Macherey-Nagel NucleoMag RNA/DNA Pro, kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
Manuel
d’utilisation
User manual
Extraction d’ARN
n NucleoMag® RNA Pro
n NucleoMag® RNA/DNA Pro
Janvier 2025 / Rev. 02
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Extraction d’ARN
Sommaire
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, équipements et consommables à fournir par l’utilisateur
5
1.3 A propos de ce manuel
6
2 Description du produit
7
2.1 Principe général
7
2.2 Caractéristiques du kit
7
2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons
8
2.4 Systèmes de séparation magnétique
9
2.5 Réglage des paramètres d’agitation
10
2.6 Manipulation des billes
10
2.7 Procédures d’élution
11
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
12
4 Instructions de sécurité
14
4.1 Elimination des déchets
14
5 Protocole pour l’extraction d’ARN à partir de cellules et de tissus
15
6 Protocole pour l’extraction d’ARN à partir de matériel végétal
21
7 Protocole pour l’extraction de l’ARN et de l’ADN dans des éluats séparés
27
8 Annexes
30
8.1 Guide de résolution des problèmes
30
8.2 Informations de commande
32
8.3 Restrictions d’utilisation du produit / ​garantie
33
8.4 Versions linguistiques et prédominance
33
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
3
Extraction d’ARN
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoMag® RNA Pro
NucleoMag® RNA/DNA Pro
REF
1 × 96 preps
744360.1
4 × 96 preps
744360.4
1 × 96 preps
744370.1
NucleoMag® B-Beads
2 × 1.5 mL
6 × 1.5 mL
2 × 1.5 mL
Tampon de lyse MRL
60 mL
250 mL
60 mL
Tampon de fixation
MRB
80 mL
400 mL
80 mL
Tampon de lavage
MRW
125 mL
400 mL
125 mL
Tampon d’élution
MRE*
30 mL
125 mL
30 mL
Agent réducteur TCEP
1 flacon
(107 mg / ​flacon)
4 flacons
(107 mg / ​flacon)
1 flacon
(107 mg / ​flacon)
rDNase, lyophilisée**
3 flacons (taille
D)
12 flacons (taille
D)
3 flacons (taille D)
Tampon de réaction
pour la rDNase
30 mL
2 × 60 mL
30 mL
H2O RNase-free
13 mL
30 mL
13 mL
Tampon de
lavage DNA Wash
(concentré)**.
2 × 12 mL
Tampon d’élution DNA
Elute
Notice d’utilisation
12 mL
1
1
* Tampon d’élution MRE : Eau RNase-free
** Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3.
4
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
1
Extraction d’ARN
1.2
Réactifs, équipements et consommables à fournir par
l’utilisateur
Equipements et consommables
Produit
REF
Conditionnement
Système de séparation magnétique
p.e., NucleoMag® SEP (voir le paragraphe 2.3).
744900
1
Plaque de séparation pour la séparation des billes
magnétiques,
p.e., Square-well Block (bloc 96 puits avec des puits
carrés de 2.1 mL)
740481
740481.24
4
24
Tubes de lyse pour l’incubation des échantillons et
la lyse,
p.e., Rack of Tubes Strips (1 set comprend 1 Rack, 12
barrettes de 8 bouchons chacune (puits de 1,2 mL) et
12 Cap Strips)
740477
740477.24
4 sets
24 sets
Plaque d’élution pour la collecte d’acides
nucléiques purifiés,
p.e., plaque d’élution à fond en U (microplaque 96 puits
avec des puits à fond en U de 300 μL)
p.e., plaque d’élution à fond plat (microplaque 96 puits
avec des puits à fond plat de 300 μL)
740486.24
24
Pour l’extraction d’ARN à partir de matériel végétal :
Tampon de lyse RL1
740385.125
125 mL
NucleoSpin® DNA/RNA Buffer Set pour la
purification en parallèle de l’ARN et de l’ADN dans
des éluats séparés : Tampon d’élution DNA Elute,
Tampon de lavage DNA Wash.
740944
100 preps
Pour l’utilisation du kit sur l’instrument KingFisher®
Flex :
p.e. 96-well Accessory Kit B (Square-well Blocks,
Deep-well tip combs, plaques d’élution pour 4 ×
96-preps NucleoMag® RNA (Pro) avec le KingFisher®
Flex platform)
744951
1 sets
Pour l’utilisation du kit sur le MagnetaPure 32 Plus
ou l’IsoPure Mini :
Plaques 96 Deep-well pour les systèmes à barreaux
magnétiques
744955
25
Pour l’utilisation du kit sur le MagnetaPure 32 Plus
ou l’IsoPure Mini :
Peignes Tip combs 8-positions pour les systèmes à
barreaux magnétiques
744960
50
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
5
Extraction d’ARN
1.3
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs de lire les paragraphes détaillés du
protocole du kit NucleoMag® RNA Pro / ​NucleoMag® RNA / ​DNA Pro avant d’utiliser ce
produit. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le
résumé du protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil de suivi des étapes
pour l’exécution de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible en ligne à l’adresse suivante :
www.mn-net.com.
