GenoType® PST® Extraction et Amplification de l’ADN du Cluster de Gènes de l’Interleukine 1 Humaine 7. Transférer le surnageant dans un tube propre et étiquetté. 8. Utiliser 5 µl pour la PCR. Introduction Un protocole détaillé peut être obtenu chez votre distributeur ou à l’adresse internet : http://www.hain-lifescience.de/pdf/dnaisol_swabs.pdf Ce protocole décrit la procédure d’amplification multiplex de fragments des gènes humains IL-1A et IL-1B. Préparation de la PCR La PCR est couverte par des brevets détenus par la société Hoffmann-La Roche. Aucune autorisation, licence implicite ou explicite pour la pratique de la PCR ni aucune autre méthode utilisant la PCR ne sont couvertes en cas d’acquisition de cette trousse. Les informations sur l’obtention d’une licence pour la pratique de la PCR ou sur d’autres méthodes utilisant la PCR peuvent être obtenues en contactant F. Hoffmann-La Roche AG, CH – 4002 Basel. Conservation et Précautions Dès réception, conserver le mélange Amorces/Nucléotides (PNM), ainsi que l’ADN de contrôle (HCD) à 2–8°C et isolés de toute source d’ADN potentiellement contaminante. Si la durée de conservation doit excéder 4 semaines, conserver à −20°C. Il est recommandé d’aliquoter le mélange PN afin d’éviter les congélations/décongélations répétées. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de leur date de péremption. Tous les échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et être manipulés comme tel. Observer les précautions usuelles pour la préparation de l’amplification. Il est essentiel que le matériel et les réactifs utilisés pour l’extraction de l’ADN et pour la préparation de la PCR soient exempts de DNases. Ne pas mélanger les réactifs provenant de différents lots de trousses. Matériel Requis mais Non Fourni – ADN polymérase thermostable avec tampon (enzyme de type «hot start» recommandée, taux d’extension : (2–4 kb/min à 72°C, demi-vie : 10 min à 97°C, 60 min à 94°C, rendement d’amplification : >105) – Bloc chauffant (précision +/−1°C) – Centrifugeuse de paillasse – Eau (niveau de pureté pour Biologie Moléculaire) – Embouts de pipettes stériles avec filtre – Gants à usage unique – Huile minérale, niveau de pureté pour Biologie Moléculaire (pour thermocycleur sans couvercle chauffant) – Kit pour l’extraction de l’ADN et réactifs associés – Micro-tubes pour extraction de l’ADN (1,5 ml) et tubes pour thermocycleur; exempt de contamination par DNase et RNase – Pipettes réglables pour 10, 20, 200, et 1000 µl – Thermocycleur (taux de chauffage : 3°C/sec, taux de refroidissement : 2°C/sec, précision : +/−0,2°C) Extraction de l’ADN L’ADN doit être extrait à partir de sang prélevé en tube EDTA/citrate ou à partir de prélèvements buccaux. L’espace de travail doit être exempt de toute trace d’ADN amplifié. Toutes les procédures d’extraction de l’ADN produisant de l’ADN amplifiable peuvent être employées. Lorsque les prélèvements buccaux sont utilisés comme matériel de départ, le protocole rapide ci-après permet de récupérer une quantité d’ADN suffisante pour l’amplification : 1. Placer l’écouvillon buccal dans un tube de 1,5 ml et couper la tige à environ 1,5 cm de la tête de l’écouvillon. (la tige doit emerger de la solution durant l’étape 2. 2. Ajouter 200 µl de NaOH 50 mM à chaque échantillon et vortexer au moins 30 secondes. 3. Incuber 5 minutes à 95°C. 4. Vortexer 15 secondes et centrifuger 1 seconde. Récuperer l’écouvillon à l’aide de pincettes. Presser la tête de l’écouvillon contre les parois du tube pour en extraire tout le liquide. 