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MACHEREY-NAGEL Biologie Moléculaire Bioanalysis User manual Manuel d’utilisation Purification d’ADN à partir d'échantillons FFPE n NucleoSpin® DNA FFPE XS Novembre 2023 / Rev. 05 www.mn-net.com www.mn-net.com Purification d’ADN des échantillons FFPE Résumé du protocole (Rev. 05) NucleoSpin® DNA FFPE XS Préparer l’échantillon 1 Déparaffiner l’échantillon Protocole 5.1: Protocole 5.2: Purification d’ADN avec le Paraffin Dissolver Purification d’ADN avec le xylène Pour la quantité d’échantillon appropriée, voir la section 2.4. Pour la quantité d’échantillon appropriée, voir la section 2.4. 400 μL de Paraffin Dissolver 1 mL de xylène 60 °C, 3 min Mélanger l’échantillon chaud TA, 2 min Mélanger 11,000 x g, 2 min Eliminer le surnageant 1 mL ~ 98 % d’éthanol Laisser refroidir l’échantillon Mélanger 11,000 x g, 2 min Eliminer le surnageant Sécher à 60 °C, 3 –10 min 2 Lyser l’échantillon 100 μL FL Mélanger vigoureusement 11,000 x g, 1 min – 10 μL Protéinase K 10 μL Protéinase K Mélanger la phase infé-rieure Mélanger TA, 3 heures ou pendant la nuit 3 Décrosslink 4 Ajuster conditions de fixation 5 Fixer l’ADN 100 μL FL TA, 3 heures ou pendant la nuit 100 μL D-Link 100 μL D-Link Mélanger doucement Mélanger doucement 11,000 x g, 30 s – 90 °C, 30 min 90 °C, 30 min 200 μL ~ 98 % d’éthanol 200 μL ~ 98 % d’éthanol Mélanger Mélanger 1,000 x g, 1 s – Charger la phase aqueuse (inférieure) Charger le lysat 2,000 x g, 30 s MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-333 · support@mn-net.com · www.mn-net.com 2,000 x g, 30 s Purification d’ADN des échantillons FFPE Résumé du protocole (Rev. 05) 6 Laver et sécher la membrane de silice 7 Eluer l’ADN 8 Optionnel: éliminer l’éthanol résiduel 1ère 2nd 400 μL B5 400 μL B5 11,000 x g, 30 s 11,000 x g, 30 s 400 μL B5 400 μL B5 11,000 x g, 2 min 11,000 x g, 2 min 20 μL BE 20 μL BE 11,000 x g, 30 s 11,000 x g, 30 s 90 °C, 8 min 90 °C, 8 min MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-333 · support@mn-net.com · www.mn-net.com Contact MN Germany and international MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-0 Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only) E-mail: info@mn-net.com Technical Support Bioanalysis Tel.: +49 24 21 969-333 E-mail: support@mn-net.com USA MACHEREY-NAGEL Inc. 924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA Toll-free: 888 321 6224 (MACH) E-mail: sales-us@mn-net.com France MACHEREY-NAGEL SAS 1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France Tel.: +33 388 68 22 68 E-mail: sales-fr@mn-net.com MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 € Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531 Switzerland MACHEREY-NAGEL AG Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland Tel.: +41 62 388 55 00 E-mail: sales-ch@mn-net.com www.mn-net.com Purification d’ADN des échantillons FFPE Sommaire 1 Composition du kit 4 1.1 Composants 4 1.2 Réactifs, consommables, et équipement nécessaire 5 1.3 A propos de ce manuel 5 2 Description du kit 6 2.1 Principe général 6 2.2 Caractéristiques du kit 7 2.3 Manipulation, préparation et conditions de stockage des échantillons 8 2.4 Quantité de tissus FFPE 8 2.5 Procédures d’élution 9 2.6 Stabilité de l’ADN purifié 10 2.7 Elimination des traces résiduelles d’éthanol, pour une sensibilité maximale des applications en aval. 10 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 12 4 Instructions de sécurité 13 4.1 Élimination des déchets 5 Protocoles 13 14 5.1 Purification de l’ADN des échantillons FFPE utilisant le tampon Paraffin Dissolver 14 5.2 Purification de l’ADN avec déparaffinage au Xylène 20 6 Annexes 24 6.1 Information sur la qualité et la quantité d’ADN 24 6.2 Guide de résolution des problèmes 25 6.3 Informations de commande 27 6.4 Restrictions d’utilisation / garantie 28 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 3 Purification d’ADN des échantillons FFPE 1 Composition du kit 1.1 Composants NucleoSpin® DNA FFPE XS 10 preps 740980.10 50 preps 740980.50 250 preps 740980.250 Tampon de dissolution de la paraffine « Paraffin Dissolver » 5 mL 25 mL 125 mL Tampon de lyse FL 8 mL 8 mL 4 × 8 mL Tampon de décrosslink « D-Link » 8 mL 8 mL 30 mL Tampon de lavage B5 (concentré)* 6 mL 12 mL 50 mL Protéinase K (lyophilisée)* 6 mg 30 mg 75 mg Tampon de protéinase PB 1.8 mL 1.8 mL 8 mL Tampon d’élution BE** 13 mL 13 mL 13 mL Colonnes NucleoSpin DNA FFPE XS (bagues vertes plus Tubes Collecteurs) 10 50 250 Tubes Collecteurs (2 mL) 20 100 500 Manuel d’utilisation 1 1 1 REF ® * Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de stockage, voir le chapitre 3. ** Composition du tampon d’élution BE : 5 mM Tris/HCl, pH 8.5 4 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 Purification d’ADN des échantillons FFPE 1.2 Réactifs, consommables, et équipement nécessaire Réactifs • Ethanol 96 – 100 % (de préférence non dénaturé) pour préparer le tampon de lavage B5 et pour créer les conditions de fixation. • Optionnel pour le déparaffinage sans le Tampon Paraffin Dissolver : Xylène, d-Limonène, mélanges d’hydrocarbures isoparaffiniques ou des réactifs similaires pour le déparaffinage. Consommables • Tubes à centrifuger 1.5 mL (pour la lyse des échantillons et l’élution de l’ADN) • Cônes jetables Equipement • Pipettes manuelles • Centrifugeuse pour micro tubes • Vortex • Bloc chauffant (réglable à 60 °C et 90 °C) • Equipements de protection personnelle (ex. blouse, gants, lunettes de protection) 1.3 A propos de ce manuel Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs du kit NucleoSpin® DNA FFPE XS de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce manuel d’utilisation. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du protocole est conçu pour être utilisé comme un support permettant le suivi rapide des étapes du protocole lors de la procédure de purification. Toute la littérature technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante : www.mn-net.com. Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications apportées au manuel d’utilisation actuel par rapport aux révisions précédentes. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 5 Purification d’ADN des échantillons FFPE 2 Description du kit Les échantillons de tissus fixés à la formaline et inclus en paraffine (dits ’FFPE’ : Formalin-fixed, paraffin-embedded) sont préparés couramment à partir d’échantillons chirurgicaux humains par fixation à la formaline suivie d’une inclusion dans la paraffine. De fines coupes de ces échantillons FFPE sont utilisées en routine pour des analyses d’histopathologie, et le reste de ces blocs de tissus inclus en paraffine est archivé. L’existence de vastes collections de tissus FFPE représente une source précieuse pour des études rétrospectives du profil d’expression des gènes et l’analyse des mutations. Cependant, l’utilisation de l’ADN de ces échantillons est limitée en raison des modifications chimiques entraînées par le formaldéhyde et la fragmentation de l’ADN pendant la préparation des tissus (prélèvement, fixation, inclusion) et leur stockage (humidité, durée, température). Les procédures standards d’extraction de l’ADN résultent souvent en un faible rendement en ADN et de mauvaises performances dans les applications en aval (ex. PCR). Un système spécial de purification prenant en compte les contraintes spécifiques des tissus FFPE est donc nécessaire pour garantir le succès de l’analyse des acides nucléiques des échantillons 2.1 Principe général Le kit NucleoSpin® DNA FFPE XS est une méthode pratique, fiable et rapide pour extraire l’ADN à partir des tissus fixés à la formaline et inclus en paraffine (FFPE). La procédure offre une alternative à l’utilisation du xylène, inflammable et malodorant, ou du d-limonène communément utilisé pour le déparaffinage. En outre, la procédure permet d’éviter les difficultés liées à l’élimination des solvants organiques à partir de culots de tissus souvent à peine visibles. NucleoSpin® DNA FFPE XS utilise un tampon inodore breveté pout l’élimination de la paraffine (Paraffin Dissolver) et permet une lyse efficace en deux phases. Tout d’abord, les coupes de tissue FFPE sont dissoutes dans le tampon Paraffin Dissolver. Les tissus sont ensuite digérés par la protéinase K pour solubiliser les tissus fixés et libérer l’ADN en solution. Ensuite, une incubation à chaud avec un tampon spécialement conçu permet d’éliminer efficacement les liaisons covalentes (crosslink) de l’ADN précédemment libéré en solution. Après ajout d’éthanol, le lysat est déposé sur la colonne NucleoSpin® DNA FFPE XS. L’ADN est fixé à la membrane de silice. Deux étapes de lavage permettent l’élimination des sels, des métabolites et des composants cellulaires macromoléculaires. L’ADN purifié est finalement élué dans des conditions de faible force ionique dans un petit volume (20 μl) de tampon d’élution BE, aboutissant à l’obtention d’un ADN hautement concentré. La purification de l’ADN avec les kits NucleoSpin® DNA FFPE XS peut être menée à température ambiante. L’éluat, cependant, doit être traité précautionneusement, car le tampon d’élution ne contient pas d’inhibiteurs de DNases tel que l’EDTA. Pour garantir la stabilité de l’ADN, conserver l’ADN congelé à -20 °C. 6 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 Purification d’ADN des échantillons FFPE 2.2 Caractéristiques du kit • Le kit NucleoSpin® DNA FFPE XS est recommandé pour l’extraction de l’ADN à partir de tissus fixés à la formaline (formaldéhyde) et inclus en paraffine (dits tissus ’FFPE’). Les échantillons sont généralement de fines sections (environ 3 – 20 μm d’épaisseur) d’origine humaine ou animale, obtenue généralement par résection ou biopsie. • Quantité d’échantillon : la quantité maximale d’échantillon utilisable est déterminée par : a) la quantité de tissus et b) la quantité de paraffine. NucleoSpin® DNA FFPE XS est utilisable jusqu’à 5 mg de tissus. La quantité de paraffine est limitée à 15 mg avec le protocole standard utilisant le tampon Paraffin Dissolver (ex. 7 sections de 10 μm x 250 mm²). Cependant, de plus grandes quantités d’échantillons paraffinés peuvent être procédées en utilisant, soit un volume supérieur de tampon Paraffin Dissolver ou en déparaffinant en utilisant le xylène (voir aussi le paragraphe 2.4) • Rendement en ADN : il est très dépendant du type, de la qualité, de la quantité d’échantillon ainsi que de sa durée de stockage. En outre, le rendement en ADN mesuré peut varier considérablement entre les différentes méthodes de quantification. Le rendement déterminé par mesure de l’absorption à 260 nm ou par fluorescence (ex. PicoGreen®) peut varier des résultats de quantification obtenus par PCR. Même les valeurs de quantification obtenues par PCR d’un amplicon court (ex. 80 pb) par rapport à un long (ex. 300 pb) peuvent varier considérablement. La déviation de la quantification dépend également de la distribution de taille des fragments d’ADN, ainsi que de l’efficacité de la déréticulation (ou de la persistance de réticulation). Merci de voir également le paragraphe 6.1 pour d’autres informations concernant la détermination de la quantité et de la qualité de l’ADN extrait. • Le design innovant de la colonne, avec une bague en forme d’entonnoir et une petite membrane de silice permet l’élution de l’ADN dans un volume réduit de 5 – 30 μL. Ainsi, l’ADN élué est hautement concentré et prêt à l’emploi pour les applications en aval (ex. PCR). • Distribution de taille des fragments d’ADN : l’ADN isolé à partir des tissus fixés à la formaline et inclus en paraffine présente une large distribution de taille de fragments, allant de 50 à 5 000 bases. Souvent les fragments d’ADN de faible taille, c’est-à-dire de 100 – 300 bases prédominent, particulièrement quand l’échantillon de départ est ancien. Cependant, les échantillons qui ont subi une procédure appropriée de fixation, d’inclusion et de stockage peuvent permettre l’obtention de fragments ADN de taille supérieure à 5000 bases. • Temps de préparation de l’ADN : il dépend fortement de l’échantillon et de la durée de lyse nécessaire. Les meilleurs résultats de lyses sont obtenus en incubant à température ambiante pendant au moins 3 heures. Pour certains types d’échantillons, une lyse plus longue (par exemple toute une nuit) permettra d’obtenir un rendement d’ADN significativement supérieur. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 7 Purification d’ADN des échantillons FFPE Table 1: Résumé des caractéristiques du kit Paramètre NucleoSpin® DNA FFPE XS Echantillon* Jusqu’à 7 sections, de 10 μm, d’une surface de 250 mm² Rendement moyen Fortement dépendant de la qualité et de la quantité d’échantillon Volume d’élution 5 – 30 μL Volume de charge maximal de la colonne 600 μL Format Mini column – Design XS Utilisation Pour la recherche uniquement 2.3 Manipulation, préparation et conditions de stockage des échantillons De nombreux facteurs influencent le rendement et la possibilité d’utiliser l’ADN obtenu à partir de tissus FFPE. La procédure d’échantillonnage des tissus, le délai post-prélèvement et avant fixation, la durée de fixation, l’inclusion et les conditions de stockage ont un fort impact sur la qualité et le rendement de l’ADN. A partir d’un bloc de tissus inclus en paraffine, les échantillons doivent être sectionnés proprement. Les coupes de paraffine peuvent être stockées à +4 °C ou à des températures plus basses pendant au moins plusieurs semaines sans effets observables sur le rendement de l’ADN ou la possibilité d’utilisation. Le stockage à long terme des coupes de paraffine peut avoir un effet négatif sur l’ADN en raison de l’oxydation de l’air. Porter des gants en permanence pendant la préparation. Changer fréquemment de gants. 2.4 Quantité de tissus FFPE Le protocole standard (paragraphe 5.1) permet la préparation de l’ADN à partir d’environ 15 mg (c’est à dire 17 μL) de paraffine. Ceci correspond à : ~ 17 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 100 mm² ~ 7 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 250 mm² ~ 5 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 325 mm² ~ 4 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 400 mm² ~ 3 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 575 mm² ~ 2 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 840 mm² ~ 1 section de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 1680 mm² * Avec l’utilisation de la procédure standard impliquant le tampon Paraffin Dissolver, il est possible d’utiliser de plus grandes quantités d’échantillon en modifiant le protocole, voir le paragraphe 2.4. 8 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 Purification d’ADN des échantillons FFPE De plus grandes quantités de paraffine peuvent être dissoutes en utilisant dès le départ un volume de tampon Paraffin Dissolver (REF 740968.25) supérieur (30 μl de tampon Paraffin Dissolver par mg de paraffine), ou en utilisant le xylène pour le déparaffinage comme décrit dans le paragraphe 5.2. En cas d’utilisation de plus de 400 μl de tampon Paraffin Dissolver par préparation, il est nécessaire d’utiliser un tube de plus de 1,5 mL pour permettre l’élimination de la phase inférieure, aqueuse, après l’étape de déréticulation sans débordement. Note : La procédure standard NucleoSpin® DNA FFPE XS est recommandée pour les échantillons contenant jusqu’à 15 mg de paraffine (pour assurer une dissolution efficace de la paraffine avec le volume indiqué de Paraffin Dissolver) et jusqu’à 5 mg de tissu (pour éviter une surcharge de la membrane). • Trois sections de 20 mm x 25 mm de surface et de 10 μm d’épaisseur peuvent contenir jusqu’à 15 mg de paraffine (en particulier, si seules des parties mineures de la section contiennent du tissu). • Une section de 20 mm x 25 mm de surface et de 10 μm d’épaisseur contient environ 5 mg de tissu, si la section contient du tissu à l’échelle de la zone. 2.5 Procédures d’élution Une concentration elevée en ADN dans la fraction d’élution est souhaitable pour toutes les applications courantes. Etant donnée les volumes limités de mix réactionnel, une concentration élevée de la matrice peut être un critère crucial. En raison d’un volume d’élution par défaut important, les kits standard produisent souvent un ADN faiblement concentré lorsque de petits échantillons sont traités. De tels échantillons d’ADN peuvent nécessiter une étape de concentration supplémentaire pour convenir à l’application prévue. Les kits NucleoSpin® DNA FFPE XS permettent une élution efficace dans de très faibles volumes d’élution, permettant d’obtenir une concentration en ADN élevée. Les volumes d’élution compris entre 5 – 30 μL sont recommandés, le volume par défaut étant de 20 μL. 2.0 0.4 1.5 0.3 1.0 0.2 0.1 Rendement [µg] Concentration [µg/µL] 0.5 0.5 20 µL 10 µL 5 µL Diminution du volume d’élution Figure 1 Corrélation entre le volume d’élution et la concentration d’ADN (Colonnes NucleoSpin® DNA FFPE XS) MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 9 Purification d’ADN des échantillons FFPE 2.6 Stabilité de l’ADN purifié Le tampon d’élution ne contient pas d’inhibiteurs de DNases (ex. EDTA) capables de complexer divers cations divalents. Aussi, veiller à ne pas contaminer ce tampon avec des DNases ! Pour un stockage à court terme, la solution d’ADN peut être conservée à 0 – 4 °C et pour le long terme, une température de -20 °C est recommandée. 