6
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
Extraction d’ARN
2
Description du produit
2.1
Principe général
La procédure du NucleoMag® RNA Pro ainsi que celle du NucleoMag® RNA/DNA Pro est
basée sur l’adsorption réversible des acides nucléiques sur des billes paramagnétiques dans des
conditions de tampons appropriées. La lyse des échantillons est réalisée par homogénéisation
dans une solution contenant des ions chaotropiques. Pour ajuster les conditions dans lesquelles
les acides nucléiques se lient aux billes paramagnétiques, des solvants à base d’alcool et les
NucleoMag® B-Beads sont ajoutés au lysat. Les contaminants et les sels sont éliminés à l’aide
du tampon de lavage MRW et d’éthanol à 70 %. Après la séparation magnétique, les billes
paramagnétiques sont incubées avec une DNase recombinante pour éliminer l’ADN copurifié.
Après une étape de re-fixation de l’ARN, une dernière étape de lavage est effectuée avec de
l’éthanol à 70 %. L’éthanol résiduel de l’étape de lavage est éliminé par séchage à l’air. Enfin,
l’ARN très pur est élué avec le tampon d’élution et l’ARN peut être directement utilisé pour des
applications avales. En combinaison avec le NucleoSpin® RNA/DNA Buffer Set ainsi qu’avec
le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro, il est également possible d’extraire l’ARN et l’ADN du même
échantillon dans des fractions séparées. Le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro est identique au kit
NucleoMag® RNA Pro mais contient en plus les tampons pour extraire l’ADN dans une fraction
séparée. Les deux kits peuvent être utilisés manuellement ou de manière automatisée sur des
robots pipeteurs ou avec des systèmes à aimant.
Nous pouvons fournir une assistance personnalisée, des informations sur les protocoles ou
des programmes vérifiés pour de nombreuses plateformes. Pour plus d’informations, veuillez
contacter notre support technique ou visiter le site www.mn-net.com/automation.
2.2
Caractéristiques du kit
Le NucleoMag® RNA Pro ainsi que le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro sont conçus pour la
préparation rapide, manuelle et automatisée à petite échelle d’ARN très pur à partir de 20 mg
de tissu ou de 2 × 10⁶ cellules ainsi que de 40 mg de feuilles végétales. Le kit est conçu pour
être utilisé avec la plaque de séparation magnétique NucleoMag® SEP (voir informations de
commande, 8.2) ou d’autres systèmes de séparation magnétique (voir paragraphe 2.4). La
durée de la procédure manuelle pour la préparation de 96 échantillons est d’environ 120 minutes
ou d’environ 90 minutes avec un système automatisé à barreaux magnétiques. L’ARN purifié
peut être utilisé directement comme matrice pour la RT-PCR ou tout autre type de réaction
enzymatique.
Les deux kits permettent une automatisation facile sur les instruments courants de manipulation
des liquides ou les systèmes de séparation magnétique automatisés, par exemple les instruments
MagnetaPure32 Plus, IsoPure Mini ou Thermo Fisher Scientific KingFisher®instrurments.
Le temps de préparation réel dépend de la configuration de l’instrument et du système de
séparation magnétique utilisé.
Réserver à l’usage de la recherche.
Grâce à la DNase recombinante fournie avec le kit, l’ARN élué est pratiquement exempt d’ADN.
Le kit fournit des réactifs pour la purification d’un maximum de 60 μg d’ARN pur à partir
d’échantillons appropriés. En fonction du volume d’élution utilisé, des concentrations de 10 à
600 ng/μL peuvent être obtenues.
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
7
Extraction d’ARN
Le kit NucleoMag® RNA Pro ainsi que le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro est entièrement
utilisable à température ambiante.
Pour plus d’informations, visitez notre site web :
www.mn-net.com/bioanalytik/htp-information
Chez MN, nous vous proposons des scripts pour différentes plateformes. Il vous suffit de nous
contacter et nous vous ferons parvenir le script. Si vous êtes à la recherche de solutions plus
personnalisées, nous pourrons également vous aider. Il vous suffit de nous contacter et nous
ferons en sorte que l’automatisation soit pour vous une expérience agréable grâce à notre
soutien.
2.3
Manipulation, préparation et stockage des échantillons
Environnement de travail
Maintenir un environnement de travail exempt de RNases. Porter des gants à tout moment
pendant la préparation. Changer de gants fréquemment
Stockage des échantillons et inhibition des RNases
Les RNases peuvent dégrader rapidement l’ARN contenu dans les échantillons si ces derniers
ne sont pas protégés de l’activité des RNases après la récolte. Les méthodes suivantes sont
recommandées pour éviter la dégradation de l’ARN :
•
Utiliser un échantillon fraîchement récolté pour une lyse immédiate et une purification de
l’ARN.
•
Immerger et conserver les échantillons dans la solution de stabilisation NucleoProtect®
RNA ou des solutions similaires. Veiller à ce que l’échantillon soit complètement
imprégné de la solution de stabilisation avant de le congeler. Retirer l’excès de solution
de stabilisation de l’échantillon avant l’extraction de l’ARN conformément au manuel
d’utilisation de la solution de stabilisation.
•
Congeler rapidement l’échantillon dans de l’azote liquide immédiatement après la
récolte et le conserver à une température comprise entre -70 et -80 °C. Les échantillons
congelés sont stables jusqu’à 6 mois. Un mortier et un pilon peuvent être utilisés pour
réduire l’échantillon congelé à l’état de poudre. Veiller à ce que l’échantillon ne soit pas
décongelé avant d’entrer en contact avec le tampon de lyse.
