Macherey-Nagel NucleoSpin Gel and PCR Clean-up, Mini kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d’utilisation
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
n NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
Mars 2023 / Rev. 08
www.mn-net.com
www.mn-net.com
Purification des produits PCR
Extraction à partir de gel
Résumé du protocole (Rev. 08)
Purification
de PCR
Extraction
d’ADN de gel
200 μL NTI / ​
100 μL
de PCR
200 μL NTI / ​
100 mg de gel
Purification
d’ADN (avec
SDS)
Purification
d’ADN simple brin
500 μL NTB / ​
100 μL
d’échantillon
200 μL NTC / ​
100 μL
d’échantillon
Produits PCR,
fragments d’ADN
ou ADN simple
brin : ajuster les
conditions de
fixation de l’ADN
Extraction à partir
de gel : découper
& solubiliser le
fragment de gel
1 Fixer l’ADN
50 °C
5 – 10 min
11,000 x g
30 s
700 μL NT3
11,000 x g
30 s
2 Laver la
membrane
de silice
Recommandé :
2ième lavage
700 μL NT3
11,000 x g
30 s
3 Sécher la
membrane
de silice
11,000 x g
1 min
15 – 30 μL NE
4 Eluer l’ADN
TA
1 min
11,000 x g
1 min
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.: +49 24 21 969-333 · support@mn-net.com · www.mn-net.com
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
Sommaire
1 Composants du kits
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
5
1.3 A propos de ce manuel
5
2 Description du produit
6
2.1 Principe général
6
2.2 Caractéristiques du kit
6
2.3 Élimination de petits fragments d’ADN et des dimères d’amorces
8
2.4 Indicateur de pH
9
2.5 Conseils et astuces pour les extractions sur gels d’agarose
10
2.6 La taille des fragments d’ADN et le volume d’élution impactent le rendement
11
2.7 Contamination en sel et faible ratio A₂₆₀ / ​A₂₃₀
13
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
15
4 Instructions de sécurité
4.1 Elimination des déchets
5 Protocoles
16
16
17
5.1 Purification des produits PCR
17
5.2 Extraction d’ADN à partir de gels d’agarose
19
5.3 Extraction d’ADN à partir de gels de polyacrylamide
21
5.4 Extraction d’ARN à partir de gels d’agarose (tampon NTC)
23
5.5 Purification de l’ADN des échantillons contenant du SDS (tampon NTB)
24
5.6 Purification de l’ADN simple brin (tampon NTC)
25
5.7 Procédure de NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up à l’aide d’un système à
vacuum
26
6 Annexes
28
6.1 Guide de résolution des problèmes
28
6.2 Informations de commande
31
6.3 Références
31
6.4 Restriction d’utilisation / garantie
32
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
3
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
1
Composants du kits
1.1
Contenu du kit
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
10 preps
740609.10
50 preps
740609.50
250 preps
740609.250
Tampon de fixation NTI
10 mL
40 mL
200 mL
Tampon de lavage NT3
(concentré)*
6 mL
25 mL
2 × 50 mL
Tampon d’élution NE**
13 mL
13 mL
30 mL
Colonnes de NucleoSpin® Gel
and PCR Clean-up (anneaux
jaunes)
10
50
250
Tubes collecteurs (2 mL)
10
50
250
Manuel d’utilisation
1
1
1
REF
* Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3.
** Composition du tampon d’élution NE : 5 mM Tris/HCl, pH 8,5
4
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
1.2
Réactifs, consommables et équipements à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
96 – 100 % d’éthanol
Consommables
•
Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL
•
Cônes jetables pour pipettes
Equipment
Equipment
•
Pipettes manuelles
•
Centrifugeuse pour microtubes
•
Bloc chauffant, bain-marie ou thermomixeur pour l’extraction à partir de gel
•
Scalpel pour couper les gels d’agarose
•
Vortex
•
Équipements de protection individuelle (blouse, gants, lunettes)
1.3
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce
manuel d’utilisation si le kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up est utilisé pour la
première fois. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du
protocole. Le résumé du protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil
supplémentaire de référence rapide pendant l’exécution de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante :
www.mn‑net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
5
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
2
Description du produit
2.1
Principe général
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up est un kit 2 en 1 qui permet de purifier des
fragments d’ADN à partir de réactions enzymatiques, telles que la PCR, ainsi qu’à partir
d’ADN gels d’agarose.
L’échantillon est mélangé au tampon de fixation NTI et, dans le cas d’une bande de
gel découpée, il est chauffé pour dissoudre l’agarose. En présence de sel chaotropique,
l’ADN est fixé à la membrane de silice d’une colonne NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up.
Les contaminations sont éliminées par de simples étapes de lavage avec le tampon de
lavage éthanolique NT3. Enfin, l’ADN pur est élué dans des conditions de faible teneur en
sel avec le tampon d’élution NE légèrement alcalin (5 mM Tris/HCl, pH 8,5).
2.2
Caractéristiques du kit
•
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up est conçu pour la purification rapide des
produits PCR, tels que l’ADN provenant de réactions enzymatiques, ainsi que pour
l’extraction de fragments d’ADN à partir de gels d’agarose TAE ou TBE.
•
Seuls deux volumes de tampon de fixation par volume d’échantillon sont
nécessaires pour traiter jusqu’à 200 μL de réaction PCR / ​enzymatique, ou 200 mg
de gel d’agarose, avec une seule étape de chargement. En ajoutant du tampon de
fixation NTI supplémentaire (voir les informations de commande), il est possible de
charger un nombre illimité de volumes d’échantillons sur une seule colonne (astuces
et conseils au paragraphe 2.5).
•
Jusqu’à ~ 15 μg d’ADN de 50 pb à au moins ~ 20 kbp peuvent être purifiés
efficacement en 10 – 20 min avec des récupérations moyennes de ~ 60 à ~ 90 % en
fonction de la taille du fragment et de la procédure d’élution (détails au paragraphe
2.6).
•
La formulation du tampon NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up garantit
l’élimination complète de toutes sortes de contaminations telles que
- nucléotides, amorces
- enzymes
- huile minérale
- additifs PCR (p.e., sels, bétaïne, DMSO)
- détergents (p.e. Tween 20, Triton X-100)
-c
olorants (p.e. bromure d’éthidium, cristal violet, Stain G, Midori Green, Roti®-Safe
GelStain, DNA SafeStain)
- tags non liés
6
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
•
Les amorces issues des réactions PCR sont quantitativement éliminées, tandis que
les petits fragments d’ADN restent liés et purifiés avec un taux de récupération élevé
(détails au paragraphe 2.6).
•
La taille minimale des fragments fixés peut être ajustée à moins de 50 bp à
plusieurs centaines de pb en diluant le tampon de fixation NTI afin d’éliminer les
dimèresd’amorce des produits PCR cibles (détails au chapitre 2.3).