5. Ajouter 20 µl de tampon Tris 1M pH 8.0 6. Vortexer brièvement et centrifuger 1 minute en pleine vitesse dans une centrifugeuse de paillase. Préparer le mélange réactionnel (45 µl) dans une pièce exempte d’ADN. L’échantillon d’ADN doit être rajouté dans une pièce séparée. Il est recommandé d’utiliser une ADN polymérase de type «hot start». Si cette enzyme n’est pas utilisée, réaliser toutes les opérations de pipetage sur de la glace. Préparer le mélange suivant par tube : – 35 µl de mélange Amorces/Nucléotides (PNM) – 5 µl de tampon d’incubation de la polymérase 10x – non fourni – x µl de MgCl21) – non fourni – 1–2 unité(s) d’ADN polymérase thermostable (se référer au manuel) – non fourni – y µl d’eau (niveau de pureté pour Biologie Moléculaire) qsp 45 µl (hors volume de l’enzyme) – non fourni – Ajouter 5 µl de solution d’ADN (20–100 ng d’ADN) pour atteindre un volume final de 50 µl (hors volume de l’enzyme) 1) Selon le système tampon/enzyme utilisé, la concentration optimale de MgCl2 peut varier de 1,5 à 2,5 mM. A noter que certains tampons contiennent déjà le MgCl2. Déterminer le nombre d’échantillons à amplifier (nombre d’échantillons à analyser + contrôles). La solution d’ADN à amplifier est remplacée par 5 µl d’eau (contrôle négatif) ou par 5 µl d’ADN contrôle (HCD, contrôle positif). L’ADN de contrôle est de type sauvage pour les deux loci examinés. La solution d’ADN de contrôle doit être considérée comme potentiellement infectieuse. Préparer une solution mère de mélange réactionnel contenant tous les réactifs à l’exception de l’ADN, et bien homogénéiser (ne pas vortexer). Si le thermocycleur ne possède pas de couvercle chauffant, recouvrir les échantillons d’huile minérale. Profil d’amplification 5 min2) 95°C – 1 cycle 30 sec 2 min 95°C 58°C – – 10 cycles 25 sec 40 sec 40 sec 95°C 53°C 70°C – – – 20 cycles 8 min 70°C – 1 cycle 2) La durée de cette étape doit être rallongée en cas d’utilisation d’ADN polymérase de type «hot start» (se référer au manuel de l’enzyme). Selon le thermocycleur utilisé, le profil d’amplification peut demander des modifications (contacter votre distributeur). Les produits de l’amplification peuvent être conservés à +4 ou −20°C. La réaction d’amplification peut être contrôlée par électrophorèse en gel d’agarose 2% en déposant directement 5 µl de chaque échantillon (sans aucun tampon additionnel). Les amplicons ont une taille de 187 pb (gène IL-1A) et de 192 pb (gène IL-1B). Fabricant Hain Lifescience GmbH, Hardwiesenstraße 1, 72147 Nehren, Allemagne http://www.hain-lifescience.de GenoType® PST® Test d'Analyse Génétique pour la Détection Combinée des Polymorphismes IL-1A −889 et IL-1B +3953 du Cluster du Gène de l'Interleukine-1 Principe Le test GenoType® PST® est basé sur la technologie DNA•STRIP® qui permet la caractérisation combinée des polymorphismes en position –889 du gène humain interleukine (IL)-1A et en position +3953 du gène humain IL-1B. La procédure complète comporte trois phases : extraction de l'ADN à partir d'échantillons de patients (matériel requis pour l'extraction de l'ADN non fourni), une amplification multiplex à l'aide d'amorces biotinylées (ADN polymérase thermostable non fournie), et détection de l'ADN amplifié par hybridation inverse. Cette dernière phase comporte les étapes suivantes : dénaturation chimique de l'ADN amplifié, hybridation des amplicons simples brins biotinylés aux sondes préimmobilisées sur la membrane, lavage stringent, et enfin addition d'un conjugué streptavidine / phosphatase alcaline suivie d'une révélation chromogénique. Les signaux obtenus sont facilement et rapidement interprétés à l'aide d'une matrice fournie avec chaque trousse. Précautions Tous les échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et être manipulés comme tel. Les échantillons prélevés sur des patients à risques doivent être identifiés et manipulés dans des conditions de sécurité adéquates. Suivre les recommandations (fédérale, nationale, locale) d'hygiène, de sécurité et d´environment. Se protéger à l'aide de vêtements adéquats et de gants. Lors de la manipulation du kit, tenir compte des indications de sécurité suivantes : La Solution de Dénaturation (DEN) contient du NaOH (<2%) et est irritante pour la peau et les yeux (R36/38 et S26, S37/39, S45). Le Substrat Concentré (SUB-C) contient Dimethyl Sulfoxide et est irritante (R36/37/ 38, S23-26-36). Pour des informations supplémentaires, consulter les fiches de sécurité. homozygote pour cet allèle, une ligne colorée se développe uniquement dans cette zone. Lorsque le patient est porteur d'une mutation hétérozygote, une ligne colorée se développe parallèlement dans la zone «IL-1A −C889». Contrôle Sensibilité IL-1B +3953 (Sens-IL-1B) Une ligne colorée doit se développer dans cette zone, indiquant que le test présente une sensibilité optimale. IL-1B +C3953 Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'allèle 1 (C) en position +3953 du gène IL-1B. IL-1B +3953T Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'allèle 2 (T) en position +3953 du gène IL-1B. Lorsque le patient est porteur d'une mutation homozygote pour cet allèle, une ligne colorée se développe uniquement dans cette zone. Lorsque le patient est porteur d'une mutation hétérozygote, une ligne colorée se développe parallèlement dans la zone «IL-1B +C3953». Les différents profils de résultats et leur interprétation pour les deux loci testés, ainsi que le niveau de risque PST sont résumés dans les tableaux ci-dessous. Contrôle Conjugué Contrôle Spécificité Contrôle Sensibilité IL-1A −889 IL-1A −C889 (allèle 1) IL-1A −889T (allèle 2) Contrôle Sensibilité IL-1B +3953 IL-1B +C3953 (allèle 1) IL-1B +3953T (allèle 2) Contrôle de Qualité Afin de contrôler le bon déroulement du test et le bon fonctionnement des réactifs, chaque bandelette comporte quatre zones de contrôle : – une zone «Contrôle Conjugué» pour contrôler la fixation du conjugué sur la bandelette et le bon déroulement de la révélation chromogénique – deux zones «Contrôle Sensibilité» pour contrôler la sensibilité optimale pour chacun des loci testés – une zone «Contrôle Spécificité» pour contrôler l'absence de résultats faux-positifs 1 2 3 4 5 6 7 8 9 IL-1A −889 allèle 1 allèle 1 + allèle 2 allèle 2 allèle 1 allèle 1 + allèle 2 allèle 2 allèle 1 allèle 1 + allèle 2 allèle 2 1 x 2 x 3 x 4 x 5 x 6 x 7 x 8 x 9 x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x IL-1B +3953 allèle 1 allèle 1 allèle 1 allèle 1 + allèle 2 allèle 1 + allèle 2 allèle 1 + allèle 2 allèle 2 allèle 2 allèle 2 x x x x GenoType® PST® négatif négatif négatif négatif positif positif négatif positif positif Procédure Préparation Préchauffer bain-marie agitateur/TwinCubator® à exactement 45°C +/−1°C. Préchauffer les solutions HYB et STR à 37–45°C avant utilisation. Les réactifs ne doivent présenter aucun précipité (à noter cependant que la solution CON-D est opaque). Si besoin, agiter. Equilibrer les autres réactifs (à l'exception de les solutions CON-C et SUB-C) à température ambiante. Dans un tube approprié, diluer le Conjugué Concentré (CON-C, orange) et le Substrat Concentré (SUB-C, jaune) au 1 :100 dans un volume adéquat du tampon correspondant (CON-C avec CON-D, SUB-C avec SUB-D). Bien homogénéiser et équilibrer à température ambiante. Pour chaque échantillon testé, ajouter 10 µl de concentré à 1 ml de tampon. Diluer CON-C avant chaque utilisation. Une fois dilué, SUB-C reste stable pendant 4 semaines conservé à température ambiante et à l’obscurité. Tous les échantillons portant au moins une copie de l'allèle 2 au niveau des 2 loci testés sont considérés comme positif pour le GenoType® PST®. L'intensité d'un signal positif doit être comparaple à l'intensité du contrôle sensibilité correspondant. Les résultats restent interprétable même lorsque la bande de contrôle de spécificité présente une faible coloration. Néanmoins, les bandes présentant une intensité comparable à celle de la bande de contrôle de spécificité doivent être considérées non spécifiques. 1. Déposer 20 µl de Solution de Dénaturation (DEN, bleu) à une extrémité de chaque puit utilisé. 2. Ajouter 20 µl d'échantillon amplifié et mélanger les deux solutions par pipetages répétés. Incuber 5 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, à l’aide d’une pince, sortir du tube le nombre approprié de bandelettes (STRIPS), et inscrire au crayon leur numéro d'identification dans l'espace situé sous la ligne de repère. Toujours porter des gants pour manipuler les bandelettes. 3. Ajouter dans chaque puit 1 ml de Tampon d’Hybridation (HYB, vert) préchauffé et homogénéisé. Homogénéiser jusqu’à ce que le mélange devienne une couleur homogène. Eviter les éclaboussures vers les autres puits. 