•
Conserver les échantillons dans le tampon de lyse MRL ou RL1 après broyage à -70 / ​
- 80 °C jusqu’à un an, à 4 °C jusqu’à 24 heures ou à température ambiante jusqu’à
quelques heures. Les échantillons congelés dans le tampon de lyse MRL ou RL1 doivent
être décongelés lentement avant de commencer l’extraction de l’ARN.
8
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
Extraction d’ARN
2.4
Systèmes de séparation magnétique
Pour l’utilisation du NucleoMag® RNA Pro ainsi que du kit NucleoMag® RNA/DNA Pro, il est
recommandé d’utiliser le système de séparation magnétique NucleoMag® SEP. La séparation
est effectuée dans un Square-well Block (voir informations de commande, paragraphe 8.2).
Le kit peut également être utilisé avec d’autres systèmes de séparation magnétique. Voir les
informations de commande du fabricant pour connaître les plaques de séparation appropriées.
Séparateur magnétique
Plaque ou tube de séparation
NucleoMag® SEP (MN REF 744900)
Bloc 96 puits carrés - Square-well Block (MN
REF 740481/.24)
Tecan Te-MagS™
Tubes de 1,5 mL sans bouchons (Sarstedt)
Séparation à aimants statiques
Pour les séparateurs à aimants statiques, comme par exemple notre NucleoMag® SEP (une
utilisation manuelle ou sur robot pipeteur), leur utilisation est recommandée avec un agitateur
de microplaques approprié pour une remise en suspension optimale des billes pendant les
étapes de lavage et d’élution. Alternativement, les billes peuvent être remises en suspension
dans le tampon par pipetages successifs. Pour une utilisation entièrement automatisée sur
un automate de pipetage, un bras « gripper » est nécessaire pour le transfert des plaques de
séparation de l’aimant vers l’agitateur et inversement.
Systèmes à aimants mobiles
Les séparateurs à aimants mobiles font bouger les aimants d’un côté à l’autre des puits,
entrainant ainsi les billes à travers les solutions de lavage et d’élution. La séparation magnétique
a lieu lors de l’arrêt des aimants.
Séparateurs automatisés
Ces séparateurs transfèrent les billes dans les différents tubes ou plaques. Les billes sont
remises en suspension dans les solutions par rétractation des aimants à l’intérieur de leur
protection. Après chaque étape de fixation, de lavage ou d’élution, les billes sont collectées et
transportées dans le tube ou plaque correspondant à la solution suivante.
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
9
Extraction d’ARN
2.5
Réglage des paramètres d’agitation
Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques pour les étapes de lavage et d’élution, les
paramètres d’agitation doivent être ajustés avec soin pour chaque plaque de séparation et
chaque agitateur afin d’éviter toute contamination croisée d’un puits à l’autre. Procéder comme
suit :
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour les étapes de lavage :
•
Déposer 900 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque
sur l’agitateur et commencer à agiter à une vitesse modérée pendant 30 secondes.
Éteindre l’agitateur et vérifier la présence de petites gouttelettes d’eau colorée à la surface
de la plaque.
•
Augmenter la vitesse d’agitation et agiter pendant 30 secondes supplémentaires et vérifier
à nouveau la présence de gouttelettes à la surface de la plaque.
•
Continuer à augmenter la vitesse d’agitation jusqu’à observer des gouttelettes sur le
dessus de la plaque de séparation. Réduire ensuite la vitesse, vérifier l’absence de
projection et utiliser ce réglage pour les étapes de lavage.
Réglage de l’agitation pour l’étape d’élution :
•
Déposer 100 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation et procéder
comme décrit ci-dessus.
2.6
Manipulation des billes
Distribution des billes
Une distribution homogène des billes magnétiques dans les différents puits de la plaque
de séparation est essentielle pour assurer une grande cohérence d’un puits à l’autre. Par
conséquent, avant de distribuer les billes, s’assurer que les billes sont complètement remises
en suspension. Bien agiter le flacon de stockage ou le placer brièvement sur un vortex. Le
fait de mélanger au préalable les billes magnétiques avec le tampon de fixation permet une
distribution plus homogène des billes dans les différents puits de la plaque de séparation.
Lors de l’automatisation, une étape de mélange des billes et du tampon de fixation dans les
réservoirs avant leur distribution dans les plaques de séparation est recommandée afin de
s’assurer que les billes demeurent bien en suspension.
Durée de séparation magnétique
L’attraction des billes magnétiques sur les aimants dépend de la force magnétique des aimants,
de la plaque de séparation choisie, de la distance entre la plaque de séparation et les aimants
ainsi que du volume présent dans les puits. La durée de récupération des billes sur les aimants
doit être vérifiée et ajustée pour chaque système. Il est recommandé d’utiliser les plaques de
séparation ou les tubes spécifiés par le fournisseur du séparateur magnétique.
Lavage des billes
Le lavage des billes peut être réalisé par agitation ou par pipetage. Contrairement au mélange
par pipetages successifs, le mélange sur agitateur ou magnétique permet de mélanger
simultanément tous les échantillons. Cela permet de réduire le temps et le nombre de cônes
nécessaires à la préparation. La remise en suspension par pipetages successifs est cependant
plus efficace que l’agitation de la plaque ou l’agitation magnétique.