•
L’indicateur de pH dans le tampon de fixation NTI garantit des conditions de fixation
optimales avec un pH < 7,0 (détails au paragraphe 2.4). La couleur jaune facilite la
visualisation d’agarose non dissous lors de l’extraction du gel d’ADN.
•
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up peut être utilisé avec tous les types de gels
d’agarose (à température de fusion élevée ou faible) avec 1 % à 5 % d’agarose
et différents tampons comme du TAE ou du TBE (astuces et conseils dans le
paragraphe 2.5). Le kit fonctionne également avec du tampon d’électrophorèse au
borate à faible conductivité.
•
L’élution peut être effectuée dans un volume réduit de 15 μL de tampon d’élution NE
(détails au paragraphe 2.6).
Plusieurs protocoles additionnels permettent d’étendre le champ d’application de
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up à
- Purification de l’ADN à partir de mélanges réactionnels contenant du SDS
(paragraphe 5.5)
- Purification de l’ADN simple brin (paragraphe 5.6)
- Extraction de l’ARN à partir de gels d’agarose (paragraphe 5.4)
- Extraction d’ADN à partir de gels de polyacrylamide (paragraphe 5.3)
•
L’ADN purifié et concentré peut être directement utilisé pour l’hybridation, le
séquençage, la PCR, les restrictions et ligations enzymatique, la transcription in vitro,
le marquage ou tout autre type de réaction enzymatique.
Tableau 1 : Résumé des caractéristiques du kit
Paramètres
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
Échantillon
Jusqu’à 200 μL de réaction PCR ou 200 mg de gel (voire
plus d’échantillon en ajustant le tampon de fixation NTI
et en réalisant plusieurs étapes de chargement).
Capacité de fixation
25 μg
Longueur du fragment
50 bp – ~ 20 kbp
Volume d’élution
15 – 30 μL
Récupération optimale
< 15 μg, 100 – 500 bp, 30 μL
Temps de préparation
10 min pour 6 purifications de produits PCR
20 min pour 6 extractions à partir de gel
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
7
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
Tableau 1 : Résumé des caractéristiques du kit
Utilisation
2.3
Réserver à l’usage de la recherche
Élimination de petits fragments d’ADN et des dimères
d’amorces
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up est conçu pour éliminer les traces d’amorces non
utilisées tout en purifiant les produits PCR jusqu’à 50 pb. Cependant, dans certains cas,
il est nécessaire d’exclure ces petits fragments. Par exemple, les dimères d’amorce ou
les produits secondaires résultant d’hybridation non spécifique peuvent interférer avec les
applications de séquençage ou de clonage en aval.
L’élimination de l’ADN double brin > 50 pb peut être réalisée en diluant une aliquote de
tampon NTI avec de l’eau stérile dans un rapport approprié et en procédant ensuite au
protocole standard (voir paragraphe 5.1). La dilution du tampon NTI dans une certaine
proportion diminue l’efficacité de la fixation pour les petits fragments sans compromettre
la récupération des produits PCR plus importants. Cependant, le rapport de dilution
dépend fortement du fragment. Par conséquent, pour chaque taille de petits fragments
> 50 pb qui doit être éliminée, ainsi que pour chaque système PCR, le rapport approprié
de dilution du Tampon NTI peut être déterminé à l’avance.
Influence de la taille du fragment : Plus le fragment en question est petit, moins il
faut diluer le tampon NTI.
Influence du système de tampon PCR :L’influence du système de tampon PCR sur
l’élimination des petits fragments est plus complexe. Certains tampons de réaction
contiennent des détergents comme le Tween ou de fortes concentrations d’additifs
comme la bétaïne pour abaisser la température de fusion de la matrice d’ADN. Ces
substances se trouvent généralement dans les tampons pour PCR ’high fidelity’ ou ’long
range’. Elles ont tendance à réduire l’efficacité de la fixation de l’ADN sur la membrane
de silice et doivent donc être prises en compte lors du choix du rapport de dilution du
tampon NTI. En règle générale, si un système de tampon PCR sans additifs spéciaux
est utilisé, l’ajout de 3 à 5 volumes d’eau à 1 volume de tampon NTI entraînera
l’élimination de petits fragments jusqu’à 100 pb. Dans le cas contraire, l’ajout de 1
à 3 volumes d’eau à 1 volume de tampon NTI est suffisant.
Par conséquent, pour chaque taille de petits fragments > 50 pb qui doit être éliminée, et
pour chaque système PCR, vous pouvez déterminer à l’avance le rapport approprié de
dilution du tampon NTI.
La figure 1 montre un résultat de purification avec une série de dilutions du tampon NTI. Le
tampon NTI pur (piste 3), ainsi que le tampon NTI additionné d’un volume d’eau (voie 4),
permettent de récupérer 100 % d’une échelle de fragments PCR (piste 2). L’augmentation
de la dilution du tampon NTI entraîne un déplacement du seuil de coupure vers des
fragments plus grands. En général, une dilution avec 5 volumes d’eau devrait suffire
pour éliminer les fragments d’amorces-dimères indésirables encore plus grands tout en
purifiant le fragment de 164 pb avec > 90 %.
8
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
[bp/nt]
- 982
- 645
- 359
- 164
- 100
- 79
- 65
50
- 21
Vol NTI –
Vol water –
% NTI
–
1
1
0
1
100 50
1
2
33
1
3
25
1
4
20
1
5
17
1
6
14
1
7
13
1
8
11
1
9
10
Figure 1 Purification des réactions PCR à l’aide des dilutions du tampon NTI
Piste 1 : Marqueur de taille d’ADN de 100 pb GeneRuler (MBI Fermentas)
Piste 2 : Marqueur de taille initial d'ADN(amorce de 21 bases, 50, 65, 79, 100,
164, 359, 645 et 982 pb de fragment) amplifiée à l’aide de l’ADN polymérase
Biotaq (Bioline)
Piste 3: Purification avec 100 % de tampon NTI
Piste 4 – 12 : Purification avec du tampon NTI dilué avec 1 à 9 volumes d’eau
2.4
Indicateur de pH
Le pH optimal pour fixer même de petits fragments d’ADN à la membrane de silice des
colonnes NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up est d’environ 5,0 – 6,0. Le tampon de
fixation NTI est suffisamment tamponné pour maintenir ce pH pour tous les tampons de
réaction PCR standard ou les systèmes de tampons pour gel d’agarose.