4. Déposer une bandelette dans chaque puit utilisé. Les bandelettes doivent être entièrement recouvertes par le liquide, avec la face sensibilisée (identifiable par la ligne de repère) tournée vers le haut. Les ban- Causes d'Erreurs Limitations En vue de l'amplification, l'ADN doit avoir été extrait à l'aide d'une méthode appropriée. L'ADN cible doit avoir été correctement amplifié. Résultats faibles ou absence de signal (incluant la zone de contrôle conjugué) – Température ambiante trop basse ou réactifs mal équilibrés. – CON-C et/ou SUB-C trop dilué ou CON-D et/ou SUB-D utilisé sans dilution préalable. Résultats faibles ou absence de signal, excepté dans la zone de contrôle conjugué. – La qualité et/ou la quantité de l'ADN extrait n'ont pas permis une amplification correcte. Analyser l'ADN amplifié sur un gel agarose 2%. Si aucun amplicon n'est visible, répéter les étapes d'extraction et d'amplification. Essayer éventuellement une autre méthode d'extraction de l'ADN (se reporter au manuel «Extraction et Amplification du Cluster de Gène de l'Interleukine-1 Humaine»). – Température d’incubation trop élevée. Signaux faux positifs delettes mal orientées doivent être remises en position à l'aide de pincettes propres. Afin d'éviter toute contamination, bien nettoyer les pincettes après chaque utilisation. Cella vaut aussi pour tous les étapes suivantes. 5. Placer la plaque dans bain-marie agitateur/TwinCubator® et incuber 30 minutes à 45°C. Pour le bain-marie agitateur sélectionner une fréquence d'agitation suffisante pour assurer un bon brassage de tampon. Ajuster le niveau de l’eau dans le bainmarie agitateur à mi-hauteur des puits de façon à assurer un bon transfert de chaleur. Cela vaut aussi pour tous les étapes suivantes. 6. Aspirer le contenu des puits. Utiliser par exemple une pipette pasteur reliée à une pompe à vide. 7. Ajouter à chaque puit 1 ml de Solution de Lavage Stringent (STR, rouge) et incuber 15 minutes à 45°C dans bain-marie agitateur/TwinCubator®. 8. A partir de cette étape, travailler à température ambiante. Eliminer la Solution de Lavage Stringent. Vider la Solution de Lavage Stringent dans un container à déchets. Eliminer tout le liquide résiduel en retournant les puits sur du papier absorbant (effectuer de même pour les autres étapes de lavage). 9. Laver chaque puit avec 1 ml de Solution de Rinçage (RIN) et incuber pendant une minute sous agitation. Vider la Solution de Rinçage. 10. Ajouter à chaque puit 1 ml de Conjugué dilué (voir ci-dessus) et incuber sous agitation 30 minutes. 11. Vider le contenu des puits et rincer sous agitation 1 minute à l’aide de 1 ml de Solution de Rinçage (RIN). Vider RIN. Répéter ce rinçage une nouvelle fois, puis rincer une fois avec environ 1 ml d'eau distillée à l'aide d'une pissette. Bien éliminer toute trace d'eau dans les puits après cette dernière étape. 12. Ajouter 1 ml de Substrat dilué (voir ci-dessus) dans chaque puit et incuber sans agitation à l’obscurité. Le temps de révélation peut varier en fonction des conditions de déroulement du test (de 3 à 20 minutes), notamment de la température de la pièce. Des temps de révélation trop longs peuvent entrainer un bruit de fond qui peut géner l'interprétation des résultats. 13. Arrêter la réaction en rinçant brièvement deux fois à l'eau distillée. 14. A l'aide de pincettes, récupérer les bandelettes et les sécher entre deux couches de papier absorbant. Lecture et Interprétation des Résultats Classer et ranger les bandelettes à l'abri de la lumière. Une feuille de lecture est fournie avec le kit, mais peut également être téléchargée à l'adresse suivante : http://www.hain-lifescience.de/pdf/pst_evaluation.pdf La matrice fournie avec la trousse permet d'identifier chaque zone réactionnelle par superposition. Chaque bandelette comprend 8 zones réactionnelles (voir figure). – Température d’incubation basse. – Tampon d'Hybridation et/ou Solution de Lavage Stringent incorrectement équilibrés ou homogénéisés. – Contamination de l'ADN extrait et/ou des réactifs d'amplification avec de l'ADN précédemment extrait ou amplifié. Lorsque les réactifs d'amplification sont contaminés, un échantillon de contrôle négatif