10
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
Extraction d’ARN
Méthode
Efficacité de
la remise en
suspension
Vitesse
Nombre de cônes
nécessaires
Mélange magnétique
+
++
Faible
Agitateur
++
++
Faible
Pipetage
+++
+*
Haut
+ : acceptable, ++ : bon, +++ : excellent, * Dispositif de pipetage à 8 canaux
2.7
Procédures d’élution
L’ARN purifié peut être élué directement avec le tampon d’élution MRE fourni. L’élution peut être
effectuée dans un volume ≥ 50 μL. Il est essentiel de recouvrir complètement les NucleoMag®
B-Beads avec le tampon d’élution MRE pendant l’étape d’élution. Le volume minimal nécessaire
dépend du système de séparation magnétique (p.e., la position du culot dans les puits de
la plaque de séparation). Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être
entièrement remis en suspension dans le tampon d’élution MRE. Avec certains séparateurs
magnétiques, le volume d’élution nécessaire pour recouvrir les billes peut être plus important.
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
11
Extraction d’ARN
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention : Les tampons MRL et MRW contiennent des sels chaotropiques ! Porter des gants
et des lunettes de protection !
ATTENTION : Les tampons MRL et MRW contiennent du thiocyanate de guanidinium qui peut
former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite
de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de
préparation des échantillons.
•
Tous les composants du NucleoMag® RNA Pro ainsi que du NucleoMag® RNA/DNA
Pro doivent être conservés à une température comprise entre 15 et 25 °C et sont stables
jusqu’à : voir l’étiquette du kit.
•
Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi.
Avant de démarrer la procédure NucleoMag® RNA Pro / ​NucleoMag® RNA/DNA Pro,
préparer ce qui suit :
•
Solution de travail de la rDNase : Ajouter 800 μL de H2O RNase-free à chaque
flacon de rDNase et incuber pendant 1 min à température ambiante. Agiter doucement
les flacons pour dissoudre complètement la rDNase. Veiller à ne pas mélanger
vigoureusement la rDNase car elle est sensible à l’agitation mécanique. Si elle n’est pas
complètement utilisée, cette solution de travail peut être conservée à -20 °C pendant au
moins 6 mois. Ne pas congeler / ​décongeler la solution de travail de rDNase plus de trois
fois.
•
Mélange réactionnel pour la rDNase : Ajouter 9,2 mL de tampon de réaction rDNase
à 800 μL de solution de travail de la rDNase et mélanger. Le mélange réactionnel obtenu
est suffisant pour 32 extractions et est à utiliser rapidement. Lors de séries inférieures
à 32 échantillons, préparer un volume plus petit de mélange réactionnel. Pour chaque
extraction, mélanger 276 µL de tampon de réaction et 24 µL de solution de rDNase.
•
Agent réducteur TCEP : ajouter 750 μL d’H2O RNase-free au flacon de TCEP et incuber
pendant plusieurs minutes à 15 – 25 °C. Mélanger le flacon pour dissoudre complètement
le TCEP. Conserver le TCEP dissous à -20 °C.
•
Le tampon de lavage DNA Wash est fourni sous forme concentrée. Pour préparer
la solution finale du tampon de lavage, ajouter quatre volumes d’éthanol (50 %) au
concentré de tampon DNA Wash (ajouter 48 mL d’éthanol 50 % à 12 mL de concentré
du DNA Wash).
•
éthanol à 70 % (v/v) pour les étapes de lavage
•
éthanol à 100 % pour l’étape de fixation du protocole d’extraction d’ARN à partir de
matériel végétal (voir paragraphe 6)
12
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
Extraction d’ARN
NucleoMag® RNA Pro / ​NucleoMag® RNA/DNA Pro
REF
rDNase
(lyophilisée)
TCEP
Tampon
de lavage
DNA Wash
(concentré)
1 × 96 preps
744360.1
4 × 96 preps
744360.4
1 × 96 preps
744370.1
3 flacons (taille D)
12 flacons (taille D)
3 flacons (taille D)
Ajouter 800 μL d’H2O
RNase-free dans
chaque flacon.
Ajouter 800 μL d’H2O
RNase-free à chaque
flacon.
Ajouter 800 μL d’H2O
RNase-free à chaque
flacon.
1 flacon (107 mg)
4 flacons (107 mg)
1 flacon (107 mg)
Ajouter 750 μL d’H2O
RNase-free.
Ajouter 750 μL d’ H2O
RNase-free à chaque
flacon.
Ajouter 750 μL d’H2O
RNase-free.
-
-
2 × 12 mL
Ajouter 48 mL
d’éthanol (50 %) dans
chaque flacon.
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
13
Extraction d’ARN
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® RNA Pro / ​NucleoMag® RNA/DNA Pro,
portez des vêtements de protection appropriés (p.e. blouse de laboratoire, gants jetables et
lunettes de protection). Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité
appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds).
Attention : Le thiocyanate de guanidine contenu dans les tampons de lyse MRL et MRW peut
former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné à de l’eau de Javel ! Par conséquent,
n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation
d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoMag® RNA Pro / ​NucleoMag® RNA/DNA Pro n’ont
pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des
déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est très improbable en raison du tampon de
lyse fortement dénaturant, mais elle ne peut pas être totalement exclue. Par conséquent, les
déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés
conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
14
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
NucleoMag® RNA Pro
5
Protocole pour l’extraction d’ARN à partir de
cellules et de tissus
Résumé du protocole
•
Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les
paragraphes 1.2 et 2.4, respectivement.