De plus, le tampon de fixation coloré permet d’identifier les morceaux d’agarose non
dissous lors de l’extraction du gel d’ADN
12
11
10
blue
green
pH
9
8
7
6
yellow
5
4
Figure 2 Courbe de titrage du tampon de fixation NTI avec indicateur de pH
Une couleur jaune indique un pH optimal < 6,0 (figure 2). Si le pH augmente jusqu’à
environ 7 après l’ajout de l’échantillon, la solution devient verte. Si le pH est supérieur à 7,
la solution devient bleue. Si un changement de couleur est observé, le pH doit être ajusté
en ajoutant plus de tampon NTI ou en titrant le pH à < 6,0 avec de l’acétate de sodium 4
M pH 5,0 ou de petites quantités d’acide chlorhydrique (HCl).
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
9
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
2.5
Conseils et astuces pour les extractions sur gels
d’agarose
Sujet
Recommandation
Le tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) a un pouvoir tampon plus
élevé que le TAE (Tris-Acetate-EDTA) qui, lui, est nécessaire pour
les électrophorèses de nuit et offre une meilleure résolution pour
les petits fragments d’ADN. Le tampon TBE peut être utilisé en
combinaison avec NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up.
Système de tampon
Cependant, il est préférable d’utiliser le tampon TAE frais
plutôt que le TBE pour les préparations de gels d’agarose.
Le TAE n’interagit pas avec l’agarose, ce qui permet d’obtenir
des rendements d’ADN plus élevés. De plus, l’ADN linéaire
s’écoule plus rapidement et la résolution des grands fragments
d’ADN est plus élevée. Par ailleurs, le plasmide super enroulé
est séparé plus efficacement de l’ADN linéaire et de l’ADN en
cercle ouvert.
Conditions de
migration
La température pendant l’électrophorèse doit être basse afin
d’augmenter la résolution de la séparation de l’ADN et d’éviter la
fonte du gel, ce qui entraînerait la dénaturation de l’ADN. Utiliser
du tampon frais et un faible voltage (< 60 V) pour une migration
devant être aussi courte que possible. Dès que la bande d’ADN
d’intérêt est suffisamment séparée, arrêter le gel et découper le
fragment.
Découpage de la
bande
Exposer le gel à la lumière UV aussi brièvement que
possible. Utilisez la longueur d’onde UV la plus longue autorisée
par votre système d’analyse des gels. Une exposition prolongée
et des longueurs d’onde courtes peuvent endommager l’ADN.
Portez des gants et un masque pour protéger votre peau et vos
yeux de la lumière UV. Veillez à couper le gel verticalement et à
éliminer tout excès d’agarose. Utilisez des gels d’agarose de 0,7
à 1,0 % plutôt que des pourcentages plus élevés.
Veillez à peser réellement le gel car son poids est facilement
sous-estimé. Jusqu’à 200 mg de gel d’agarose peuvent être
dissous avec 400 μL de tampon NTI et chargés sur la colonne
en une seule étape.
Taille du morceau
de gel
Cependant, il est possible d’utiliser une quantité de gel illimité
en augmentant proportionnellement le volume de tampon NTI
utilisé et en effectuant des chargements de la colonne par
étapes répétées.
Pour l’achat de NTI supplémentaire voir les informations de
commande.
10
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
2.6
La taille des fragments d’ADN et le volume d’élution
impactent le rendement
Après les étapes de lavage avec le tampon NT3, l’ADN adhère à la membrane de silice.
Le nombre d’interactions avec les groupes Si-OH de la silice augmente avec la taille du
fragment d’ADN. Par conséquent, un ADN de grande taille comportant plusieurs kpb
se fixe beaucoup plus fortement et est beaucoup plus difficile à éluer qu’un ADN de
petite taille comportant seulement quelques centaines de pb. NucleoSpin® Gel and PCR
Clean-up est recommandé pour l’ADN jusqu’à 10 – 15 kbp. Les fragments plus longs
peuvent être purifiés mais le taux de récupération peut être faible. En outre, les fragments
de plus de 20 kbp peuvent être endommagés mécaniquement par la centrifugation
rapide à travers la membrane. Pour les très grands fragments, envisager l’utilisation de
NucleoTrap® ou NucleoTraP®CR (voir informations de commande).
Pour éluer l’ADN, de l’eau avec un pH > 7 est nécessaire pour rétablir l’enveloppe aqueuse
autour de l’ADN. Il est fortement recommandé d’éluer l’ADN avec le tampon d’élution
NE (Tris/HCl 5 mM, pH 8,5) fourni avec le kit. Toutefois, un tampon TE standard peut
également être utilisé pour garantir une meilleure efficacité d’élution. Veuillez noter que
l’EDTA dans le tampon TE peut causer des problèmes dans les réactions enzymatiques
ultérieures. Ne pas utiliser d’eau désionisée car son pH est généralement trop acide. Le
tampon NE peut être dilué avec de l’eau distillée au cas où une concentration en sel plus
faible serait nécessaire. Veillez à ce que le pH reste > 7.
Le volume standard du tampon d’élution est de 15 à 30 μL, ce qui constitue le meilleur
compromis pour une récupération élevée d’ADN et une concentration élevée d’ADN pour
les fragments < 1000 pb(Figure 3).
DNA recovery
100 %
80 %
60 %
PCR
Gel
40 %
20 %
0%
50 bp
100 bp
250 bp
500 bp
750 bp
1 kbp
3 kbp
5 kbp
Fragment length
Figure 3 Impact de la taille des fragments sur le rendement final
2 μg de marqueur de taille de 100 pb (Fermentas) ou 2 μg de vecteurs
linéarisés de 3 et 5 pb ont été purifiés à partir d’un tampon PCR standard ou
d’un gel d’agarose TAE à 1 % de 200 mg. L’ADN a été élué dans 30 μL de
tampon d’élution NE.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
11
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
L’élution après extraction sur gel est 10 à 20 % moins efficace que l’élution des produits
PCR purifiés. En outre, l’élution de fragments d’ADN de plusieurs kbp est 10 à 30 %
moins efficace que l’élution de fragments de 500 bp. Pour améliorer la récupération de
l’ADN après extraction sur gel et/ou pour les grands fragments d’ADN, les modifications
suivantes peuvent être apportées à la procédure d’élution standard :
•
Chauffer le tampon d’élution à 70 °C et incuber le tampon d’élution sur la colonne à
70 °C pendant 5 minutes.
•
Appliquer le tampon d’élution sur la colonne et centrifuger une première fois à
30 – 50 x g pendant 1 min, puis une seconde fois à 11 000 x g pendant 1 min.
Les améliorations les plus importantes en termes de récupération des acides nucléiques
peuvent être obtenues par une double élution. Dans ce cas, l’éluat de l’étape d’élution est
rechargé sur la silice pour une deuxième procédure d’élution. De cette manière, le volume
total d’élution reste faible tandis que la récupération est améliorée.
Cela est particulièrement vrai pour les procédures d’extraction sur gel. L’ADN a tendance
à rester collé à la matrice de silice et présente un profil d’élution retardé. Plusieurs cycles
d’élution peuvent augmenter considérablement la récupération de l’ADN.
