Hain Lifescience GenoType PST Manuel utilisateur

GenoType® PST®
Extraction et Amplification de l’ADN
du Cluster de Gènes de l’Interleukine 1 Humaine
7. Transférer le surnageant dans un tube propre et étiquetté.
8. Utiliser 5 µl pour la PCR.
Introduction
Un protocole détaillé peut être obtenu chez votre distributeur ou à l’adresse internet :
http://www.hain-lifescience.de/pdf/dnaisol_swabs.pdf
Ce protocole décrit la procédure d’amplification multiplex de fragments des gènes
humains IL-1A et IL-1B.
Préparation de la PCR
La PCR est couverte par des brevets détenus par la société Hoffmann-La Roche.
Aucune autorisation, licence implicite ou explicite pour la pratique de la PCR ni
aucune autre méthode utilisant la PCR ne sont couvertes en cas d’acquisition de
cette trousse. Les informations sur l’obtention d’une licence pour la pratique de la
PCR ou sur d’autres méthodes utilisant la PCR peuvent être obtenues en contactant
F. Hoffmann-La Roche AG, CH – 4002 Basel.
Conservation et Précautions
Dès réception, conserver le mélange Amorces/Nucléotides (PNM), ainsi que l’ADN
de contrôle (HCD) à 2–8°C et isolés de toute source d’ADN potentiellement contaminante. Si la durée de conservation doit excéder 4 semaines, conserver à −20°C.
Il est recommandé d’aliquoter le mélange PN afin d’éviter les congélations/décongélations répétées. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de leur date de péremption.
Tous les échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et
être manipulés comme tel. Observer les précautions usuelles pour la préparation
de l’amplification. Il est essentiel que le matériel et les réactifs utilisés pour l’extraction de l’ADN et pour la préparation de la PCR soient exempts de DNases. Ne
pas mélanger les réactifs provenant de différents lots de trousses.
Matériel Requis mais Non Fourni
– ADN polymérase thermostable avec tampon (enzyme de type «hot start» recommandée, taux d’extension : (2–4 kb/min à 72°C, demi-vie : 10 min à 97°C, 60 min
à 94°C, rendement d’amplification : >105)
– Bloc chauffant (précision +/−1°C)
– Centrifugeuse de paillasse
– Eau (niveau de pureté pour Biologie Moléculaire)
– Embouts de pipettes stériles avec filtre
– Gants à usage unique
– Huile minérale, niveau de pureté pour Biologie Moléculaire (pour thermocycleur
sans couvercle chauffant)
– Kit pour l’extraction de l’ADN et réactifs associés
– Micro-tubes pour extraction de l’ADN (1,5 ml) et tubes pour thermocycleur; exempt de contamination par DNase et RNase
– Pipettes réglables pour 10, 20, 200, et 1000 µl
– Thermocycleur (taux de chauffage : 3°C/sec, taux de refroidissement : 2°C/sec, précision : +/−0,2°C)
Extraction de l’ADN
L’ADN doit être extrait à partir de sang prélevé en tube EDTA/citrate ou à partir de
prélèvements buccaux. L’espace de travail doit être exempt de toute trace d’ADN
amplifié. Toutes les procédures d’extraction de l’ADN produisant de l’ADN amplifiable peuvent être employées. Lorsque les prélèvements buccaux sont utilisés
comme matériel de départ, le protocole rapide ci-après permet de récupérer une
quantité d’ADN suffisante pour l’amplification :
1. Placer l’écouvillon buccal dans un tube de 1,5 ml et couper la tige à environ 1,5
cm de la tête de l’écouvillon. (la tige doit emerger de la solution durant l’étape 2.
2. Ajouter 200 µl de NaOH 50 mM à chaque échantillon et vortexer au moins 30
secondes.