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 18.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
Homogénéiser / ​ lyser
les échantillons
Jusqu’à 20 mg de tissu
ou 2 × 10⁶ cellules
350 μL MRL
6 μL TCEP
Mélanger ou utiliser un
broyage mécanique
2
3
Clarifier le lysat
par centrifugation,
transférer 350 μL de
lysat clarifié dans un
Square-well Block pour
la suite de la procédure.
Fixer les acides
nucléiques aux
NucleoMag® B-Beads
5 600 x g,
5 min
350 μL de lysat clarifié
20 μL NucleoMag® B-Beads
250 μL MRB
Mélanger par agitation
pendant 5 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages
succcessifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
4
Laver avec le tampon
MRW
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
900 μL MRW
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
15
NucleoMag® RNA Pro
Remettre en suspension : Agiter
5 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
5
Laver avec le tampon à
70 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
900 μL Ethanol 70 %
Remettre en suspension : Agiter
5 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
Sécher pendant 5 min à TA
6
Digérer l’ADN
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
300 μL de mélange réactionnel
rDNase
Mélanger
Incuber 15 min à TA
7
Re-fixer les ARN
350 μL MRB
Mélanger par agitation
pendant 5 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
16
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
NucleoMag® RNA Pro
8
Laver avec le tampon à
70 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
900 μL Éthanol 70 %
Remettre en suspension : Agiter
5 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
9
Sécher l’échantillon
Laisser le Square-well Block
sur le NucleoMag® SEP
Sécher à l’air 10 – 15 min à TA
10
Eluer l’ARN
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
50 – 200 μL MRE
Agiter 5 – 10 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages successifs)
Séparer 2 min et transférer
l’ARN dans une plaque
d’élution / ​des​ tubes
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
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NucleoMag® RNA Pro
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple,
NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.4). Il est recommandé
d’utiliser un Square-well Block pour la séparation (voir paragraphe 1.2). Alternativement,
l’extraction de l’ARN peut être effectuée dans des tubes de réaction avec des séparateurs
magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de guide
pour l’adaptation du kit aux instruments automatisés.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
Homogénéiser / ​lyser les échantillons
Lyser jusqu’à 20 mg de tissu ou 2 × 10⁶ cellules dans 350 μL de tampon MRL +
6 µL TCEP.
Pour les échantillons de tissus : utiliser un système d’homogénéisation adapté pour
homogénéiser les échantillons dans le tampon MRL. Les échantillons peuvent être
broyés à l’aide d’outils d’homogénéisation à billes, par exemple GenoGrinder* ou
Mixer Mill MM400** (voir les recommandations du fabricant de l’instrument pour les
plaques ou les tubes appropriés à l’homogénéisation) ou tout autre système
d’homogénéisation approprié.
Pour les cellules : ajouter le tampon MRL au culot cellulaire. Pipeter successivement
plusieurs fois pour lyser les cellules.
2
Clarifier les lysats
Centrifuger les échantillons pendant 5 min à pleine vitesse (5 600 – 6 000 x g). Retirer
les barrettes de 8 bouchons.
Transférer 350 μL du lysat clarifié dans un Square-well Block. Ne pas souiller les
bords du puits.
Note : Voir les recommandations concernant les plaques / ​
tubes adaptés et les
séparateurs magnétiques compatibles au paragraphe .
* GenoGrinder : http://www.spexcsp.com/sampleprep/
** Mixer Mill MM400 http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/mm-400/
18
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
NucleoMag® RNA Pro
3
Fixier les acides nucléiques aux NucleoMag® B-Beads
Ajouter 20 µL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 250 µL de
tampon MRB à l’échantillon lysé. Mélanger par agitation pendant 5 min à température
ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et laisser incuber pendant 5 min à
température ambiante. Les billes NucleoMag® B-Beads et le tampon MRB peuvent
être mélangés au préalable.
Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer du flacon
de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à l'obtention d’une
suspension homogène.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce
que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à
l’aide d’une pipette. Éliminer complètement le surnageant.
Note : Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’aspiration du surnageant. Le
culot de billes n’est pas visible à cette étape. Eliminer le surnageant en pipetant de
l’autre côté du puits.
4
Laver avec le tampon MRW
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL de tampon MRW dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min).
Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois).
Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
5
Laver avec le tampon à 70 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement,
remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant
1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Maintenir le Square-well
Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape de séchage.
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
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NucleoMag® RNA Pro
6
Digérer l’ADN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter
300 μL de mélange réactionnel rDNase et remettre les billes en suspension par
pipetages successifs. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Ne pas
séparer les billes !
Note : Si vous souhaitez isoler l’ARN et l’ADN dans le même éluat, il faut omettre l’étape
de séchage de l’étape 5 du protocole ainsi que la digestion de l’ADN et poursuivre le
protocole à l’étape 8 avec le 2ième lavage à l’éthanol 70 %.
7
Re-fixer les ARN
Ajouter 350 μL tampon MRB à chaque échantillon. Mélanger par agitation pendant
5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois suivi d’une incubation
pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce
que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à
l’aide d’une pipette.