100 %
DNA recovery
80 %
60 %
20 µL
30 µL
40 %
20 %
0%
1x
2x
3x
Elution repeats
Figure 4 Des étapes d’élution multiples augmentent la récupération
3 μg d’un fragment de 5 kbp ont été purifiés à partir d’un tampon PCR
standard et élués 1, 2 ou 3 fois avec 20 ou 30 μL de tampon d’élution.
Si des concentrations d’ADN plus élevées sont nécessaires, des volumes d’élution
< 30 μL peuvent être utilisés. Gardez à l’esprit que même si la concentration peut être
plus que doublée (figure 5 A), la récupération totale d’ADN sera considérablement réduite
pour les volumes < 15 μL (figure 5 B). Pour les grands fragments d’ADN et les extractions
sur gel, les pertes peuvent être encore plus prononcées.
12
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
B
100 %
0.18
0.16
80 %
0.14
DNA recovery
DNA concentration [µg/µL]
A
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
60 %
40 %
20 %
0.02
0.00
5 µL
0%
10 µL 15 µL 20 µL 25 µL 30 µL
5 µL
Elution volume
10 µL 15 µL 20 µL 25 µL 30 µL
Elution volume
Figure 5 Récupération et concentration de l’ADN en fonction du volume d’élution
2 μg de marqueur de taille de 100 pb (Fermentas) ont été purifiés à partir du
tampon PCR standard et élués avec des volumes croissants.
2.7
Contamination en sel et faible ratio A₂₆₀ / ​A₂₃₀
La technologie membrane de silice pour purifier l’ARN ou l’ADN est basée sur la capacité
des sels chaotropes à détruire l’enveloppe d’eau autour des acides nucléiques. Deux
sels chaotropes couramment utilisés sont le chlorhydrate de guanidine (GuHCl) et le
thiocyanate de guanidinium (GuSCN). En solution, ils possèdent tous deux le même cation
guanidinium mais des anions différents. Ces anions ne sont pas seulement responsables
de leur comportement différent vis-à-vis des acides nucléiques, mais aussi de leurs
spectres d’absorption UV différents. Le GuHCl ne présente qu’une absorption minimale
< 220 nm, même à une concentration de 1 M, alors que le GuSCN présente déjà une
absorption significative < 240 nm (1 mM, figure 6) et même < 260 nm (1 M).
1.0
Absorption
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
Wave length [nm]
Figure 6 Spectres d’absorption UV de GuHCl 1 mM (ligne continue) et de GuSCN 1 mM (ligne
pointillée)
En particulier, la différence d’absorption à 230 nm peut avoir un impact considérable sur
le rapport de pureté A260/A230 si l’ADN est contaminé par des sels chaotropiques. La
présence de GuSCN peut faire passer le rapport de sa valeur idéale de > 2,0 à moins de
1,5, voire 1,0. Le GuHCl ne peut pas être détecté à cette longueur d’onde et n’influence
pas le rapport. Cependant, l’effet du GuSCN n’est détectable qu’avec de très petites
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
13
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
quantités d’ADN telles que les rendements typiques des réactions PCR ou des extractions
sur gel. La mesure de petites quantités d’ADN dans de petits volumes peut conduire à des
rapports d’absorption qui suscitent des inquiétudes quant à la pureté de l’ADN. Toutefois,
cet effet ne se produit généralement pas avec des quantités plus importantes d’ADN,
car sa propre absorption à 230 nm masque les petites contributions d’une éventuelle
contamination.
La concentration de sel chaotropique contaminant est généralement comprise entre
100 μM et 1 mM et n’a pas d’influence négative sur les applications enzymatiques en
aval, par exemple la PCR, la restriction ou la ligation. La figure 7 montre l’inhibition de la
qPCR par le GuSCN et le GuHCl, démontrant que la PCR ne commence à être inhibée
par les sels chaotropiques qu’à partir d’une concentration environ 100 fois plus élevée (40
mM). En outre, elle montre que les deux sels chaotropiques entraînent une inhibition de la
PCR à des concentrations élevées.
30
GuHCl
Cp value
25
GuSCN
20
15
10
5
0
0 µM
100 µM
1 mM
10 mM
20 mM 40 mM
60 mM
80 mM
Figure 7 Inhibition de la qPCR par GuHCl (gris clair) et GuSCN (gris foncé)
Un fragment d’ADN de 164 pb a été amplifié à partir de 5 ng de matrice pBS
avec le mix DyNAmo Capillary Master (NEB) dans une machine PCR en temps
réel Lightcycler (Roche) en présence de 0 – 80 mM de GuHCl ou de GuSCN.
La concentration finale de sel chaotropique dans les éluats est trop faible pour avoir des
effets négatifs sur les applications en aval. Par conséquent, un faible rapport A₂₆₀ / ​A₂₃₀
peut être négligé lors de l’utilisation de ce produit.
14
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention : Le tampon NTI contient du sel chaotropique. Porter des gants et des lunettes !
ATTENTION : Le tampon NTI contient du thiocyanate de guanidinium qui peut former
des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite de
sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets
de préparation des échantillons.
Conditions de stockage :
•
Le kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up doit être conservé à température
ambiante et est stable jusqu’à : voir l’étiquette du kit.
Avant de débuter une procédure de NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up, préparer les
éléments suivants :
•
Tampon de lavage NT3 : Ajouter le volume indiqué d’éthanol (96 – 100 %) au
tampon NT3 concentré. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que de
l’éthanol a été ajouté. Le tampon de lavage NT3 est stable à 15 – 25 °C pendant au
moins un an.
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
REF
10 preps
740609.10
50 preps
740609.50
250 preps
740609.250
Tampon de
lavage NT3
(concentré)
6 mL
Ajouter 24 mL
d’éthanol
25 mL
Ajouter 100 mL
d’éthanol
2 × 50 mL
Ajouter 200 mL
d’éthanol dans
chaque bouteille
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
15
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean up, portez des
vêtements de protection appropriés (p.e., blouse de laboratoire, gants jetables et lunettes
de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité
(FDS) appropriées, disponibles en ligne à l’adresse www.mn-net.com/msds.
Attention : Le thiocyanate de guanidinium dans le tampon NTI peut former des composés
très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez
pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation
d’échantillons.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
16
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
5
Protocoles
5.1
Purification des produits PCR
Le protocole suivant convient au purification de la PCR et pour la concentration de l’ADN
et à l’élimination des sels, des enzymes, etc. à partir de réactions enzymatiques (SDS
< 0,1 %).
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier si le tampon de lavage NT3 a été préparé conformément au chapitre 3.
Création des conditions de fixation
Pour les très petits volumes d’échantillons < 30 μL,
ajuster le volume du mélange réactionnel à 50 – 100 μL
avec de l’eau.
