Macherey-Nagel NucleoSpin Gel and PCR Clean-up XS Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d’utilisation
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
n NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up XS
Janvier 2024 / ​Rev. 02
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Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
Sommaire
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
4
1.3 A propos de ce manuel
5
2 Description du produit
6
2.1 Le principe général
6
2.2 Caractéristiques du kit
6
2.3 Procédure de dilution
6
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
7
4 Instructions de sécurité
8
4.1 Élimination
8
5 Protocole
9
6 Annexes
10
6.1 Guide de résolution des problèmes
10
6.2 Informations de commandes
13
6.3 References
13
6.4 Restrictions d’utilisation / garantie
13
6.5 Versions linguistiques et prédominance
14
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
1
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoSpin® Gel and PCR Clean‑up XS
10 preps
740611.10
50 preps
740611.50
250 preps
740611.250
Tampon de fixation NTI
10 mL
40 mL
200 mL
Tampon de lavage NT3 (concentré)*
6 mL
12 mL
50 mL
Tampon d’élution NE**
13 mL
13 mL
13 mL
Colonnes NucleoSpin Gel and PCR
Clean-up XS (anneaux jaunes)
10
50
250
Tubes collecteurs (2 mL)
10
50
250
Protocole
1
1
1
REF
®
1.2
Réactifs, consommables et équipements à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
96 – 100 % d’éthanol
Consommables
•
Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL
•
Cônes jetables pour pipettes
Equipements
•
Pipettes manuelles
•
Centrifugeuse pour microtubes
•
Bloc chauffant, bain-marie ou thermomixeur pour l’extraction à partir du gel
•
Scalpel pour couper les gels d’agarose
•
Vortex
•
Équipements de protection individuelle (blouse, gants, lunettes)
* Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3.
** Composition du tampon d’élution NE : 5 mM Tris/HCl, pH 8,5
2
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
1.3
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce manuel
d’utilisation si le kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up XS est utilisé pour la première
fois. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le
résumé du protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil supplémentaire de
référence pour l’exécution de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante :
www.mn‑net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes.
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
3
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
2
Description du produit
2.1
Le principe général
NucleoSpin® Gel and PCR Clean‑up XS est conçu comme un kit 2 en 1 permettant d’extraire
l’ADN de réactions enzymatiques ou de gels d’agarose. Le tampon de fixation NTI inactive les
enzymes et favorise la fixation de l’ADN aux couches de silice à l’intérieur des colonnes de
fixation. En outre, le tampon NTI est utilisé en combinaison avec une incubation à 50 °C pour
faire fondre les gels d’agarose lors de l’extraction de l’ADN sur gel. L’ADN fixé est rigoureusement
lavé avec le tampon NT3 et élué dans des volumes d’élution de 6 µL ou plus de tampon NE, ce
qui permet d’obtenir un ADN hautement pur et concentré.
2.2
•
Caractéristiques du kit
Le kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up XS est réservé à l’usage de la recherche.
Tableau 1: Résumé des caractéristiques du kit
Paramètres
NucleoSpin® Gel and PCR Clean‑up XS
Format
Microspin, format XS
Procédure
Manuelle
Échantillon d’articles
≤ 200 µL de réaction enzymatique
≤ 200 mg de gel d’agarose
Volume d’élution
≥ 6 µL
Temps de préparation
< 15 min/12 preps (purification de réaction PCR)
30 min/12 preps (extraction du gel)
Capacité de fixation
5 µg
Utilisation
Réserver à l’usage de la recherche
2.3
Procédure de dilution
Le format de la colonne XS est conçu pour de faibles volumes d’élution, ce qui permet
d’obtenir des concentrations élevées d’ADN. Néanmoins, il existe des conseils et des astuces
pour améliorer la récupération de l’ADN, en particulier lorsque l’on travaille avec des volumes
d’élution inférieurs à 10 µL.
Les améliorations les plus importantes en termes de récupération des acides nucléiques
peuvent être obtenues par une double élution. Dans ce cas, l’éluat de l’étape d’élution est
rechargé sur la colonne de fixation pour une deuxième procédure d’élution. De cette manière,
le volume total d’élution reste faible tandis que le taux de récupération est améliorée.
Cela est particulièrement vrai pour les procédures d’extraction sur gel. L’ADN a tendance à
rester collé à la matrice de silice et présente un profil d’élution retardé. Plusieurs cycles d’élution
peuvent augmenter considérablement le taux de récupération de l’ADN.