3. Incuber 5 minutes à 95°C.
4. Vortexer 15 secondes et centrifuger 1 seconde. Récuperer l’écouvillon à l’aide de
pincettes. Presser la tête de l’écouvillon contre les parois du tube pour en extraire tout le liquide.
5. Ajouter 20 µl de tampon Tris 1M pH 8.0
6. Vortexer brièvement et centrifuger 1 minute en pleine vitesse dans une centrifugeuse de paillase.
Préparer le mélange réactionnel (45 µl) dans une pièce exempte d’ADN. L’échantillon d’ADN doit être rajouté dans une pièce séparée. Il est recommandé d’utiliser
une ADN polymérase de type «hot start». Si cette enzyme n’est pas utilisée, réaliser
toutes les opérations de pipetage sur de la glace.
Préparer le mélange suivant par tube :
– 35 µl de mélange Amorces/Nucléotides (PNM)
– 5 µl de tampon d’incubation de la polymérase 10x – non fourni
– x µl de MgCl21) – non fourni
– 1–2 unité(s) d’ADN polymérase thermostable (se référer au manuel) – non fourni
– y µl d’eau (niveau de pureté pour Biologie Moléculaire) qsp 45 µl (hors volume de
l’enzyme) – non fourni
– Ajouter 5 µl de solution d’ADN (20–100 ng d’ADN) pour atteindre un volume final
de 50 µl (hors volume de l’enzyme)
1)
Selon le système tampon/enzyme utilisé, la concentration optimale de MgCl2
peut varier de 1,5 à 2,5 mM. A noter que certains tampons contiennent déjà le
MgCl2.
Déterminer le nombre d’échantillons à amplifier (nombre d’échantillons à analyser
+ contrôles). La solution d’ADN à amplifier est remplacée par 5 µl d’eau (contrôle
négatif) ou par 5 µl d’ADN contrôle (HCD, contrôle positif). L’ADN de contrôle est de
type sauvage pour les deux loci examinés. La solution d’ADN de contrôle doit être
considérée comme potentiellement infectieuse. Préparer une solution mère de mélange réactionnel contenant tous les réactifs à l’exception de l’ADN, et bien homogénéiser (ne pas vortexer).
Si le thermocycleur ne possède pas de couvercle chauffant, recouvrir les échantillons d’huile minérale.
Profil d’amplification
5 min2)
95°C
–
1 cycle
30 sec
2 min
95°C
58°C
–
–
10 cycles
25 sec
40 sec
40 sec
95°C
53°C
70°C
–
–
–
20 cycles
8 min
70°C
–
1 cycle
2)
La durée de cette étape doit être rallongée en cas d’utilisation d’ADN polymérase de type «hot start» (se référer au manuel de l’enzyme).
Selon le thermocycleur utilisé, le profil d’amplification peut demander des modifications (contacter votre distributeur).
Les produits de l’amplification peuvent être conservés à +4 ou −20°C.
La réaction d’amplification peut être contrôlée par électrophorèse en gel d’agarose
2% en déposant directement 5 µl de chaque échantillon (sans aucun tampon additionnel). Les amplicons ont une taille de 187 pb (gène IL-1A) et de 192 pb (gène IL-1B).
Fabricant
Hain Lifescience GmbH, Hardwiesenstraße 1, 72147 Nehren, Allemagne
http://www.hain-lifescience.de
GenoType® PST®
Test d'Analyse Génétique pour la Détection Combinée
des Polymorphismes IL-1A −889 et IL-1B +3953
du Cluster du Gène de l'Interleukine-1
Principe
Le test GenoType® PST® est basé sur la technologie DNA•STRIP® qui permet la
caractérisation combinée des polymorphismes en position –889 du gène humain
interleukine (IL)-1A et en position +3953 du gène humain IL-1B. La procédure complète comporte trois phases : extraction de l'ADN à partir d'échantillons de patients
(matériel requis pour l'extraction de l'ADN non fourni), une amplification multiplex
à l'aide d'amorces biotinylées (ADN polymérase thermostable non fournie), et détection de l'ADN amplifié par hybridation inverse. Cette dernière phase comporte
les étapes suivantes : dénaturation chimique de l'ADN amplifié, hybridation des
amplicons simples brins biotinylés aux sondes préimmobilisées sur la membrane,
lavage stringent, et enfin addition d'un conjugué streptavidine / phosphatase alcaline suivie d'une révélation chromogénique. Les signaux obtenus sont facilement et
rapidement interprétés à l'aide d'une matrice fournie avec chaque trousse.