+ 2 vol NTI
pour
1 vol
d’échantillon
Il n’est pas nécessaire d’enlever l’huile minérale.
Mélanger 1 volume d’échantillon avec 2 volumes de
tampon NTI (p.e., mélanger 100 μL de réaction PCR et
200 μL de tampon NTI).
Note : Pour l’élimination de petits fragments tels que les
dimères d’amorces, des dilutions de tampon NTI peuvent
être utilisées au lieu de 100 % de tampon NTI. Veuillez
vous référer au chapitre 2.3.
2
Fixation de l’ADN
Placer une colonne de NucleoSpin® Gel and PCR
Clean-up dans un tube collecteur (2 mL) et charger
jusqu’à 700 μL d’échantillon.
Centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g. Jeter le filtrat et
replacer la colonne dans le tube collecteur.
Charger l’échantillon restant si nécessaire et répéter
l’étape de centrifugation.
3
Lavage de la membrane de silice
Ajouter 700 μL de tampon NT3 à la colonne de
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up. Centrifuger
pendant 30 s à 11,000 x g. Jeter le filtrat et remettre la
colonne dans le tube collecteur
Recommandé : Répéter l’étape de lavage précédente
pour minimiser la contamination de sels chaotropiques et
améliorer les valeurs A₂₆₀/A₂₃₀ (voir le paragraphe 2.7 pour
des informations détaillées).
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
Charger
l’échantillon
11,000 x g
30 s
+ 700 μL NT3
11,000 x g
30 s
+ 700 μL NT3
11,000 x g
30 s
17
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
4
Membrane de silice sèche
Centrifuger pendant 1 min à 11,000 x g pour éliminer
complètement le tampon NT3. Veiller à ce que la colonne
de centrifugation n’entre pas en contact avec le filtrat lors
de son retrait de la centrifugeuse et du tube collecteur.
Note : L’éthanol résiduel du tampon NT3 peut inhiber les
réactions enzymatiques. L’élimination totale de l’éthanol
peut être obtenue en incubant les colonnes pendant 2 à
5 min à 70 °C avant l’élution.
5
Eluer l’ADN
Placer la colonne de NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL
(non fourni). Ajouter 15 – 30 μL de tampon NE et incuber
à température ambiante (15 – 25 °C) pendant 1 min.
Centrifuger pendant 1 min à 11,000 x g.
Note : La récupération d’ADN de fragments plus
importants (> 1000 pb) peut être augmentée par des
étapes d’élution multiples avec du tampon frais, en
chauffant à 70 °C et en incubant pendant 5 min. Voir le
paragraphe 2.6 pour des informations détaillées
18
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
11,000 x g
1 min
+ 15 – 30 μL
NE
TA
1 min
11,000 x g
1 min
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
5.2
Extraction d’ADN à partir de gels d’agarose
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon de lavage NT3 a été préparé conformément au chapitre 3.
1
Découpe du fragment d'ADN et solubilisation du
fragment de gel
Note : Minimiser le temps d’exposition aux UV pour éviter
d’endommager l’ADN. Se référer au paragraphe 2.5 pour
plus de conseil sur l’extraction sur gel d’agarose.
A l’aide d’un scalpel propre, prélever le fragment d’ADN
sur un gel d’agarose. Éliminez tout excès d’agarose.
!
Déterminer le poids du morceau de gel et transférer dans
un tube propre.
Pour chaque 100 mg de gel d’agarose < 2 %, ajouter
200 μL de tampon NTI.
+ 200 μL NTI
par 100 mg
de gel
Pour les gels contenant > 2 % d’agarose, doubler le
volume de tampon NTI.
Incuber l’échantillon pendant 5 – 10 min à 50 °C. Vortexer
brièvement l’échantillon toutes les 2 – 3 min jusqu’à ce
que le morceau de gel soit complètement dissout !
2
Fixation de l’ADN
Placer une colonne de NucleoSpin® Gel and PCR
Clean-up dans un tube collecteur (2 mL) et charger
jusqu’à 700 μL d’échantillon.
Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g. Jeter le filtrat et
replacer la colonne dans le tube collecteur.
Charger l’échantillon restant si nécessaire et répéter
l’étape de centrifugation.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
50 °C
5 – 10 min
Charger
l’échantillon
11,000 x g
30 s
19
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
3
Lavage de la membrane de silice
Ajouter 700 μL de tampon NT3 à la colonne de
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up. Centrifuger
pendant 30 s à 11 000 x g. Jeter le filtrat et remettre la
colonne dans le tube collecteur.
+ 700 μL NT3
11,000 x g
30 s
+ 700 μL NT3
Recommandé : Répéter l’étape de lavage précédente
pour minimiser la contamination de sels chaotropiques et
le faible taux d’A₂₆₀/A₂₃₀ (voir le paragraphe 2.7 pour des
informations détaillées)
4
11,000 x g
30 s
Séchage de la membrane de silice
Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g pour éliminer
complètement le tampon NT3. Veiller à ce que la colonne
de centrifugation n’entre pas en contact avec le filtrat lors
de son retrait de la centrifugeuse et du tube collecteur.
Note : L’éthanol résiduel du tampon NT3 peut inhiber les
réactions enzymatiques. L’élimination totale de l’éthanol
peut être obtenue en incubant les colonnes pendant 2 à
5 min à 70 °C avant l’élution.
5
Elution de l’ADN
Placer la colonne de NucleoSpin® Gel and PCR Cleanup dans un nouveau tube de microcentrifugation de
1,5 mL (non fourni). Ajouter 15 – 30 μL de tampon NE et
incuber à température ambiante (15 – 25 °C) pendant
1 min. Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
Note : La récupération d’ADN de fragments plus
importants (> 1000 pb) peut être augmentée par des
étapes d’élution multiples avec du tampon frais, le
chauffage à 70 °C et l’incubation pendant 5 min. Voir le
paragraphe 2.6 pour des informations détaillées.
20
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
11,000 x g
1 min
+ 15 – 30 μL
NE
TA
1 min
11,000 x g
1 min
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
5.3
Extraction d’ADN à partir de gels de polyacrylamide
Dans les gels de polyacrylamide, les monomères d’acrylamide sont liés de manière
covalente lors d’une réaction chimique. Aussi, le gel ne peut pas être dissout comme les
gels d’agarose pour récupérer l’ADN contenu.
Les gels de polyacrylamide sont généralement extraits par la méthode "crush and soak",
qui consiste à écraser un petit morceau de gel et à l’incuber dans un tampon de diffusion.
L’ADN peut alors diffuser passivement hors du gel et est ensuite purifié à partir du tampon
de diffusion. Le tampon de diffusion (500 mM d’acétate d’ammonium, pH 8,0, 0,1 % de
SDS, 1 mM d’EDTA, 10 mM d’acétate de magnésium) n’est pas fourni avec le kit.