Il faut garder à l’esprit que la contamination en sels chaotropiques augmentera l’absorption
à 230 nm sans effets négatifs sur les applications en aval. Même des quantités infimes de
thiocyanate, bien inférieures à une concentration pouvant influencer les applications, présentent
une forte absorption à 230 nm. Cependant, il n’y a pas d’effet sur l’absorption à 260 nm.
4
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention : Le tampon NTI contient du thiocyanate de guanidine ! Porter des gants et des
lunettes !
ATTENTION : Le tampon NTI contient du thiocyanate de guanidine qui peut former des
composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorure de sodium).
NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation
d’échantillons.
•
Tous les composants du kit peuvent être conservés à température ambiante (18 – 25 °C)
et sont stables pendant au moins un an.
Avant de débuter le protocole NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up XS, préparer les éléments
suivants :
NucleoSpin® Gel and PCR Clean‑up XS
REF
Tampon de lavage
NT3 Concentré
10 preps
740611.10
50 preps
740611.50
250 preps
740611.250
6 mL
Ajouter 24 mL
d’éthanol
12 mL
Ajouter 48 mL
d’éthanol
50 mL
Ajouter 200 mL
d’éthanol
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
5
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up XS, portez des
vêtements de protection appropriés (p.e. blouse de laboratoire, gants jetables et lunettes de
protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées
(FDS disponibles en ligne sur www.mn‑net.com/msds).
Attention : le thiocyanate de guanidinium dans le tampon NTI peut former des composés très
réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de
Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up XS n’ont pas été testés
pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets
liquides par du matériel infectieux résiduel est très improbable en raison du tampon de lyse
fortement dénaturant, mais elle ne peut pas être totalement exclue. Par conséquent, les
déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés
conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Élimination
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
6
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up XS
5
Protocole
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon de lavage NT3 a été préparé conformément au chapitre 3.
•
Lors d’une extraction sur gel, exciser la bande d’ADN du gel d’agarose et déterminer le
poids de gel. Préchauffer un bloc chauffant, un thermomixeur ou un bain-marie à 50 °C.
1
Fixation de l’ADN
Mélanger 1 volume d’échantillon avec 2 volumes de
tampon NTI (p.e., mélanger 20 µL de réaction PCR avec
40 µL de NTI ou 150 mg de gel d’agarose avec 300 µL de
NTI).
+ 2 vol NTI
pour 1 vol
d’échantillon
Vortex
Extraction sur gel d’agarose uniquement :
Incuber le mélange à 50 °C avec une agitation constante ou
vortexer régulièrement toutes les 2 à 3 min jusqu’à ce que le
gel soit complètement dissous.
2
Fixation de l’ADN
Placer une colonne NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
XS dans un tube collecteur (2 mL) et charger jusqu’à 500 μL
d’échantillon.
Centrifuger pendant 30 s à 11,000 × g. Jeter le filtrat s’il
dépasse 100 µL et replacer la colonne dans le tube collecteur.
Charger
l’échantillon
11,000 × g
30 s
Si nécessaire, charger l’échantillon restant et répéter l’étape
de centrifugation.
3
Lavage de la membrane de silice
Ajouter 500 μL de tampon NT3 à la colonne NucleoSpin®
Gel and PCR Clean-up XS. Centrifuger pendant 30 s à
11,000 × g. Jeter le filtrat et placer la colonne dans un tube
de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni).
4
Lavage et séchage de la silice
Ajouter 300 µL de tampon NT3 à la colonne NucleoSpin®
Gel and PCR Clean-up XS.
Centrifuger pendant 1 min à 11,000 × g. Jeter le filtrat et
placer la colonne dans un tube de microtubes à centrifuger
de 1,5 mL (non fourni).
5
+ 500 μL NT3
11,000 × g
30 s
+ 300 µL NT3
11,000 × g
1 min
Eluer l’ADN
Ajouter 6 – 12 µL de tampon NE et incuber à température
ambiante (18 – 25 °C) pendant 1 min.
Centrifuger pendant 1 min à 11,000 × g.
Recharger les éluats sur la colonne et répéter l’étape d’élution.
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
+ 6 – 12 μL NE
TA
1 min
11,000 × g
1 min
7
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
6
Annexes
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possibles et suggestions
Durée et température
Dissolution
incomplète
du gel
•
Augmenter le temps d’incubation et vortexer le mélange à plusieurs
reprises toutes les 2 à 3 min jusqu’à ce que le gel soit complètement
dissout. Ne pas augmenter la température d’incubation pour éviter la
perte d’ADN simple brin dénaturé par une température trop élevée.
