
4
Séchage des billes
5 – 15 min à TA
5
Elution de l’ADN
Retirer la plaque 96-puits
du NucleoMag® SEP
10‑50 µL de tampon d’élution
Mélanger par pipetages
successifs
Incuber 2 – 5 min
Séparer pendant 5 min et
transférer des ADN dans une
nouvelle plaque PCR 96-puits
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
19
NGS clean up and size selection
Protocole détaillé
Ce protocole peut être utilisé pour éliminer les contaminants (par exemple, les nucléotides, les
amorces, les adaptateurs, les enzymes, les additifs de tampon, les sels) d’un mélange de
réaction PCR. Pour garantir une bonne fixation des fragments PCR, il convient d’utiliser un ratio
billes/échantillon de 1,8. Nous recommandons d’utiliser des plaques PCR 96 puits avec un
séparateur magnétique approprié pour la purification des réactions.
1
Fixer les ADN cibles aux billes NucleoMag® NGS Bead
Vortexer la suspension de billes NucleoMag® NGS Bead jusqu’à l’obtention d’une
couleur homogène.
Ajouter 1,8 vol. de suspension de billes NucleoMag® NGS Bead bien mélangée dans
chaque puits de la plaque de séparation. Consulter le tableau 1 pour des suggestions
de volumes d’échantillons et de billes.
Note : Dans le cas de volumes de traitement supérieurs à 200 µL, un contenant de
mélange plus grand, par exemple une plaque à puits profonds, peut être utilisé.
Tableau 1 : Volumes réactionnels de PCR avec les volumes de suspension de billes
NucleoMag® NGS Bead suggérés
Volume réactionnel des échantillons
Volume de la suspension NucleoMag® NGS
Bead
10 µL
18 µL
20 µL
36 µL
50 µL
90 µL
100 µL
180 µL
Mélanger par agitation ou de préférence à la pipette jusqu’à ce que la couleur du
mélange devienne homogène (par exemple, 10 fois).
Incuber les échantillons pendant 5 minutes à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques en plaçant la plaque contenant les échantillons sur un
séparateur magnétique approprié (selon la plaque de séparation). Attendre au moins
2 minutes que les billes soient capturées par les aimants.
Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
2
1er lavage avec de l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96 puits sur le séparateur magnétique.
Ajouter 200 µL d’éthanol 80 % sans perturber le culot de billes. Incuber la plaque de
séparation à température ambiante pendant 30 secondes. Retirer soigneusement et
jeter le surnageant.
20
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
NGS clean up and size selection
3
2ième lavage avec de l’éthanol 80 %
Laisser la plaque 96 puits sur le séparateur magnétique.
Ajouter 200 µL d’éthanol 80 % sans perturber le culot de billes. Incuber la plaque de
séparation à température ambiante pendant 30 secondes. Retirer soigneusement et
jeter le surnageant.
4
Sécher les billes
Laisser la plaque de séparation sur le séparateur magnétique et incuber à
température ambiante pendant 5 à 15 minutes afin de permettre l’évaporation des
traces d’alcool restantes.
Note : Laisser le culot sécher suffisamment pour qu’il n’y ait plus de gouttelettes
visibles du surnageant au fond des puits. Ne pas trop sécher les billes. Le rendement
peut diminuer car les fragments d’ADN plus longs élueront plus lentement.
5
Eluer les fragments d’ADN
Retirer la plaque de séparation du séparateur magnétique.
Ajouter 10 à 50 µL de tampon d’élution et remettre le culot de billes en suspension
par une dizaine de pipetages successifs.
Incuber la plaque de séparation à température ambiante pendant 2 à 5 minutes.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant la plaque avec les
échantillons sur le séparateur magnétique. Attendre au moins 2 minutes jusqu’à ce que
toutes les billes aient été capturées par les aimants.
Transférer le surnageant contenant les fragments d’ADN purifiée dans une nouvelle
plaque.
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
21
NGS clean up and size selection
6
Annexes
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Cause possible et suggestions
Ratio insuffisant
•
Utiliser un ratio de volume décrits dans ce manuel, par exemple 1,0.
(voir paragraphe 2.4, page 6)
Concentration insuffisante d’éthanol pour l’étape de lavage
•
Faible
rendement en
ADN
Utiliser de l’éthanol à 80 % fraîchement préparé. Avec le
temps, l’éthanol se dilue par évaporation et absorption de l’eau
atmosphérique. Par conséquent, certaines parties du culot d’ADN
passent en solution et les fragments d’ADN sont éliminés.
Volume de tampon d’élution insuffisant
•
Le culot de billes doit être entièrement recouvert de tampon d’élution.
Temps d’incubation pour l’élution insuffisant
•
Incuber les billes dans le tampon d’élution pendant 5 minutes pour
obtenir des rendements optimaux.
Séchage excessif des billes
•
Performance
suboptimale
des ADN dans
les applications
avales
Ne pas sécher les billes plus de 15 minutes à température ambiante.
Un séchage excessif des billes peut entraîner une baisse de
l’efficacité de l’élution.
Contamination par de l’éthanol des tampons de lavage
•
Vérifier que tout l’éthanol a été éliminé après la dernière étape de
lavage. Sécher les billes 5 – 10 minutes à température ambiante.
Séparation magnétique trop courte
•
Perte de billes
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
•
22
Augmenter la durée de séparation magnétique pour permettre aux
billes d’être capturées par les aimants avant d’éliminer le surnageant.
Une vitesse d’aspiration élevée lors de l’élution peut induire une perte
de billes. Réduire la vitesse d’aspiration pour l’étape d’élution.
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
NGS clean up and size selection
6.2
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoMag NGS Clean‑up and Size Select
744970.5
744970.50
744970.500
1 × 96 preps
4 × 96 preps
24 × 96 preps
NucleoMag® SEP
744900
1
Elution Plate U-bottom
740486.24
24
Self adhering PE Foil
740676
50 feuilles
Buffer BE
740306.100
125 mL
®
Visitez notre site web www.mn‑net.com pour des informations détaillées.
MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 07
23
NGS clean up and size selection
6.3
Restriction d’utilisation / garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour
obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la
documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour, Rev. 04
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MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Tel. : +49 24 21 969‑333
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Marques déposées :
Illumina est une marque déposée d’Illumina, Inc. et de ses filiales.
Thermomixer est une marque déposée d’Eppendorf AG, Allemagne.
NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREY NAGEL GmbH & Co KG.
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées de leur propriétaire respectif - même s’il ne s’agit pas d’une dénomination spéciale. La mention de
produits et de marques n’est qu’une forme d’information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et
ne peut être considérée comme une forme de recommandation ou d’évaluation). En ce qui concerne ces produits ou
services, nous ne pouvons donner aucune garantie quant au choix, à l’efficacité ou au fonctionnement.
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Plasmid DNA
Clean up
RNA
DNA
Viral RNA and DNA
Protein
High throughput
Accessories
Auxiliary tools
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