1
Préparer l’échantillon
Exciser le fragment d’ADN à l’aide d’un scalpel ou
d’une lame de rasoir avec une quantité minimale de
polyacrylamide. Peser le morceau de gel et transférer
dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non
fourni).
2
Ecraser le fragment de gel
Écraser le morceau de gel à l’aide d’une cônes jetables
de pipette dont l’extrémité fondue ressemble à un pilon
pour tube de microcentrifugeuse. Plus les morceaux sont
petits, meilleure est la récupération de l’ADN
3
Extraire l’ADN
Ajouter 200 μL de tampon de diffusion à chaque
100 mg de gel écrasé. S’assurer que tous les morceaux
de gel sont immergés dans le tampon de diffusion.
Incuber pendant 30 – 60 min à 50 °C ou pendant la nuit
à 37 °C.
4
Éliminer le polyacrylamide
Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g pour culotter
le polyacrylamide et transférer le surnageant dans un
nouveau tube de microtubes (non fourni).
Alternativement, transférer le mélange dans une colonne
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column et
centrifuger 1 min à 11 000 x g pour retenir le gel sur la
colonne. Conserver le flux qui contient l’ADN !
Optionnel : Pour augmenter le rendement final, répéter
les étapes 3 et 4 et combiner les deux surnageants ou
écoulements.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
Exciser le
fragment
d’ADN
Écraser le gel
50 °C
30 – 60 min
ou
37 °C
pendant la nuit
11,000 x g
1 min
Transférer le
surnageant
ou
11,000 x g
1 min
Maintenir la
fluidité
21
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
5
Créer les conditions de fixation de l’ADN
Mélanger 1 volume d’échantillon avec 2 volumes de
tampon NTI. (p.e., 200 μL de tampon de diffusion et
400 μL de Buffer NTI).
De petites quantités de SDS précipité n’influencent pas la
purification. Ne pas éliminer le précipité.
Note : Pour obtenir des rendements plus élevés pour les
petits fragments < 50 pb, ajouter deux volumes d’éthanol
ou utiliser le tampon NTC au lieu du tampon NTI. Le
tampon NTC n’est pas fourni avec le kit mais peut être
commandé séparément (voir informations de commande).
6
Fixer l’ADN
Passer à l’étape 2 du protocole de purification de la PCR
(paragraphe 5.1).
22
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
+ 2 vol NTI
pour 1 vol
d’échantillon
Optionnel :
+ 2 vol ethanol
or
+ 2 vol NTC
par 1 vol
d’échantillon
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
5.4
Extraction d’ARN à partir de gels d’agarose (tampon NTC)
Non seulement l’ADN mais aussi l’ARN peuvent être extraits des gels d’agarose. Pour lier
efficacement les petits ARN monocaténaires, il convient d’utiliser le tampon de fixation
NTC au lieu du tampon de fixation standard NTI.
Pour fractionner l’ARN, il faut réaliser un gel d’ARN standard avec un tampon de
chargement d’ARN dénaturant, mais ne pas utiliser de formaldéhyde ou de glyoxal.
Ces composés non seulement inactivent les RNases et dénaturent l’ARN, mais modifient
également l’ARN. En conséquence, le rendement de l’ARN est considérablement réduit
et, plus important encore, l’ARN peut ne pas réagir correctement dans les applications
enzymatiques en aval, telles que la RT-PCR ou les transcriptions in vitro.
Sans formaldéhyde, l’ARN est très sensible aux RNases contaminantes. Utilisez des
gants et assurez-vous que tout le matériel est RNase-free, en particulier l’agarose et les
tampons. Utiliser une durée de migration la plus courte et une température la plus basse
possible (faible voltage Utiliser une durée de migration la plus courte et une température
la plus basse possible (faible voltage chambre froide). Note : l’ARN peut former des
structures secondaires et peut migrerdifféremment des gels d’agarose dénaturants.
Note : Le tampon NTC doit être commandé séparément (Tampon NTC (125 mL),
REF 740654.100, voir ’Informations de commande’).
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon de lavage NT3 a été préparé conformément au chapitre 3.
1
Exciser le fragment d’ARN / ​solubiliser le morceau de gel
Note : Minimiser le temps d’exposition aux UV pour éviter
d’endommager l’ARN. Se référer au paragraphe 2.5 pour plus
de conseils sur l’extraction sur gel d’agarose.
A l’aide d’un scalpel propre, exciser le fragment d’ARN d’un gel
d’agarose. Éliminer tout excès d’agarose
!
Déterminer le poids du morceau de gel et transférer dans un
tube propre.
Pour chaque 100 mg de gel d’agarose < 2 %, ajouter 200 μL
de tampon NTC.
Pour les gels contenant > 2 % d’agarose, doubler le volume du
tampon NTC.
+ 200 μL NTC
par 100 mg de
gel
50 °C
5 – 10 min
Incuber l’échantillon pendant 5 – 10 min à 50 °C. Vortexer
brièvement l’échantillon toutes les 2 – 3 min jusqu’à ce que le
morceau de gel soit complètement dissoute !
2
Fixer l’ARN
Passer à l’étape 2 du protocole d’extraction d’ADN à partir de
gels d’agarose (paragraphe 5.2).
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
23
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
5.5
Purification de l’ADN des échantillons contenant du SDS
(tampon NTB)
Le tampon NTI, du kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up, est compatible avec la
plupart des détergents utilisés, à l’exception du dodécylsulfate de sodium (SDS). Pour la
purification de l’ADN à partir d’échantillons sans SDS, le protocole standard de purification
PCR peut être utilisé (voir paragraphe 5.1). Pour la purification de l’ADN à partir de tampons
contenant du SDS, par exemple dans des applications telles que l’"immunoprécipitation
de la chromatine" (ChIP), le tampon de fixation NTB compatible avec le SDS peut être
utilisé.
Note : Le tampon NTB doit être commandé séparément (Tampon NTB (150 mL)
REF 740595.150, voir ’Informations de commande’).
Avant de débuter la procédure :
•
7
Vérifier si le tampon de lavage NT3 a été préparé conformément au chapitre 3.
Création des conditions de fixation des ADN
Mélanger 1 volume d’échantillon avec 5 volumes de
tampon NTB (p.e., 100 μL de mélange réactionnel avec
500 μL de tampon NTB).
Note : Si le SDS commence à précipiter, ajouter 1 volume
d’isopropanol ou réchauffer l’échantillon à 20 – 30 °C.
8
Fixation de l’ADN
Passer à l’étape 2 du protocole d’extraction d’ADN à partir
de gels d’agarose (paragraphe 5.2).