Réactifs préparés ou conservés de manière inappropriée
•
Ajouter le volume indiqué d’éthanol à 96 – 100 % au tampon NT3. Bien
mélanger et garder le flacon bien fermé. Éviter les conditions dans
lesquelles l’éthanol pourrait s’évaporer (p.e. températures élevées,
flacons ouverts).
Dissolution incomplète du gel
•
Faible
rendement
d’ADN
Peser le bloc d’agarose et ajouter 2 volumes de tampon NTI. Agiter
le mélange en continu ou vortexer le tube toutes les 2 à 3 minutes. Si
nécessaire, augmenter les temps d’incubation, mais ne pas augmenter
la température d’incubation.
Elimination de l’éthanol
•
Veiller à ce que les sorties ou les parois des colonnes n’entrent pas en
contact avec le filtrat NT3 après la deuxième étape de lavage. En cas
de doute, replacer la colonne dans le tube collecteur vide et refaire une
centrifugation
Élution incomplète
•
8
Si la récupération de l’ADN est faible, il est probable que l’ADN restant
adhère encore à la silice. Les pertes au cours de l’étape de fixation ou
de lavage sont peu probables si les tampons sont utilisés, conservés
et préparés conformément au protocole. Pour améliorer la récupération
de l’ADN, il est recommandé d’augmenter le volume d’élution total ou
de répéter les étapes d’élution avec la même aliquote, en particulier lors
de l’utilisation de faibles volumes d’élution inférieurs à 10 µL. Il suffit de
recharger l’éluat sur la silice et de répéter la centrifugation.
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
Problème
Causes possibles et suggestions
Surestimation de la quantité d'échantillon avant purification
Faible
rendement
d’ADN
•
Il faut garder à l’esprit que la photométrie additionne l’absorption
de toute molécule qui absorbe à une certaine longueur d’onde, p.e.
260 nm. Une réaction PCR contiendra non seulement les amplificats
d’ADN souhaités, mais aussi des amorces résiduelles, des dNTP
inutilisés, des enzymes, certains détergents ou substances tampons,
qui absorbent tous à 260 nm et augmentent la concentration d’ADN
mesurée.
•
Une détermination photométrique de la récupération du produit n’est
pas possible. Pour évaluer la récupération du produit, des techniques
alternatives telles que l’électrophorèse sur gel, l’électrophorèse capillaire
ou la fluorométrie spécifique à l’ADNdb doivent être utilisées. En fonction
du mélange PCR, 80 à 90 % de l’absorption initiale à 260 nm seront
éliminés par la procédure de purification.
Bandes diffuses sur gel
•
Les gels d’agarose peuvent présenter des artefacts lorsque la maille
d’agarose est irrégulière en raison d’une homogénéisation insuffisante
de l’agarose dans le tampon TAE / ​TBE, de différences de solidification,
d’épaisseur locale ou d’autres influences qui modifient la vitesse de
migration. L’ADN lui-même peut également migrer dans différentes
conformations, en fonction de la séquence et de la température du
tampon. Bien que la bande principale puisse afficher un signal fort, il est
tout de même possible que certains fragments migrent légèrement plus
vite ou plus lentement, mais en quantités insuffisantes pour produire un
signal détectable ou apparaissent sous forme de traînée. L’excision de la
bande éliminera ces fragments, mais il est néanmoins recommandé de
réduire la quantité d’agarose.
Contamination par des sels chaotropiques
•
Les sels de thiocyanate se sont avérés efficaces et fiables pour faire
fondre les gels d’agarose et pour lier les acides nucléiques à une surface
de silice. Ils ont fait leurs preuves à long terme en matière de purification
d’acides nucléiques à partir de divers types d’échantillons et pour
diverses applications en aval.
•
Néanmoins, ces sels chaotropiques expriment une absorption très
élevée à 230 nm, même à des concentrations négligeables de l’ordre
de la micromole, alors que l’absorption à 260 nm est nulle. Les sels de
thiocyanate vont donc biaiser le rapport de pureté A260/A230 mais pas la
quantification de l’ADN. Dans ce cas, un faible rapport A260/A230 n’est
pas un indicateur de performance sous-optimale dans les applications
en aval et peut être ignoré.