entraîne également le développement des lignes tests. – Dans certaines conditions de test, une forte concentration d'ADN amplifié peut entraîner une réaction chromogénique très rapide. En pareil cas, afin de prévenir le développement de bandes dues à des réactions d'hybridation croisées, arrêter la réaction chromogénique dès que les premières lignes colorées deviennent visibles. – Contamination des puits voisins par des éclaboussures lors de l'addition du Solution d'Hybridation. Coloration non homogène – Les bandelettes n'ont pas été suffisamment immergées lors des différentes incubations. – Le portoir n'a pas été correctement agité. Bruit de fond important – CON-C et/ou SUB-C trop concentré. – Les étapes de lavage n'ont pas été correctement effectuées. – Les solutions de lavage étaient trop froides lors de leur utilisation. Composition du Kit Quantité Bandelettes sensibilisées avec les sondes spécifiques (STRIPS) Mélange PN (PNM) contient amorces spécifiques des loci testés, nucléotides, colorant ADN Contrôle (HCD) prêt à l'emploi contient 5–20 ng/µl d'ADN humain Solution de Dénaturation (DEN) prêt à l'emploi contient <2% NaOH, colorant Solution d'Hybridation (HYB) prêt à l'emploi contient 8–10% de détergent anionique, colorant Solution de Lavage Stringent (STR) prêt à l'emploi contient >25% d'un sel d'ammonium quaternaire, <1% détergent anionique, colorant Solution de Rinçage (RIN) prêt à l'emploi Milieu tamponné, <1% NaCl, <1% de détergent anionique Conjugué Concentré (CON-C) concentré contient de la phosphatase alcaline conjugué à la streptavidine, colorant Tampon Conjugué (CON-D) Milieu tamponné, 1% agent bloquant, <1% NaCl Substrat Concentré (SUB-C) concentré contient Dimethyl Sulfoxide, composé chromogénique Tampon Substrat (SUB-D) Milieu tamponné, <1% NaCl, <1% MgCl2 manuel d'utilisation, portoir, matrice, feuille de lecture 12 0,5 ml 0,025 ml 0,3 ml 20 ml 20 ml 50 ml 0,2 ml 20 ml 0,2 ml 20 ml 1 de chaque Matériel Requis mais Non Fourni Bain-marie agitateur/TwinCubator® Chronomètre Eau distillée Embouts de pipettes (de préférence stériles avec filtre) – Eprouvette – – – – Contrôle Conjugué (CC) Une ligne colorée doit se développer dans cette zone. Cette ligne témoigne de la bonne fixation du conjugué et du bon déroulement de la révélation. Gants à usage unique Papier absorbant Pincettes Pipettes réglables pour 10, 20, 200, et 1000 µl – Plateau agitateur – Thermomètre calibré Données Techniques Echantillon requis: Contrôle Spécificité (Spec-C) Aucune ligne colorée ne doit se développer dans cette zone. Le développement d'une ligne colorée de forte intensité témoigne de conditions réactionnelles suboptimales (par exemple température trop basse durant l'étape de lavage stringent) et indique une réaction non spécifique. Dans ce cas, répéter le test. – – – – Volume nécessaire: Durée du test: Conservation: sang total (prélevé sur EDTA ou citrate de sodium)/ prélèvement buccal 20 µl de solution d'ADN amplifié par échantillon approximativement 2 heures 2–8°C; pour conserver >4 semaines, le mélange PN et l'ADN Contrôle doivent être conservés à −20°C Contrôle Sensibilité IL-1A –889 (Sens-IL-1A) Une ligne colorée doit se développer dans cette zone, indiquant que le test présente une sensibilité optimale. Art. No.: 5001 12 tests IL-1A −C889 Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'allèle 1 (C) en position –889 du gène IL-1A. IL-1A −889T Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'allèle 2 (T) en position –889 du gène IL-1A. Lorsque le patient est porteur d'une mutation Fabricant Hain Lifescience GmbH, Hardwiesenstraße 1, 72147 Nehren, Allemagne http://www.hain-lifescience.de Packungsbeilage lesen consult operating instructions Consulter le manuel d’utilisation Chargennummer batch code Numéro de lot Positivkontrolle positive control Contrôle positif Temperaturbereich temperature limitation Limite de température Haltbar bis use by A utiliser avant Bestellnummer catalogue number Référence Nur für den in vitro-Gebrauch for in vitro use only Pour usage in vitro uniquement ">
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