24
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
+ 5 vol NTB
par 1 vol
d’échantillon
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
5.6
Purification de l’ADN simple brin (tampon NTC)
Le tampon NTI, issu du kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up, est capable de fixer
l’ADN simple brin (ssDNA) > 150 bases. Les oligonucléotides plus courts, en particulier les
amorces, sont complètement éliminés. Si vous devez purifier des courts fragments d’ADN
simple brin vous pouvez utiliser le tampon de fixation supplémentaire NTC (voir figure 8).
Note : Le tampon NTC doit être commandé séparément (125 mL de tampon NTC,
REF 740654.100, voir informations de commande).
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier si le tampon de lavage NT3 a été préparé conformément au chapitre 3.
Création des conditions de fixation de l’ADN
Mélanger 1 volume d’échantillon avec 2 volumes de
tampon NTC (p.e., 100 μL de mélange de réaction PCR et
200 μL de tampon NTC).
+ 2 vol NTC
par 1 vol
d’échantillon
Si votre échantillon contient de grandes quantités de
détergents ou d’autres substances critiques, doublez le
volume du tampon NTC.
2
Fixation de l’ADN
Passer à l’étape 2 du protocole d’extraction d’ADN à partir
de gels d’agarose (paragraphe 5.2).
1
2
3
- 490 bp
- 490 bases
- 164 bp
- 164 bases
- 100 bases
- 64 bases
- 18 bases
u
NTI
NTC
Figure 8 Purification de l’ADN ds et de l’ADN ss à l’aide des tampons NTI et NTC
Les fragments PCR, amplifiés à l’aide d’une amorce phosphorylée et d’une
amorce déphosphorylée, ont été partiellement digérés avec la λ-Exonucléase
pour obtenir de l’ADN simple brin. Les échantillons ont été purifiés à l’aide des
tampons de fixation NTI et NTC et analysés sur un gel d’agarose TAE à 1 %.
L’ADN double brin résiduel est visible sous forme de faibles bandes. L’ADN
simple brin correspondant migre légèrement plus vite en raison de la formation
d’une structure secondaire. Par rapport à l’ADN initial (u, piste 1), le tampon NTI
élimine l’ADN ss < 150 bases (NTI, piste 2), tandis que le tampon NTC conduit
à une récupération totale même des oligonucléotides d’amorce (NTC, piste 3).
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
25
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
5.7
Procédure de NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up à l’aide
d’un système à vacuum
Nous recommandons la chambre à vide ’NucleoVac 24 Vacuum Manifold’ pour l’utilisation
des colonnes NucleoSpin® par aspiration (voir ’informations de commande’). Cependant,
d’autres systèmes de chambre à vide similaires sont également utilisables.
1
Ajuster les conditions de fixation de l’ADN ou exciser
le fragment d’ADN/solubiliser le morceau de gel
Veuillez suivre l’étape 1 du protocole standard pour le
matériau de départ choisi.
2
Fixation de l’ADN
Placer une colonne NucleoSpin® Gel and PCR
Clean-up sur un système à vacuum approprié avec
des connexions Luer comme le NucleoVac 24 Vacuum
Manifold et charger jusqu’à 700 µL d’échantillon. Ne
pas fermer le couvercle !
+ Charger
l’échantillon
-0.2 à -0.4 bar*
1 min
Appliquer un vide de -0,2 à -0,4 bar* (1 min).
Lorsque l’échantillon est passé à travers la membrane
de la colonne NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up,
rompre le vide.
Si nécessaire, charger l’échantillon restant et répéter
l’opération.
3
Lavage de la membrane de silice
Ajouter 700 µL de tampon NT3 à la colonne
NucleoSpin® Gel and PCR Clean‑up. Ne pas fermer le
couvercle !
+ 700 µL NT3
–0.2à -0.4 bar*
1 min
Appliquer un vide de -0,2 à -0,4 bar* (1 min).
Lorsque l’échantillon est passé au travers de la colonne
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up, relâcher le vide.
4
Optionnel : Répéter l’étape du lavage
Répéter l’étape de lavage précédente pour minimiser
la contamination de sels chaotropiques et améliorer
les valeurs A₂₆₀/A₂₃₀ (voir le paragraphe 2.7 du manuel
NucleoSpin® Gel and PCR Clean‑up).
* Réduction de la pression atmosphérique
26
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
+ 700 µL NT3
‑0.2 à -0.4 bar*
1 min
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
5
Séchage de la membrane de silice
Optionnel : séchage par aspiration
Appliquer un vide de -0,4 à -0,6 bar* pendant 5 min
pour éliminer complètement le tampon NT3. Faire
fonctionner la pompe à vide en continu. Il est plus
important d’obtenir et de maintenir un flux d’air
continu que d’atteindre la réduction précise de la
pression atmosphérique mentionnée. Ne pas fermer le
couvercle !
-0.4 à -0.6 bar*
5 min
Relâcher le vide.
Optionnel 2 : Séchage par centrifugation
Placer la colonne NucleoSpin® Gel et PCR Clean‑ up
dans un tube collecteur (2 mL). Centrifuger pendant
1 min à 11 000 x g pour éliminer complètement le
tampon NT3. S’assurer que la colonne de centrifugation
n’entre pas en contact avec le filtrat lors de son retrait
de la centrifugeuse et du tube collecteur.
11,000 x g
1 min
Note : L’éthanol résiduel du tampon NT3 peut inhiber
les réactions enzymatiques. L’élimination totale de
l’éthanol peut être obtenue en incubant les colonnes
pendant 2 à 5 min à 70 °C avant l’élution.
6
Elution de l’ADN
Placer la colonne de NucleoSpin® Gel and PCR Cleanup dans un nouveau tube de microcentrifugation de
1,5 mL (non fourni). Ajouter 15 – 30 µL de tampon NE
et incuber à température ambiante (18 – 25 °C) pendant
1 min. Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
Note : la récupération d’ADN de fragments plus
importants (> 1000 pb) peut être améliorée par des
étapes d’élution multiples avec du tampon NE frais
(concentration réductrice), ou en rechargeant les éluats
pour une deuxième étape d’élution, ainsi que par des
temps d’incubation plus longs à des températures
élevées (p.e., 70 °C).
+ 15 – 30 µL NE
AT
1 min
11,000 x g
1 min
* Réduction de la pression atmosphérique
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
27
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
6
Annexes
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possibles et suggestions
Durée et température
Dissolution
incomplète
du morceau
de gel
•
Vérifier la température d’incubation et le volume du tampon NTI.
Augmenter le temps d’incubation. Vortexer toutes les 2 min et
vérifier l’intégrité du morceau de gel. Les très grands morceaux
de gel peuvent être écrasées avant l’ajout du tampon NTI pour
raccourcir le temps de fusion.
Réactifs mal préparés
•
Ajouter le volume indiqué d’éthanol à 96 – 100 % au tampon NT3
concentré et bien mélanger avant utilisation.