Précautions
Tous les échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et
être manipulés comme tel. Les échantillons prélevés sur des patients à risques
doivent être identifiés et manipulés dans des conditions de sécurité adéquates.
Suivre les recommandations (fédérale, nationale, locale) d'hygiène, de sécurité et
d´environment. Se protéger à l'aide de vêtements adéquats et de gants.
Lors de la manipulation du kit, tenir compte des indications de sécurité suivantes :
La Solution de Dénaturation (DEN) contient du NaOH (<2%) et est irritante pour la
peau et les yeux (R36/38 et S26, S37/39, S45).
Le Substrat Concentré (SUB-C) contient Dimethyl Sulfoxide et est irritante (R36/37/
38, S23-26-36).
Pour des informations supplémentaires, consulter les fiches de sécurité.
homozygote pour cet allèle, une ligne colorée se développe uniquement dans cette
zone. Lorsque le patient est porteur d'une mutation hétérozygote, une ligne colorée
se développe parallèlement dans la zone «IL-1A −C889».
Contrôle Sensibilité IL-1B +3953 (Sens-IL-1B)
Une ligne colorée doit se développer dans cette zone, indiquant que le test présente
une sensibilité optimale.
IL-1B +C3953
Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'allèle
1 (C) en position +3953 du gène IL-1B.
IL-1B +3953T
Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'allèle
2 (T) en position +3953 du gène IL-1B. Lorsque le patient est porteur d'une mutation
homozygote pour cet allèle, une ligne colorée se développe uniquement dans cette
zone. Lorsque le patient est porteur d'une mutation hétérozygote, une ligne colorée
se développe parallèlement dans la zone «IL-1B +C3953».
Les différents profils de résultats et leur interprétation pour les deux loci testés,
ainsi que le niveau de risque PST sont résumés dans les tableaux ci-dessous.
Contrôle Conjugué
Contrôle Spécificité
Contrôle Sensibilité IL-1A −889
IL-1A −C889 (allèle 1)
IL-1A −889T (allèle 2)
Contrôle Sensibilité IL-1B +3953
IL-1B +C3953 (allèle 1)
IL-1B +3953T (allèle 2)
Contrôle de Qualité
Afin de contrôler le bon déroulement du test et le bon fonctionnement des réactifs,
chaque bandelette comporte quatre zones de contrôle :
– une zone «Contrôle Conjugué» pour contrôler la fixation du conjugué sur la bandelette et le bon déroulement de la révélation chromogénique
– deux zones «Contrôle Sensibilité» pour contrôler la sensibilité optimale pour
chacun des loci testés
– une zone «Contrôle Spécificité» pour contrôler l'absence de résultats faux-positifs
1
2
3
4
5
6
7
8
9
IL-1A −889
allèle 1
allèle 1 + allèle 2
allèle 2
allèle 1
allèle 1 + allèle 2
allèle 2
allèle 1
allèle 1 + allèle 2
allèle 2
1
x
2
x
3
x
4
x
5
x
6
x
7
x
8
x
9
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
IL-1B +3953
allèle 1
allèle 1
allèle 1
allèle 1 + allèle 2
allèle 1 + allèle 2
allèle 1 + allèle 2
allèle 2
allèle 2
allèle 2
x
x
x
x
GenoType® PST®
négatif
négatif
négatif
négatif
positif
positif
négatif
positif
positif
Procédure
Préparation
Préchauffer bain-marie agitateur/TwinCubator® à exactement 45°C +/−1°C. Préchauffer les solutions HYB et STR à 37–45°C avant utilisation. Les réactifs ne
doivent présenter aucun précipité (à noter cependant que la solution CON-D est
opaque). Si besoin, agiter. Equilibrer les autres réactifs (à l'exception de les solutions CON-C et SUB-C) à température ambiante. Dans un tube approprié, diluer le
Conjugué Concentré (CON-C, orange) et le Substrat Concentré (SUB-C, jaune) au
1 :100 dans un volume adéquat du tampon correspondant (CON-C avec CON-D,
SUB-C avec SUB-D). Bien homogénéiser et équilibrer à température ambiante.