2.7 Elimination des traces résiduelles d’éthanol, pour une sensibilité maximale des applications en aval. Le volume d’élution par défaut de NucleoSpin® DNA FFPE XS est de 20 μL. Le kit autorise des volumes d’élution encore plus faibles, jusqu’à 5 μL, pour augmenter la concentration d’ADN (voir paragraphe 2.5). Sachez qu’une réduction du volume d’élution par défaut de 20 μL augmentera également la concentration d’éthanol résiduel dans l’éluat. Pour les volumes d’élution par défaut, une incubation à chaud est recommandée si la solution d’ADN éluée représente plus de 20 % du volume final de PCR (incuber l’éluat avec le bouchon ouvert pendant 8 min à 90 °C). Cette mesure de précaution permet d’éviter l’inhibition de réactions sensibles en aval. Dans ce contexte, veuillez tenir compte des remarques ci-dessous : a) une incubation de la fraction éluée à plus hautes températures augmentera le signal PCR. Ceci est particulièrement important si la matrice représente plus de 20 % du volume total de la réaction de PCR (ex. plus de 4 μl d’éluat utilisés comme matrice dans un volume de PCR total de 20 μl). La matrice peut représenter jusqu’à 40 %* du volume total de la réaction de PCR, si la solution d’ADN est incubée à 90 °C pendant 8 min, comme mentionné ci-dessus. b) Typiquement, 20 μL d’éluat s’évaporent à 12 – 14 μL pendant l’incubation à chaud pendant 8 min à 90 °C. Si des volumes finaux plus élevés sont nécessaires, veuillez augmenter le volume du tampon d’élution (par exemple, de 20 μL à 30 μL). c) Une incubation de la solution éluée pendant 8 min à 90 °C dénature l’ADN. Si, pour certaines applications autres que la PCR (telles le clonage, la ligation) l’ADN est souhaité non dénaturé, nous recommandons d’incuber la solution d’ADN à une température inférieure à 80 °C pendant une durée supérieure étant donné que la majorité des fragments d’ADN a un point de fusion supérieur à 80 °C. Suggestion : incuber pendant 17 min à 75 °C. d) L’incubation de l’ADN élué à des températures supérieures peut être ajustée selon les données présentées dans la Figure 2. Les durées et températures d’incubation présentées réduiront un volume d’élution de 20 μl à environ 12 – 14 μl et les traces d’éthanol seront éliminées comme mentionné ci-dessus. e) Si le volume initial de tampon d’élution appliqué à la colonne est inférieur à 20 μL, le temps d’incubation à chaud doit être réduit afin d’éviter un assèchement complet. Si le volume d’élution est par exemple de 5 μL, une incubation à chaud de l’éluat pendant 2 min à 80 °C permet d’éliminer convenablement l’éthanol résiduel. * Le pourcentage maximal représenté par le volume matrice dans la réaction de PCR peut varier en fonction de la robustesse du système de PCR ; 40 % de volume de matrice ont été testés en utilisant le LightCycler® PCR (Roche) avec le kit DyNAmo™ Capillary SYBR® Green qPCR Kit (Finnzymes). 10 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 Purification d’ADN des échantillons FFPE Temps d’incubation [min] 25 sans agitation 700 rpm 1400 rpm 20 15 10 Incubation time [min] 5 0 65 70 75 80 85 90 95 Température d’incubation [°C] Figure 2 Élimination de l’éthanol résiduel de la fraction d’élution par traitement à chaud. Afin d’obtenir une sensibilité maximale à la PCR, il est recommandé d’incuber l’éluat à la chaleur. L’incubation à chaud peut être effectuée à des températures de 70 à 90 °C dans un bloc chauffant, avec ou sans agitation. Les conditions efficaces (température, durée et vitesse d’agitation) pour l’élimination de l’éthanol peuvent être lues sur le diagramme ; un volume initial de 20 μL s’évaporera à 12 – 14 μL au cours de l’incubation décrite. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 11 Purification d’ADN des échantillons FFPE 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention : Le tampon FL1 contient des sels chaotropiques. Portez des gants et des lunettes de protection ! Tous les composants doivent être stockés à température ambiante (15 – 25 °C) et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le stockage à des températures inférieures peut entraîner la précipitation de sels. Vérifier la disponibilité de l’éthanol 96 – 100 % (de préférence non dénaturé) pour créer les conditions de fixation du lysat pour préparer le Tampon de Lavage B5 (voir ci-dessous). Avant de débuter le protocole, préparer : La Protéinase K : ajouter le volume indiqué de tampon de protéinase PB (voir le tableau cidessous ou sur le flacon) pour dissoudre la Protéinase K. La solution de Protéinase K est stable à - 20 °C pendant 6 mois. • Tampon de lavage B5 : ajouter le volume indiqué d’éthanol 96 – 100 % (voir le tableau ci- dessous ou sur le flacon) au tampon B5 concentré. Conserver le tampon de lavage B5 à température ambiante (15 – 25 °C) pendant un an maximum. NucleoSpin® DNA FFPE XS 10 preps 740980.10 50 preps 740980.50 250 preps 740980.250 Tampon de lavage B5 (concentré) 6 mL Ajouter 24 mL d’éthanol 96 – 100 % 12 mL Ajouter 48 mL d’éthanol 96 – 100 % 50 mL Ajouter 200 mL d’éthanol 96 – 100 % Protéinase K (lyophilisée) 30 mg 75 mg 6 mg Ajouter 260 μL de Ajouter 1.35 mL Ajouter 3.35 mL tampon Protéinase PB tampon Protéinase PB tampon Protéinase PB REF 12 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 Purification d’ADN des échantillons FFPE 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin®DNA FFPE XS, portez des vêtements de protection appropriés (par exemple, une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne à l’adresse suivante : http ://www.mn-net.com/msds). Les déchets générés par le kit NucleoSpin®DNA FFPE XS n’ont pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du fort pouvoir dénaturant du tampon de lyse et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales. 4.1 Élimination des déchets Éliminer les substances dangereuses, potetiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique de manière sûre et conforme aux dispositifs réglementaires locales. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 13 Purification d’ADN des échantillons FFPE 5 Protocoles Le kits NucleoSpin® DNA FFPE XS est compatible avec deux méthodes différentes pour le déparaffinage des échantillons. L’une utilise le tampon Paraffin Dissolver (fourni dans le kit) et l’autre fait intervenir le xylène ou un solvant organique comparable (non fourni avec le kit). Les deux méthodes ont la même efficacité et performance. Déparaffinage avec le tampon Paraffin Dissolver : Paragraphe 5.1 Déparaffinage avec le xylène : Paragraphe 5.2 5.1 Purification de l’ADN des échantillons FFPE utilisant le tampon Paraffin Dissolver Avant de débuter la purification : • Vérifier que la Protéinase K et le Tampon B5 ont été préparés selon le chapitre 3. • Vérifier la disponibilité d’éthanol 96 – 100 %. • Régler le(s) incubateur(s) à 60 °C (dissolution de la paraffine) et 90 °C (déréticulation). Préparation de l’échantillon Déposer la(es) coupe(s) de tissus FFPE dans un micro tube. Pour les quantités de tissus appropriées, voir le paragraphe 2.4 14 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 Purification d’ADN avec le Paraffin Dissolver 1 Déparaffinage de l’échantillon Ajouter 400 μL de tampon Paraffin Dissolver à l’échantillon. Incuber 3 min à 60 °C (pour faire fonder la paraffine). Mélanger au vortex immédiatement (à vigoureusement pour dissoudre la paraffine. 