•
Pour améliorer l’A260/A230, des étapes de lavage supplémentaires avec le
tampon NT3 peuvent être effectuées. Du tampon NT3 supplémentaire
sera nécessaire et peut être commandé auprès de MACHEREY‑NAGEL
(REF 740598).
Faible
A₂₆₀/₂₃₀
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
9
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
Problème
Causes possibles et suggestions
Abrasion de la silice
•
Dans de rares cas, des fibres de silice cisaillées peuvent passer le
filtre des colonnes et être éluées. Lorsqu’elles sont mesurées dans
un photomètre, ces fibres diffusent la lumière, ce qui entraîne une
surestimation globale des valeurs d’absorption. Une valeur A320 élevée,
supérieure à 0,05, est un indicateur de particules qui diffusent la lumière.
•
La silice abrasive peut être facilement culotté par centrifugation et est
généralement déjà centrifugée par l’élution. Le fait de mélanger les éluats
à l’aide d’un vortex risque de remettre ces particules en suspension.
Pour éviter cela, il est recommandé de transférer l’éluat clarifié sans le
culot blanc facilement visible dans un nouveau tube à centrifuger.
A₃₂₀ élevée
L’ADN a été endommagé par la lumière UV
•
Réduire au minimum le temps d’exposition aux UV lors de l’excision d’un
fragment d’ADN dans un gel d’agarose.
Elimination de l’éthanol
•
Performance
sousoptimale
dans les
applications
en aval
En raison des faibles volumes d’élution, l’éthanol entraîné par la
deuxième étape de lavage peut atteindre une concentration élevée
dans les éluats et risque d’inactiver les enzymes. Veiller à ce que les
sorties ou les parois des colonnes n’entrent pas en contact avec le filtrat
NT3 de la deuxième étape de lavage. En cas de doute, jeter le filtrat et
replacer les colonnes dans les tubes collecteurs vides. Répéter l’étape
de centrifugation.
Abrasion de la silice
•
Les débris de silice peuvent disperser ou éteindre les signaux lors des
mesures photométriques ou de fluorescence. En outre, les canaux de
l’électrophorèse capillaire peuvent être bloqués. Si un culot blanc est
visible, centrifuger les éluats et transférer le surnageant clarifié sans culot
blanc dans un nouveau tube de réaction.
Tampon NTC
Purification
de l’ARN ou
de l’ADN
simple brin
10
•
Le tampon NTI est utilisé pour l’ADN double brin ou l’ADN simple brin
de longueur supérieure à 500 pb. Pour l’ADN ou l’ARN simple brin plus
court, il est recommandé d’utiliser le tampon NTC. Ce tampon peut être
utilisé à la fois pour la purification de la réaction et pour l’extraction du
gel.
•
Le tampon NTC peut être commandé auprès de MACHEREY‑NAGEL
(REF 740654.100)
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
6.2
Informations de commandes
Produit
REF
Conditionnement
NucleoSpin® Gel and PCR Clean‑up XS
740611.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
Tampon NTI
740305.120
200 mL
Tampon NTB
740595.150
150 mL
Tampon NTC
740654.100
100 mL
Tampon NT3 (Concentré)
(pour 125 mL de tampon NT3)
740598
25 mL
Tubes collecteurs (2 mL)
740600
1000
NucleoVac 24 Vacuum Manifold
740299
1
Adaptateur NucleoVac Mini
740297.100
100
Vannes NucleoVac
740298.24
24
NucleoTrap®
740584.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
NucleoTraP®CR
740587.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
Visitez le site www.mn‑net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit.
6.3
References
Vogelstein B., and D. Gillespie. 1979. Preparative and analytical purification of DNA from
agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 615 – 619.
6.4
Restrictions d’utilisation / garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
11
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour
obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la
documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour, Rev. 04
Veuillez contacter :
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Tel. : +49 24 21 969‑333
support@mn‑net.com
6.5
Versions linguistiques et prédominance
Ce document est disponible en plusieurs langues. En cas de divergence ou de problème d’interprétation, la version
anglaise prévaut.
Marques déposées :
NucleoSpin® est une marque déposée de MACHEREY NAGEL GmbH & Co KG.
NucleoTrap® est une marque déposée de MACHEREY NAGEL GmbH & Co KG.
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux
marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
12
MACHEREY-NAGEL – 01/2024, Rev. 02
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Clean up
RNA
DNA
Viral RNA and DNA
Protein
High throughput
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