8
Laver avec le tampon à 70 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement,
remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant
1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette. Laisser le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP
pour l’étape suivante.
9
Sécher l’échantillon
Sécher les billes à l’air libre pendant 10 à 15 min à température ambiante.
10
Eluer l’ARN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter le volume désiré de tampon MRE (au moins 50 μL, 50 – 200 μL) et remettre
les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes
(5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs
(15 fois).
Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP . Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes soient attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ARN purifié
dans une plaque de collecte appropriée (voir informations de commande, paragraphe
8.2).
20
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
NucleoMag® RNA Pro
6
Protocole pour l’extraction d’ARN à partir de
matériel végétal
Résumé du protocole
•
Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les
paragraphes 1.2 et 2.4, respectivement.
•
Un tampon de lyse supplémentaire RL1 (REF 740385.125) est nécessaire pour
l’extraction de l’ARN du matériel végétal (voir les informations de commande, paragraphe
8.2).
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 24.
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
Homogénéiser / ​ lyser
les échantillons
Jusqu’à 40 mg de feuilles de
plantes
350 μL RL1
6 μL TCEP
Broyer les feuilles des plantes
dans de l’azote liquide et ajouter
le RL1 ou utiliser le
broyage mécanique
2
3
Clarifier les lysats
clarifiés
par centrifugation,
transférer 350 μL des
lysats clarifiés dans un
Square-well Block pour
la suite de la procédure.
Fixer les acides
nucléiques aux
NucleoMag® B-Beads
5 600 x g,
5 min
350 μL de lysat clarifié
20 μL NucleoMag® B-Beads
250 μL d’éthanol 100 %
Mélanger par agitation
pendant 5 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
21
NucleoMag® RNA Pro
4
Laver avec le tampon
MRW
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
900 μL MRW
Remettre en suspension : Agiter
5 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
5
Laver avec le tampon à
70 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
900 μL d’éthanol à 70 %
Remettre en suspension : Agiter
5 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
Sécher pendant 5 min à TA
6
Digérer l’ADN
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
300 μL de mélange réactionnel
rDNase
Mélanger
Incuber 15 min à TA
7
22
Re-fixer l’ARN
350 μL MRB
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
NucleoMag® RNA Pro
Mélanger par agitation
pendant 5 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
8
Laver avec le tampon à
70 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
900 μL d’éthanol à 70 %
Remettre en suspension : Agiter
5 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
9
Sécher l’échantillon
Laisser le Square-well Block
sur le NucleoMag® SEP
Sécher à l’air 10 – 15 min à TA
10
Elution de l’ARN
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
50 – 200 μL MRE
Agiter 5 – 10 min à TA
(Optionnel : Mélanger par
pipetages successifs)
Séparer 2 min et transférer
l’ARN dans une plaque
d’élution / ​des​ tubes
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
23
NucleoMag® RNA Pro
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple,
NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.4). Il est recommandé
d’utiliser un Square-well Block pour la séparation (voir paragraphe 1.2). Alternativement,
l’extraction de l’ARN peut être effectuée dans des tubes de réaction avec des séparateurs
magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de guide
pour l’adaptation du kit aux instruments automatisés.
•
Le tampon de lyse RL1 est nécessaire pour l’extraction de l’ARN du matériel végétal (voir
informations de commande, paragraphe 8.2).
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
Homogénéiser / ​lyser les échantillons
Lyser jusqu’à 40 mg de feuilles de plantes dans 350 μL de tampon RL1 + 6 µL de
TCEP.
Broyer le matériel végétal dans de l’azote liquide et mélanger soigneusement avec le
tampon RL1 avant décongélation ou utiliser un système d’homogénéisation approprié
pour homogénéiser les échantillons dans le tampon RL1. Les échantillons peuvent être
broyés à l’aide de systèmes de broyage à billes, par exemple GenoGrinder* ou Mixer
Mill MM400** (voir les recommandations du fabricant de l’instrument pour les plaques
ou les tubes appropriés pour l’homogénéisation) ou tout autre système
d’homogénéisation approprié.
1
Clarifer les lysats
Centrifuger les échantillons pendant 5 min à pleine vitesse (5 600 – 6 000 x g). Retirer
les barrettes de 8 bouchons.
Transférer 350 μL du lysat clarifié dans un Square-well Block. Ne pas souiller les
bords du puits.
Note : Voir les recommandations concernant les plaques ou tubes appropriés et les
séparateurs magnétiques compatibles au paragraphe 1.2.
* GenoGrinder : http://www.spexcsp.com/sampleprep/
** Mixer Mill MM400 http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/mm-400/
24
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
NucleoMag® RNA/DNA Pro
2
Fixer les acides nucléiques aux NucleoMag® B-Beads
Ajouter 20 μL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 250 μL
d’éthanol 100 % à l’échantillon lysé. Mélanger par agitation pendant 5 min à
température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois suivi d’une incubation de
5 min à température ambiante. Les billes NucleoMag® B-Beads et l’éthanol peuvent
être mélangés au préalable.
Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer du
flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à lobtention d’une
suspension homogène.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce
que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à
l’aide d’une pipette. Éliminer complètement le surnageant.
Note : Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’aspiration du surnageant. Le
culot de billes n’est pas visible à cette étape. Eliminer le surnageant en pipetant de
l’autre côté du puits.