60 °C) et Note : Dans l’idéal, utilisez un thermostat pour l’incubation ! Refroidir l’échantillon à température ambiante. + 400 μL Paraffin Dissolver 60 °C, 3 min Mélanger au vortex l’échantillon chaud Veiller à ce que la paraffine soit complètement fondue pendant l’étape d’incubation à chaud et bien mélanger après la dissolution pour dissoudre complètement la paraffine. Un mélange insuffisant de l’échantillon chauffé peut entraîner la réapparition de particules de paraffine solides. S’assurer que l’échantillon ne contient pas plus de 15 mg de paraffine ou ajuster le volume du dissolvant de paraffine (voir paragraphe 2.4). Pour les échantillons comprenant plus de 15 mg de paraffine, utiliser 30 μL de dissolvant de paraffine pour 1 mg de paraffine. Si plus de 400 μL de dissolvant de paraffine sont nécessaires, placer l’échantillon dans un tube de 2 mL (non fourni). MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 15 Purification d’ADN avec le Paraffin Dissolver 2 Lyse de l’échantillon Ajouter 100 μL de tampon FL. Mélanger au vortex vigoureusement. + 100 μL FL Vortexer Centrifuger à 11,000 x g pour 1 min Deux phases se forment : une phase inférieure (aqueuse) et une phase supérieure (organique). Le tissu de départ est transféré dans la phase inférieure (aqueuse). 11,000 x g, 1 min Optionnel : La phase organique supérieure peut être retirée et jetée après centrifugation. Pipeter 10 μL de solution de protéinase K directement dans la phase inférieure (aqueuse). Mélanger la phase aqueuse par pipetages successifs. (Ne mélanger par pipetage que la phase inférieure, aqueuse. Eviter de trop mélanger la phase inférieure à la phase supérieure) S’assurer que la protéinase K est bien mélangée au tampon de lyse. + 10 μL Protéinase K Mélanger par pipetages successifs (phase inférieure) Si plusieurs échantillons sont traités, il est recommandé de préparer un pré-mix de tampon FL / protéinase K. Ajouter 110 μL du pré-mix dans le tube, mélanger et centrifuger pour séparer les phases et assurer le transfert du tissu dans la phase aqueuse (inférieure). Mélanger la phase aqueuse à la pipette plusieurs fois pour disperser les tissus dans le tampon de lyse. Incuber à température ambiante pendant 3 heures pour lyser le tissu de l’échantillon. Si des particules résiduelles de tissu non lysé sont visibles après 3 heures, ajouter 10 μL supplémentaires de solution de protéinase K et poursuivre la digestion pendant 3 heures supplémentaires ou toute la nuit. Note : Le rendement de l’ADN amplifiable augmente généralement avec un temps de lyse prolongé. Pendant cette étape d’incubation, les protéines sont digérées et l’ADN est libéré dans la solution. Mélanger au vortex pendant 5 s. Régler le bloc chauffant à 90 °C. Etape de pause possible : à ce stade, la procédure peut être temporairement interrompue. En cas de pause, il est recommandé de conserver les échantillons à -20 °C. 16 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 TA, 3 heures Vortexer 5 s Purification d’ADN avec le Paraffin Dissolver 3 Décrosslink Ajouter 100 μL de tampon de décrosslink D-Link dans le tube et mélanger doucement au vortex pour mélanger le tampon D-Link dans la phase aqueuse (inférieure) Centrifuger à 11 000 x g pendant 30 s pour obtenir la séparation de phases. + 100 μL D-Link Vortexer 11,000 x g, 30 s Incuber à 90 °C pendant exactement 30 min. Mélanger au vortex 5 s et laisser refroidir à température ambiante (env. 2 min). Si nécessaire, centrifuger brièvement pour éliminer les gouttes du bouchon (environ 1 s à 1 000 x g). 90 °C, 30 min Vortexer Note : cette étape de déréticulation est nécessaire pour éliminer les liaisons chimiques (causées par la formaline) de l’ADN libéré en solution lors de l’étape de lyse précédente. L’ADN non réticulé est généralement plus performant dans les applications en aval. 4 Ajustement des conditions de fixation Ajouter 200 μL d’éthanol (96 – 100 %) dans le tube et mélanger au vortex (2 × 5 s). Centrifuger brièvement pendant 1 s à 1 000 x g pour obtenir la complète séparation des phases. Note : Éviter de centrifuger à une force x g beaucoup plus élevée, car l’acide nucléique pourrait précipiter. + 200 μL d’éthanol Vortexer 1,000 x g, 1s L’éthanol se retrouve dans la phase aqueuse (inférieure) uniquement. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 17 Purification d’ADN avec le Paraffin Dissolver 5 Fixation de l’ADN Pour chaque échantillon, prendre une colonne NucleoSpin® DNA FFPE XS (bague verte) placée dans un Tube Collecteur (2 mL). Charger la phase aqueuse (inférieure) Pipeter toute la phase aqueuse (inférieure) dans la colonne NucleoSpin® DNA FFPE XS. Il est recommandé de pipeter un volume de 450 μL sur la colonne, afin de s’assurer que la totalité de la phase aqueuse (inférieure) est transférée (le volume de la phase aqueuse est d’environ 410 μL). Un petit transfert de la phase organique (supérieure) n’a pas d’effet négatif sur la procédure de fixation. Centrifuger pendant 30 s à 2,000 x g. Si la solution ne passe pas complètement, centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g jusqu’à ce que la totalité de la solution passe dans la colonne. 2,000 x g, 30 s La vitesse de centrifugation recommandée de 2,000 x g est plus efficace qu’à 11,000 x g. Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la colonne dans un nouveau Tube Collecteur (2 mL). 