Pour chaque échantillon testé, ajouter 10 µl de concentré à 1 ml de tampon. Diluer
CON-C avant chaque utilisation. Une fois dilué, SUB-C reste stable pendant 4 semaines conservé à température ambiante et à l’obscurité.
Tous les échantillons portant au moins une copie de l'allèle 2 au niveau des 2 loci
testés sont considérés comme positif pour le GenoType® PST®.
L'intensité d'un signal positif doit être comparaple à l'intensité du contrôle sensibilité correspondant. Les résultats restent interprétable même lorsque la bande de
contrôle de spécificité présente une faible coloration. Néanmoins, les bandes présentant une intensité comparable à celle de la bande de contrôle de spécificité
doivent être considérées non spécifiques.
1. Déposer 20 µl de Solution de Dénaturation (DEN, bleu) à une extrémité de
chaque puit utilisé.
2. Ajouter 20 µl d'échantillon amplifié et mélanger les deux solutions par
pipetages répétés. Incuber 5 minutes à température ambiante.
Pendant ce temps, à l’aide d’une pince, sortir du tube le nombre approprié de
bandelettes (STRIPS), et inscrire au crayon leur numéro d'identification dans
l'espace situé sous la ligne de repère. Toujours porter des gants pour manipuler
les bandelettes.
3. Ajouter dans chaque puit 1 ml de Tampon d’Hybridation (HYB, vert) préchauffé et homogénéisé. Homogénéiser jusqu’à ce que le mélange devienne
une couleur homogène.
Eviter les éclaboussures vers les autres puits.
4. Déposer une bandelette dans chaque puit utilisé.
Les bandelettes doivent être entièrement recouvertes par le liquide, avec la face
sensibilisée (identifiable par la ligne de repère) tournée vers le haut. Les ban-
Causes d'Erreurs
Limitations
En vue de l'amplification, l'ADN doit avoir été extrait à l'aide d'une méthode appropriée.
L'ADN cible doit avoir été correctement amplifié.
Résultats faibles ou absence de signal (incluant la zone de contrôle conjugué)
– Température ambiante trop basse ou réactifs mal équilibrés.
– CON-C et/ou SUB-C trop dilué ou CON-D et/ou SUB-D utilisé sans dilution préalable.
Résultats faibles ou absence de signal, excepté dans la zone de contrôle conjugué.
– La qualité et/ou la quantité de l'ADN extrait n'ont pas permis une amplification
correcte. Analyser l'ADN amplifié sur un gel agarose 2%. Si aucun amplicon n'est
visible, répéter les étapes d'extraction et d'amplification. Essayer éventuellement
une autre méthode d'extraction de l'ADN (se reporter au manuel «Extraction et
Amplification du Cluster de Gène de l'Interleukine-1 Humaine»).
– Température d’incubation trop élevée.
Signaux faux positifs
delettes mal orientées doivent être remises en position à l'aide de pincettes propres. Afin d'éviter toute contamination, bien nettoyer les pincettes après chaque
utilisation. Cella vaut aussi pour tous les étapes suivantes.