Dissolution incomplète du gel
•
Faible
rendement
d’ADN
Augmenter le temps ou ajouter encore deux volumes de tampon
NTI et vortexer le tube toutes les 2 minutes pendant l’incubation
à 50 °C. Les petits morceaux de gel sont à peine visibles et
contiennent de l’ADN qui sera perdu pour la purification.
Séchage insuffisant de la membrane de silice NucleoSpin® Gel and
PCR Clean-up
•
Centrifuger 5 min à 11 000 x g ou incuber la colonne pendant
2 à 5 min à 70 °C avant l’élution pour éliminer complètement
le tampon NT3 éthanolique. Les contaminations éthanoliques
sont également indiquées par des problèmes de chargement
du gel (les échantillons flottent hors des fentes du gel). Retirer
délicatement la colonne et le tube collecteur de la centrifugeuse et
éviter tout contact de la colonne avec le filtrat.
Élution incomplète
•
28
En particulier pour les grandes quantités d’ADN (> 5 μg), les longs
fragments d’ADN (> 1000 pb), ou après une extraction sur gel,
effectuer plusieurs étapes d’élution avec un tampon frais, chauffer
à 70 °C et incuber pendant 5 min. Voir le paragraphe 2.6 pour des
informations détaillées
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
Problème
Causes possibles et suggestions
L’ADN a été dénaturé pendant la purification
Apparition
de bandes
supplé­
mentaires
sur le gel
d’agarose
après
extraction du
gel
•
Si de l’eau est utilisée pour l’élution ou si de l’agarose à faible
teneur en ions est utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’agarose,
la formation d’ADN dénaturé (simple brin) peut être favorisée.
Pour ré-hybriderl’ADN, ajouter tous les composants de la réaction
enzymatique à effectuer en omettant l’enzyme. Incuber à 95 °C
pendant 2 min et laisser le mélange refroidir lentement jusqu’à la
température ambiante (à cette étape, l’ADN se ré-hybride). Ajouter
l’enzyme et poursuivre l’application en aval.
•
Utilisez un tampon frais et effectuez l’électrophorèse à basse
tension pour abaisser la température. Une température élevée
peut favoriser la dénaturation de l’ADN pendant l’électrophorèse
Contamination par de l’éthanol
Performances
suboptimales
de l’ADN
pour les
réactions de
séquençage,
de restriction
ou de ligation
•
Avant l’élution, centrifuger 5 min à 11 000 x g ou incuber la
colonne pendant 5 – 10 min à 70 °C pour éliminer complètement
le tampon NT3 éthanolique. Les contaminations éthanoliques sont
également indiquées par des problèmes de chargement du gel
(les échantillons flottent hors des puits du gel). Sortir délicatement
la colonne et le tube collecteur de la centrifugeuse et éviter le
contact de la colonne avec le filtrat.
•
Utilisez soit une marque différente d’éthanol pour reconstituer
le tampon NT3, soit de l’éthanol qui n’est pas dénaturé. Les
composants dénaturantspeuvent ne pas s’évaporer aussi
rapidement que l’éthanol et se retrouver concentrés dans l’éluat,
inhibant des enzymes comme la ligase.
Contamination par des sels chaotropiques
•
Effectuer l’étape de lavage optionnelle.
•
En outre, 250 μL de NT3 peuvent être chargés avant l’étape de
séchage. (Note : Le volume de tampon NT3 inclus dans le kit n’est
pas suffisant pour cette modification pour toutes les préparations
mais peut être commandé séparément, voir les informations de
commande).
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
29
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
Problème
Causes possibles et suggestions
Performances
suboptimales
de l’ADN
pour les
réactions de
séquençage,
de restriction
ou de ligation
(suite)
Elution de l’ADN avec des tampons autres que le tampon NE, par
exemple le tampon TE (Tris/EDTA)
Analyse
problé­­
matique au
NanoDrop®
ou au
Bioanalyzer
Contamination par des particules de silice
•
L’EDTA peut inhiber les réactions de séquençage. Dans ce cas, il
est recommandé de re-purifier l’ADN et de l’éluer dans le tampon
NE ou dans l’eau.
Pas assez d’ADN utilisé pour la réaction de séquençage
•
•
Quantifier l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose avant la
préparation des réactions de séquençage.
La technologie du spectrophotomètre NanoDrop® est très
sensible aux particules présentes dans l’échantillon. Pour culotter
les particules de silice, centrifuger > 2 min à 11 000 x g et prélever
le surnageant pour une utilisation ultérieure.
Contamination par des sels chaotropiques
Faible rapport
A₂₆₀/A₂₃₀
30
•
Se référer au Guide de résolution des problèmes "Performance
suboptimale de l’ADN dans les réactions de séquençage,
de restriction ou de ligation. Contamination par des sels
chaotropiques" et voir le paragraphe 2.7 pour des informations
détaillées.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
6.2
Informations de commande
Produit
REF
Pack of
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
740609.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoSpin® Gel and PCR Clean‑up XS
740611.10 / .50 / .250
10/50/250
Tampon NTI
740305.120
200 mL
Tampon NTB
740595.150
150 mL
Tampon NTC
740654.100
100 mL
Tampon NT3 (concentré)
(pour 125 mL de tampon NT3)
740598
25 mL
Tubes collecteurs (2 mL)
740600
1000
Chambre à vide NucleoVac 24
740299
1
Adaptateur NucleoVac Mini
740297.100
100
Vannes NucleoVac
740298.24
24
NucleoTrap®
740584.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
NucleoTraP®CR
740587.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250
®
Visit www.mn‑net.com for more detailed product information.
6.3
Références
Vogelstein B., and D. Gillespie. 1979. Preparative and analytical purification of DNA from
agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 615 – 619.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
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Purification des produits PCR et extraction à partir de gel
6.4
Restriction d’utilisation / garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils
sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description
de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits
MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode
d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du
produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications
et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du
produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et
descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants
de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par
un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et
elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente
de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la
société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent,
veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus
récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre
revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les
descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre
d’information uniquement.
Dernière mise à jour, Rev. 04
Veuillez contacter :
MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Tel. : +49 24 21 969‑333
support@mn‑net.com
Marques déposées :
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NucleoSpin® est une marque déposée de MACHEREYNAGEL ‑GmbH & Co. KG
Roti® est une marque déposée de Carl Roth GmbH & Co. KG
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées de leur propriétaire respectif - même s’il ne s’agit pas d’une dénomination spéciale. La mention de
produits et de marques n’est qu’une forme d’information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et
ne peut être considérée comme une forme de recommandation ou d’évaluation). En ce qui concerne ces produits ou
services, nous ne pouvons donner aucune garantie quant au choix, à l’efficacité ou au fonctionnement.
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MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 08
Plasmid DNA
Clean up
RNA
DNA
Viral RNA and DNA
Protein
High throughput
Accessories
Auxiliary tools
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