6 Lavage et séchage de la membrane de silice + 400 μL B5 1er lavage Déposer 400 μl de Tampon NucleoSpin® DNA FFPE XS. B5 sur la colonne Centrifuger pour 30 s à 11,000 x g. Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la colonne dans un nouveau Tube Collecteur (2 mL). 11,000 x g, 30 s 2ième lavage Déposer 400 μl de Tampon NucleoSpin® DNA FFPE XS. B5 sur la colonne Centrifuger pour 2 min à 11,000 x g pour sécher la membrane. Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation exempt de nucléase (1,5 mL, non fourni). 18 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 + 400 μL B5 11,000 x g, 2 min Purification d’ADN avec le Paraffin Dissolver 7 Elution de l’ADN Déposer 20 μl de tampon BE directement au centre de la membrane de silice de la colonne. + 20 μL BE Le volume d’élution peut varier de 5 – 30 μl. Pour la corrélation entre le volume d’élution, la concentration d’ADN et le rendement, voir le paragraphe 2.4. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g. 8 11,000 x g, 30 s Optionnel : Eliminer l’éthanol résiduel Incuber la solution d’ADN éluée (20 μl) avec le bouchon ouvert pendant 8 min à 90 °C. 90 °C, 8 min Voir le paragraphe 2.7 pour des informations détaillées et recommandations concernant l’élimination des résidus d’éthanol. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 19 Purification d’ADN avec le xylène 5.2 Purification de l’ADN avec déparaffinage au Xylène Avant de débuter la purification : • Vérifier que la Protéinase K et le Tampon B5 ont été préparés selon le chapitre 3. • Vérifier la disponibilité d’éthanol 96 – 100 %. • Vérifier que le xylène (ou un réactif similaire*) est disponible pour le déparaffinage. • Régler le(s) incubateur(s) à 60 °C (dissolution de la paraffine) et 90 °C (déréticulation). Préparation de l’échantillon Déposer la(es) coupe(s) de tissus FFPE dans un micro tube. Pour les quantités de tissus appropriées, voir le paragraphe 2.4 1 Déparaffiner l’échantillon Ajouter à l’échantillon 1 mL de xylène (ou un réactif similaire*) Incuber à température ambiante jusqu’à ce que la paraffine soit complètement dissoute (généralement environ 2 min) et mélanger au vortex vigoureusement (10 s). S’assurer que la paraffine soit complètement dissoute. Centrifuger pendant 2 min à 11,000 x g. 1 mL xylène TA, 2 min Vortexer 11,000 x g, 2 min Eliminer le surnageant Eliminer le surnageant en pipettant. Ne pas prélever le culot. Ajouter 1 mL d’éthanol (96 – 100 %) sur le culot et mélanger au vortex (5 s). 1 mL d’éthanol Centrifuger pendant 2 min à 11,000 x g. Vortexer Eliminer le surnageant en pipettant. Ne pas prélever le culot. 11,000 x g, 2 min Eliminer le surnageant Incuber le tube ouvert à 60 °C pendant 3 – 10 min pour sécher le culot. Il est important d’évaporer tout résidu d’éthanol. L’éthanol résiduel peut réduire le rendement d’ADN. 60 °C, 3 – 10 min * Exemples d’alternatives au xylène : d-Limonène (par exemple, Roti®-Histol, Hemo-De) ou mélanges d’hydrocarbures isoparafiniques (par exemple, Roticlear®, Micro-ClearTM, Neo-Clear®). (par exemple, Roticlear®, Micro-ClearTM, Neo-Clear®). 20 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 Purification d’ADN avec le xylène 2 Lyse de l’échantillon Ajouter 100 μL de tampon FL et 10 µL de Protéinase K sur le culot. Mélanger au vortex vigoureusement (5 s). Si plusieurs échantillons sont extraits, il est recommandé de préparer un pré-mix Tampon FL / Protéinase K. Ajouter 110 μL du pré-mix au culot. + 100 μL FL + 10 μL Protéinase K Vortexer Centrifuger brièvement (env. 1 min à 1,000 x g). Les résidus solides des coupes collées aux parois doivent être récupérés dans la solution en pipetant. Homogénéiser les coupes dans le tampon en pipetant la solution plusieurs fois. Incuber à température ambiante pendant 3 heures pour lyser les échantillons de tissus. S’il persiste des résidus de tissus non lysés après 3 heures d’incubation, ajouter 10 µL de solution de Protéinase K et continuer la digestion pour 3 nouvelles heures ou toute une nuit. TA, 3 heures Note : le rendement d’ADN amplifiable augmente avec la durée de lyse. Pendant cette incubation, les protéines sont digérées et l’ADN est libéré en solution. Mélanger au vortex pendant 5 s. Etape de pause possible : à ce stade, la procédure peut être stoppée temporairement. Dans ce cas, nous recommandons de stocker les échantillons à -20 °C. Régler le bloc chauffant à 90 °C (pour l’étape suivante de déréticulation). 3 Décrosslink Ajouter 100 μL de Tampon Décrosslink D-Link au lysat et mélanger au vortex vigoureusement (5 s). + 100 μL D-Link Vortexer MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 21 Purification d’ADN avec le xylène Incuber à 90 °C pendant exactement 30 min. Mélanger au vortex pendant 5 s, laisser refroidir à température ambiante (environ 2 min). 90 °C, 30 min Si nécessaire, centrifuger brièvement pour collecter les gouttes du bouchon (environ 1 s à 1,000 x g) Note : cette étape de déréticulation est nécessaire pour éliminer les liaisons chimiques (modifications causées par la formaline) de l’ADN qui est libéré en solution lors de l’étape précédente de lyse. L’ADN non réticulé est généralement plus performant dans les applications en aval. 4 Ajustement des conditions de fixation Ajouter 200 μL d’éthanol (96 – 100 %) au lysat et mélanger au vortex (2 × 5 s). Centrifuger brièvement pour collecter les gouttes du bouchon (environ 1 s à 1,000 x g). 5 + 200 μL d’éthanol Vortexer Fixation des ADN Pour chaque échantillon, prendre une colonne NucleoSpin® DNA FFPE XS (bagues vertes) placée dans un Tube Collecteur. Charger le lysat Pipeter le lysat par aspiration-refoulement deux fois avant de charger le lysat. Charger le lysat sur la colonne. Centrifuger pendant 30 s à 2,000 x g. Si la solution ne s’écoule pas totalement, centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g jusqu’à ce que la solution complète passe dans la colonne. 2,000 x g, 30 s La vitesse de centrifugation recommandée de 2,000 x g est plus efficace qu’à 11,000 x g. Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la colonne dans un nouveau Tube Collecteur (2 mL) 6 Lavage et séchage de la membrane de silice + 400 μL B5 1er lavage Déposer 400 μl de Tampon B5 sur la colonne NucleoSpin® DNA FFPE XS. Centrifuger pour 30 s à 11,000 x g. Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la colonne dans un nouveau Tube Collecteur (2 mL). 22 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 11,000 x g, 30 s Purification d’ADN avec le xylène 2ième lavage Déposer 400 μl de Tampon B5 sur la colonne NucleoSpin® DNA FFPE XS. Centrifuger pour 2 min à 11,000 x g pour sécher la membrane. + 400 μl B5 11,000 x g, 2 min Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation exempt de nucléase (1,5 mL, non fourni). 7 Elution de l’ADN Déposer 20 μl de Tampon BE directement au centre de la membrane de silice de la colonne. + 20 μL BE Le volume d’élution peut varier de 5 – 30 μl. Pour la corrélation entre le volume d’élution, la concentration d’ADN et le rendement, voir le paragraphe 2.5. Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g. 8 11,000 x g, 30 s Optionnel : Eliminer l’éthanol résiduel Incuber la solution d’ADN éluée (20 μl) avec le bouchon ouvert pendant 8 min à 90 °C. 90 °C, 8 min Voir le paragraphe 2.7 pour des informations détaillées et recommandations concernant l’élimination des résidus d’éthanol. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 23 Purification d’ADN des échantillons FFPE 6 Annexes 6.1 Information sur la qualité et la quantité d’ADN En raison de la fixation des tissus, les acides nucléiques des échantillons FFPE sont couramment fragmentés et modifiés par le formaldéhyde. Ces modifications ne peuvent pas être détectées par des mesures standards de contrôle qualité, telles que les gels d’électrophorèse, la spectrophotométrie, la fluorométrie ou les analyses microfluidiques. Cependant, l’efficacité des réactions enzymatiques (ex. PCR) avec cet ADN modifié est significativement réduite. Les méthodes d’analyse et les applications de cet ADN sont par exemple : • Spectrophotométrie (ex. mesures de l’absorption A₂₃₀, A₂₆₀, A₂₈₀) • Fluorométrie (ex. RiboGreen®) • Electrophorèse sur gel d’agarose denaturant • Analyses microfluidiques (ex Bioanalyzer Agilent 2100, Experion de BioRad) • PCR • Analyses de Puces à ADN (ex. microarray) Les points suivants sont à considérer pour les méthodes listées précédemment, en particulier lors de la comparaison de l’efficacité de différentes méthodes d’extraction et de déréticulation de l’ADN ou des performances de l’ADN purifié dans les applications : • Un rendement d’ADN élevé déterminé par mesure de l’A₂₆₀ ou par fluorescence (ex. PicoGreen®) n’aboutit pas systématiquement à une bonne performance de l’ADN dans la PCR, l’ADN peut être hautement dégradé (ex. fragments de taille plus faible que la cible de le PCR) ou insuffisamment déréticulé. • Un rendement faible ou nul d’ADN déterminé par mesure de l’A₂₆₀ aboutira probablement à de faibles résultats en PCR, mais il est tout de même possible d’obtenir de bons résultats. Il se peut qu’une petite quantité d’ADN suffisamment déréticulé présente une bonne réactivité. • Un ADN de haut poids moléculaire ne garantit pas une bonne amplification en PCR ou une bonne réactivité dans d’autres réactions enzymatiques. L’ADN, bien que de haut poids moléculaire, peut être insuffisamment déréticulé. • Un ADN de faible poids moléculaire, par ex. très dégradé, avec des fragments en deçà de 200 nucléotides uniquement, ne permettra certainement pas l’amplification de fragments de taille supérieure. Mais de petites séquences cibles (ex. 80 – 150 bp) peuvent être amplifiables, en particulier si l’ADN est bien déréticulé. Ni le rendement d’ADN, ni le poids moléculaire, ni les ratios d’absorbance, ou la distribution de taille de l’ADN ne peuvent prédire les performances des PCR en aval, particulièrement lors de la comparaison de différents systèmes de purification et de déréticulation. L’indicateur majeur de qualité de l’ADN extrait à partir d’un échantillon FFPE est sa performance dans les applications souhaitées. 24 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 Purification d’ADN des échantillons FFPE 6.2 Guide de résolution des problèmes Problème Causes possible et suggestions L’ADN est dégradé, rendement d’ADN nul. Mauvaise qualité de l’échantillon • La qualité de l’échantillon a un impact important sur la quantité et la qualité de l’ADN. Mauvaise utilisation ou préparation des réactifs • Réactifs mal préparés. Ajouter le volume indiqué d’éthanol au tampon B5 concentré et mélanger. Reconstituer et conserver la Protéinase K selon les instructions données au paragraphe 3. • L’échantillon et les réactifs n’ont pas été bien homogénéisés. Mélanger au vortex vigoureusement après l’ajout de chaque réactif. • Ajout d’éthanol omis après la lyse. La fixation de l’ADN à la membrane de silice est effective uniquement en présence d’éthanol. Stockage du kit Mauvaise qualité ou mauvais rendement en ADN • Reconstituer et conserver la Protéinase K selon les instructions données au paragraphe 3. • Conserver les composants du kit tel que mentionné dans le paragraphe 3. • Garder les flacons de tampons bien fermés afin de prévenir toute évaporation ou contamination. Force ionique et pH influence la mesure de l’absorbance A₂₆₀ ainsi que le ratio A₂₆₀ / A₂₈₀ • Pour les mesures de l’absorbance, utiliser du Tris/HCl 5mM pH 8,5 comme diluant. Voir aussi : - Manchester, K. L. 1995. Value of A₂₆₀/A₂₈₀ ratios for measurement of purity of nucleic acids. Biotechniques 19, 208 – 209. - Wilfinger, W. W., Mackey, K. and Chomczyski, P. 1997. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques 22, 474 – 481. Durée de la digestion Protéinase K • En fonction de la nature de l’échantillon, la durée optimale de digestion, comprise entre 3 et 16 heures doit être déterminée empiriquement. S’il subsiste des résidus de tissus non lysés après 3 h, prolonger l’incubation jusqu’à 16 heures. Après les 3 premières heures d’incubation, de la protéinase K supplémentaire peut être ajoutée à l’échantillon. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 25 Purification d’ADN des échantillons FFPE Problème Colmatage de la colonne NucleoSpin® DNA FFPE XS / mauvais rendement ou qualité de l’ADN Causes possible et suggestions Echantillon de départ • Quantité d’échantillon utilisée trop élevée. La surcharge de la colonne peut entraîner une chute du rendement d’ADN. Réduire la quantité d’échantillon ou utiliser des volumes supérieurs de tampon Paraffin Dissolver et / ou de tampon de lyse FL. • Digestion et/ou homogénéisation de l’échantillon de départ insuffisante. Mener une incubation pendant une nuit, si le tissu n’est pas totalement digéré après 3 heures. Contamination par l’éthanol ou des sels Performance de l’ADN dans les expériences en aval • Ne pas laisser le filtrat entrer en contact avec l’extrémité inférieure de la colonne après le second lavage au tampon B5. S’assurer de centrifuger pendant la durée et la vitesse recommandées afin d’éliminer totalement le tampon B5. • Vérifier que le tampon B5 a été remis à température ambiante avant utilisation. Le lavage à plus faible température diminue l’efficacité de l’élimination des sels par le tampon B5. • En fonction de la robustesse du système de PCR utilisé, la PCR peut être inhibée si la quantité de solution d’ADN purifié utilisée est trop importante. Utiliser comme matrice de PCR un volume de solution d’ADN élué moindre. Stocké les ADN purifiés convenablement • Pour une stabilité optimale, l’ADN élué doit toujours être conservé sur la glace afin de prévenir sa dégradation par de possibles traces de DNases. Abrasion de la silice de la membrane • Divergence entre la quantification par mesure de A₂₆₀ et par PCR 26 En raison du contenu en ADN généralement faible des petits échantillons FFPE, résultant en un faible rendement total d’ADN extrait, la quantification de l’ADN par mesure de l’absorbance A₂₆₀ est souvent altérée en raison de la faible sensibilité de ce type de mesure. Lorsque les mesures effectuées sont proches de la limite de détection du spectrophotomètre, la mesure peut être influencée par de minimes quantités d’abrasion de silice. Afin de se prémunir des mesures de A₂₆₀ et donc de quantifications incorrectes des petites quantités d’ADN, centrifuger les éluats pendant 30 s à 11 000 x g et prélever un aliquote dénué de tout sédiment pour la mesure. Alternativement, utiliser une méthode de quantification insensible à l’abrasion de la silice (ex. Picrogreen®). MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 Purification d’ADN des échantillons FFPE Problème Causes possible et suggestions Mesure hors de la plage de la limite de détection du photomètre Ratio A₂₆₀/A₂₈₀ incohérent 6.3 • Afin d’obtenir un ratio A₂₆₀ / A₂₈₀ significatif, il est nécessaire que les valeurs initiales de A₂₆₀ et A₂₈₀ soient significativement au-delà de la limite de détection du spectrophotomètre. Une valeur de A₂₆₀ proche du bruit de fond du spectrophotomètre entraînera un ratio A₂₆₀ / A₂₈₀ incohérent. Informations de commande Produit NucleoSpin® DNA FFPE XS REF Conditionnement 740980.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 ® 740982.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 ® NucleoSpin totalRNA FFPE XS 740969.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin® Tissue XS 740901.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 Paraffin Dissolver 740968.25 25 mL Paraffin Dissolver blue 740343.60 60 mL Tubes Collecteurs (2 mL) 740600 1000 Tampon de Décrosslink D-Link 740979.30 30 mL NucleoSpin totalRNA FFPE Visitez notre site web www.mn‑net.com pour des informations plus détaillées. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 27 Purification d’ADN des échantillons FFPE 6.4 Restrictions d’utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04 Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tel. : +49 24 21 969‑333 support@mn-net.com Marques déposées : DyNAmo est une marque déposée de Finnzymes Oy LighCycler est une marque déposée d’un membre du groupe Roche Micro-Clear est une marque déposée de Micron Environmental Industries Neo-Clear est une marque déposée de Merck KGaA NucleoSpin® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG RiboGreen et PicoGreen est une marque déposée de Molecular Probes Inc. Roticlear est une marque déposée de CARL ROTH GmbH & Co KG Roti est une marque déposée de CARL ROTH GmbH & Co KG SYBR est une marque déposée de Molecular Probes, Inc. Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur fonctionnement. 28 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05 Plasmid DNA Clean up RNA DNA Viral RNA and DNA Protein High throughput Accessories Auxiliary tools www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 info@mn-net.com CH +41 62 388 55 00 sales-ch@mn-net.com FR +33 388 68 22 68 sales-fr@mn-net.com US +1 888 321 62 24 sales-us@mn-net.com
Fonctionnalités clés
- Extraction d’ADN FFPE
- Procédure rapide
- Haute concentration d’ADN
- Elution en faible volume
- Décrosslink efficace
Manuels associés
Réponses et questions fréquentes
Quel est le volume d’élution par défaut du kit NucleoSpin® DNA FFPE XS, Micro kit ?
Le volume d’élution par défaut est de 20 μL, mais il est possible d’utiliser des volumes d’élution encore plus faibles, jusqu’à 5 μL, pour augmenter la concentration d’ADN.
Quelles sont les quantités de tissus FFPE que je peux utiliser avec ce kit ?
Le protocole standard permet la préparation de l’ADN à partir d’environ 15 mg de paraffine, ce qui correspond à environ 7 sections de 10 μm d’épaisseur et une surface de 250 mm². Vous pouvez utiliser des quantités plus importantes de paraffine en modifiant le protocole.
Comment éliminer les traces d’éthanol résiduelles dans la fraction d’élution ?
Une incubation à chaud (90 °C pendant 8 min) de l’éluat est recommandée si la solution d’ADN représente plus de 20 % du volume final de PCR. Cela permet d’éviter l’inhibition de réactions sensibles en aval.