5. Placer la plaque dans bain-marie agitateur/TwinCubator® et incuber 30 minutes à 45°C.
Pour le bain-marie agitateur sélectionner une fréquence d'agitation suffisante
pour assurer un bon brassage de tampon. Ajuster le niveau de l’eau dans le bainmarie agitateur à mi-hauteur des puits de façon à assurer un bon transfert de
chaleur. Cela vaut aussi pour tous les étapes suivantes.
6. Aspirer le contenu des puits.
Utiliser par exemple une pipette pasteur reliée à une pompe à vide.
7. Ajouter à chaque puit 1 ml de Solution de Lavage Stringent (STR, rouge) et
incuber 15 minutes à 45°C dans bain-marie agitateur/TwinCubator®.
8. A partir de cette étape, travailler à température ambiante.
Eliminer la Solution de Lavage Stringent.
Vider la Solution de Lavage Stringent dans un container à déchets. Eliminer tout
le liquide résiduel en retournant les puits sur du papier absorbant (effectuer de
même pour les autres étapes de lavage).
9. Laver chaque puit avec 1 ml de Solution de Rinçage (RIN) et incuber pendant
une minute sous agitation. Vider la Solution de Rinçage.
10. Ajouter à chaque puit 1 ml de Conjugué dilué (voir ci-dessus) et incuber sous
agitation 30 minutes.
11. Vider le contenu des puits et rincer sous agitation 1 minute à l’aide de 1 ml de
Solution de Rinçage (RIN). Vider RIN. Répéter ce rinçage une nouvelle fois,
puis rincer une fois avec environ 1 ml d'eau distillée à l'aide d'une pissette.
Bien éliminer toute trace d'eau dans les puits après cette dernière étape.
12. Ajouter 1 ml de Substrat dilué (voir ci-dessus) dans chaque puit et incuber sans
agitation à l’obscurité.
Le temps de révélation peut varier en fonction des conditions de déroulement du
test (de 3 à 20 minutes), notamment de la température de la pièce. Des temps de
révélation trop longs peuvent entrainer un bruit de fond qui peut géner l'interprétation des résultats.
13. Arrêter la réaction en rinçant brièvement deux fois à l'eau distillée.
14. A l'aide de pincettes, récupérer les bandelettes et les sécher entre deux couches de papier absorbant.
Lecture et Interprétation des Résultats
Classer et ranger les bandelettes à l'abri de la lumière. Une feuille de lecture est
fournie avec le kit, mais peut également être téléchargée à l'adresse suivante :
http://www.hain-lifescience.de/pdf/pst_evaluation.pdf
La matrice fournie avec la trousse permet d'identifier chaque zone réactionnelle
par superposition.
Chaque bandelette comprend 8 zones réactionnelles (voir figure).
– Température d’incubation basse.
– Tampon d'Hybridation et/ou Solution de Lavage Stringent incorrectement équilibrés ou homogénéisés.
– Contamination de l'ADN extrait et/ou des réactifs d'amplification avec de l'ADN
précédemment extrait ou amplifié. Lorsque les réactifs d'amplification sont contaminés, un échantillon de contrôle négatif entraîne également le développement des lignes tests.
– Dans certaines conditions de test, une forte concentration d'ADN amplifié peut
entraîner une réaction chromogénique très rapide. En pareil cas, afin de prévenir le développement de bandes dues à des réactions d'hybridation croisées,
arrêter la réaction chromogénique dès que les premières lignes colorées deviennent visibles.
– Contamination des puits voisins par des éclaboussures lors de l'addition du Solution d'Hybridation.
Coloration non homogène
– Les bandelettes n'ont pas été suffisamment immergées lors des différentes incubations.
– Le portoir n'a pas été correctement agité.
Bruit de fond important
– CON-C et/ou SUB-C trop concentré.
– Les étapes de lavage n'ont pas été correctement effectuées.
– Les solutions de lavage étaient trop froides lors de leur utilisation.