3
Laver avec le tampon MRW
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL de tampon MRW dans chaque puits et remettre les billes en
suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min).
Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois).
Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
4
Laver avec le tampon 70 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement,
remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant
1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Maintenir le Square-well
Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape de séchage.
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
25
NucleoMag® RNA/DNA Pro
5
Digérer l’ADN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter
300 μL de mélange réactionnel rDNase et remettre les billes en suspension par
pipetages successifs. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Ne pas
séparer les billes !
Note : Si vous souhaitez isoler l’ARN et l’ADN dans le même éluat, il faut omettre l’étape
de séchage de l’étape 5 du protocole ainsi que la digestion de l’ADN et poursuivre le
protocole à l’étape 8 avec le 2ième lavage à l’éthanol 70 %.
6
Re-fixer les ARN
Ajouter 350 μL de tampon MRB à chaque échantillon. Mélanger par agitation
pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et une
incubation ultérieure pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce
que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à
l’aide d’une pipette.
7
Laver avec le tampon à 70 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement,
remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant
1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette. Laisser le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP
pour l’étape suivante.
8
Sécher l’échantillon
Sécher les billes à l’air libre pendant 10 à 15 min à température ambiante.
9
Eluer l’ARN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter le volume souhaité de tampon MRE (au moins 50 μL, 50 – 200 μL) et remettre
les billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes
(5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs
(15 fois).
Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ARN purifié
dans une plaque de collecte appropriée (voir informations de commande, paragraphe
8.2).
26
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
NucleoMag® RNA/DNA Pro
7
Protocole pour l’extraction de l’ARN et de l’ADN
dans des éluats séparés
Résumé du protocole
•
Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les
paragraphes 1.2 et 2.4, respectivement.
•
Le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro (744370.1) ou le kit NucleoMag® RNA Pro en
combinaison avec le kit NucleoSpin® RNA/DNA Buffer (REF 740944) est nécessaire
pour réaliser le protocole (voir les informations de commande, paragraphe 8.2).
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 28.
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
•
Préparer le tampon de lavage DNA Wash conformément au chapitre 3 du manuel.
A
Homogénéiser / ​ lyser
des échantillons / ​ 1er
lavage
Effectuer le protocole
d’extraction de l’ARN à partir de
cellules, de tissus ou de matériel
végétal jusqu’à l’étape 4, laver
avec le tampon MRW.
Laver avec le tampon de
lavage DNA Wash
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
900 μL de tampon DNA Wash
Remettre en suspension : Agiter
5 min à TA
(Optionnel : Mélanger par pipetages
successifs).
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
B
Sécher l’échantillon
Laisser le Square-well Block
sur NucleoMag® SEP
Sécher à l’air 10 – 15 min à TA
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
27
NucleoMag® RNA Pro
C
Retirer le Square-well Block
du NucleoMag® SEP
Eluer l’ADN
100 μL de tampon DNA Elute
Agiter 5 – 10 min à TA
(Optionnel : Mélanger par pipetages
successifs)
Séparer 2 min et transférer l’ADN
dans une plaque d’élution / ​des
tubes
Digérer l’ADN / ​ Refixer les ARN / ​3ème
lavage / ​ Eluer l’ARN
Poursuivre le protocole
d’extraction de l’ARN à partir
de cellules et de tissus ou de
matériel végétal avec l’étape 6,
Digérer l’ADN.
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple,
NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.4). Il est recommandé
d’utiliser un Square-well Block pour la séparation (voir paragraphe 1.2). Alternativement,
l’extraction de l’ARN peut être effectuée dans des tubes de réaction avec des séparateurs
magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de guide
pour l’adaptation du kit aux instruments automatisés.
•
Le kit NucleoMag® RNA/DNA Pro (744370.1) ou le kit NucleoMag® RNA Pro en
combinaison avec le kit NucleoSpin® RNA/DNA Buffer (REF 740944) est nécessaire
pour réaliser le protocole (voir les informations de commande, paragraphe 8.2).
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3.
•
Préparer le tampon de lavage DNA Wash conformément au chapitre 3 du manuel.
Homogénéiser / ​
lyser les échantillons / ​Clarifier les lysats / ​Fixer les acides
nucléiques aux NucleoMag® B-Beads / ​Laver avec le tampon MRW
Suivre le protocole pour l’extraction d’ARN à partir de cellules et de tissus (paragraphe
5) ou de matériel végétal (paragraphe 6) pour les quatre premières étapes du protocole.
Effectuer ensuite les trois étapes A à C suivantes pour extraire dans un premier temps
l’ADN.
28
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
NucleoMag® RNA Pro
A
Laver avec le tampon DNA Wash
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 900 μL de tampon de lavage DNA Wash dans chaque puits et remettre les
billes en suspension en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes
(5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs
(15 fois). Incuber pendant 1 min.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une
pipette.
B
Sécher l’échantillon
Sécher les billes à l’air libre pendant 10 à 15 min à température ambiante.
C
Eluer l’ADN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 100 µL de tampon d’élution DNA Wash et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à complète resuspension de toutes les billes (5 min). Alternativement,
remettre en suspension les billes par des pipetages successifs (15 fois).
Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ADN purifié
dans une plaque de collecte appropriée (voir informations de commande, paragraphe
8.2).