Composition du Kit
Quantité
Bandelettes sensibilisées avec les sondes spécifiques (STRIPS)
Mélange PN (PNM)
contient amorces spécifiques des loci testés,
nucléotides, colorant
ADN Contrôle (HCD) prêt à l'emploi
contient 5–20 ng/µl d'ADN humain
Solution de Dénaturation (DEN) prêt à l'emploi
contient <2% NaOH, colorant
Solution d'Hybridation (HYB) prêt à l'emploi
contient 8–10% de détergent anionique, colorant
Solution de Lavage Stringent (STR) prêt à l'emploi
contient >25% d'un sel d'ammonium quaternaire,
<1% détergent anionique, colorant
Solution de Rinçage (RIN) prêt à l'emploi
Milieu tamponné, <1% NaCl, <1% de détergent anionique
Conjugué Concentré (CON-C) concentré
contient de la phosphatase alcaline conjugué à la
streptavidine, colorant
Tampon Conjugué (CON-D)
Milieu tamponné, 1% agent bloquant, <1% NaCl
Substrat Concentré (SUB-C) concentré
contient Dimethyl Sulfoxide, composé chromogénique
Tampon Substrat (SUB-D)
Milieu tamponné, <1% NaCl, <1% MgCl2
manuel d'utilisation, portoir, matrice, feuille de lecture
12
0,5 ml
0,025 ml
0,3 ml
20 ml
20 ml
50 ml
0,2 ml
20 ml
0,2 ml
20 ml
1 de chaque
Matériel Requis mais Non Fourni
Bain-marie agitateur/TwinCubator®
Chronomètre
Eau distillée
Embouts de pipettes
(de préférence stériles avec filtre)
– Eprouvette
–
–
–
–
Contrôle Conjugué (CC)
Une ligne colorée doit se développer dans cette zone. Cette ligne témoigne de la
bonne fixation du conjugué et du bon déroulement de la révélation.
Gants à usage unique
Papier absorbant
Pincettes
Pipettes réglables pour 10, 20, 200,
et 1000 µl
– Plateau agitateur
– Thermomètre calibré
Données Techniques
Echantillon requis:
Contrôle Spécificité (Spec-C)
Aucune ligne colorée ne doit se développer dans cette zone. Le développement d'une
ligne colorée de forte intensité témoigne de conditions réactionnelles suboptimales
(par exemple température trop basse durant l'étape de lavage stringent) et indique
une réaction non spécifique. Dans ce cas, répéter le test.
–
–
–
–
Volume nécessaire:
Durée du test:
Conservation:
sang total (prélevé sur EDTA ou citrate de sodium)/ prélèvement buccal
20 µl de solution d'ADN amplifié par échantillon
approximativement 2 heures
2–8°C; pour conserver >4 semaines, le mélange PN et l'ADN Contrôle doivent être conservés à −20°C
Contrôle Sensibilité IL-1A –889 (Sens-IL-1A)
Une ligne colorée doit se développer dans cette zone, indiquant que le test présente
une sensibilité optimale.
Art. No.: 5001
12 tests
IL-1A −C889
Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'allèle
1 (C) en position –889 du gène IL-1A.
IL-1A −889T
Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'allèle
2 (T) en position –889 du gène IL-1A. Lorsque le patient est porteur d'une mutation
Fabricant
Hain Lifescience GmbH, Hardwiesenstraße 1, 72147 Nehren, Allemagne
http://www.hain-lifescience.de
Packungsbeilage lesen
consult operating instructions
Consulter le manuel d’utilisation
Chargennummer
batch code
Numéro de lot
Positivkontrolle
positive control
Contrôle positif
Temperaturbereich
temperature limitation
Limite de température
Haltbar bis
use by
A utiliser avant
Bestellnummer
catalogue number
Référence
Nur für den in vitro-Gebrauch
for in vitro use only
Pour usage in vitro uniquement
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