Digérer l’ADN / ​Re-fixer les ARN / ​3ème lavage / ​Eluer l’ARN
Procéder au protocole respectif pour l’extraction de l’ARN à partir de cellules et de
tissus (paragraphe 5) ou de matériel végétal (paragraphe 6) avec l’étape de digestion
de l’ADN (étape 6) et exécuter la suite du protocole sans aucune modification
supplémentaire.
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
29
Extraction d’ARN
8
Annexes
8.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possibles et suggestions
Contamination par des RNases
ARN dégradé / ​ ​
Rendement en
ARN nul
•
Créer un environnement de travail exempt de RNases. Porter des
gants pendant toutes les étapes de la procédure. Changer de
gants fréquemment. Il est recommandé d’utiliser des tubes ou
des plaques en polypropylène stériles et jetables. Les éventuels
contenants en verre devront avoir été autoclavés pendant au
moins 2 heures à 250 °C avant utilisation.
Volume de tampon d’élution insuffisant
•
Le culot des billes doit être entièrement recouvert de tampon
d’élution.
Performance insuffisante du tampon d’élution pendant l’étape d’élution.
•
Faible rendement
en ARN
Éliminer complètement les tampons résiduels provenant des
étapes de séparation. Les tampons résiduels diminuent l’efficacité
des étapes de lavage et d’élution suivantes.
Séchage excessif des billes
•
Ne pas laisser sécher les billes, car cela pourrait entraîner une
baisse de l’efficacité de l’élution.
Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant
•
Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’élimination du
surnageant, en particulier lorsque le culot de billes magnétiques
n’est pas visible dans le lysat.
Aspiration et perte de billes
•
Durée de séparation magnétique trop courte ou vitesse
d’aspiration trop élevée.
Procédure de lavage insuffisante
•
Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de séparateur
et de plaque, par exemple le Square-well Block en combinaison
avec le NucleoMag® SEP.
•
S’assurer que les billes sont remises en suspension complètement
pendant la procédure de lavage. Si l’agitation ne suffit pas à
remettre complètement les billes en suspension, mélanger grâce à
des pipetages successifs.
Pureté insuffisante
30
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
Extraction d’ARN
Problème
Causes possibles et suggestions
Contamination par de l’éthanol
Faible performance • Veillez à éliminer toute la solution de lavage éthanolique, car
de l’ARN dans les
l’éthanol résiduel interfère avec les applications avales.
applications en
Pureté insuffisante
aval
•
Voir ci-dessus.
Durée de séparation magnétique trop courte
•
Perte des billes
Augmenter la durée de séparation pour permettre aux billes d’être
complètement attirées par les aimants avant d’aspirer tout liquide
du puits.
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
•
Une vitesse d’aspiration élevée pendant l’étape d’élution peut
entraîner une perte des billes. Réduire la vitesse d’aspiration pour
l’étape d’élution.
Contaminations des parties supérieures des puits
Contamination
croisée
•
Ne pas souiller les bords du Square-well Block lors du transfert
du lysat tissulaire. Si le bord des puits est contaminé, sceller
le Square-well Block avec une feuille PE auto-adhésive (voir
informations de commande, paragraphe 8.2) avant de mettre
l’agitateur en marche.
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
31
Extraction d’ARN
8.2
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoMag RNA Pro
744360.1
744360.4
1 × 96 preps
4 × 96 preps
NucleoMag® RNA/DNA Pro
744370.1
1 × 96 preps
NucleoMag SEP
744900
1
Square-well Blocks
740481.4
740481.24
4
24
Film PE auto-adhésif
740676
50 feuilles
Rack of Tube Strips
(le kit comprend 1 Rack, 12 barrettes de 8 bouchons
chacune et des Cap Strips)
740477.4
740477.24
4 sets
24 sets
Cap Strips (barrettes de 8 bouchons)
740638
30 barrettes
96 Deep-well plates pour systèmes à barreaux
magnétiques
744955
25
8-well Tip Combs pour systèmes à barreaux
magnétiques
744960
50
8-well Accessory Kit pour systèmes à barreaux
magnétiques
744961
1 sets
744951
1 sets
NucleoSpin® DNA/RNA Buffer Set
740994
100 preps
Tampon de lyse RL1
740385.125
125 mL
®
®
Pour l’utilisation du kit sur l’instrument
KingFisher® Flex :
p.e., KingFisher® Accessory Kit B
Square-well Blocks, Deep-well tip combs, plaques
d’élution pour 4 × 96 NucleoMag® RNA preps
Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit.
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MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
Extraction d’ARN
8.3
Restrictions d’utilisation du produit / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils
sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description
de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits
MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi
et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local
pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans
la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
Veuillez contacter :
MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Tél : +49 24 21 969 333
support@mn-net.com
8.4
Versions linguistiques et prédominance
Ce document est disponible en plusieurs langues. En cas de divergence ou de problème
d’interprétation, la version anglaise prévaut.
Marques déposées :
KingFisher est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific.
NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Te-MagS est une marque déposée de Tecan Group Ltd.
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux
marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
MACHEREY-NAGEL – 01/2025, Rev. 02
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Plasmid DNA
Clean up
RNA
DNA
Viral RNA and DNA
Protein
High throughput
Accessories
Auxiliary tools
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