MACHEREY-NAGEL Biologie moléculaire Bioanalysis Manuel d’utilisation User manual ARN à partir de sang n NucleoMag® RNA Blood Avril 2024 / Rev. 02 www.mn-net.com www.mn-net.com Contact MN Germany and international MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-0 Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only) E-mail: info@mn-net.com Technical Support Bioanalysis Tel.: +49 24 21 969-333 E-mail: support@mn-net.com USA MACHEREY-NAGEL Inc. 924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA Toll-free: 888 321 6224 (MACH) E-mail: sales-us@mn-net.com France MACHEREY-NAGEL SAS 1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France Tel.: +33 388 68 22 68 E-mail: sales-fr@mn-net.com MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 € Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531 Switzerland MACHEREY-NAGEL AG Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland Tel.: +41 62 388 55 00 E-mail: sales-ch@mn-net.com www.mn-net.com ARN à partir de sang Sommaire 1 Composants 4 1.1 Contenu du kit 4 1.2 Réactifs, équipements et consommables à fournir par l’utilisateur 4 1.3 Tampons, consommables et équipements supplémentaires à fournir pour la procédure de traitement des Tempus™ Blood RNA Tubes 6 1.4 Tampons supplémentaires à fournir pour la procédure de traitement des tubes collecteurs de sang EDTA / citrate 6 1.5 A propos de ce manuel 6 2 Description du produit 7 2.1 Principe général 7 2.2 Caractéristiques du kit 7 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons 8 2.4 Systèmes de séparation magnétique 8 2.5 Réglage des paramètres d’agitation 9 2.6 Manipulation des billes 11 2.7 Procédures d’élution 12 2.8 Assistance à l’automatisation 12 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 13 4 Instructions de sécurité 14 4.1 Elimination des déchets 14 ® 5 Extraction d’ARN à partir de sang prélevé dans des tubes collecteurs S-Monovette RNA Exact de SARSTEDT ou DNA/RNA Shield™Blood de Zymo Research. 15 6 Extraction d’ARN à partir de sang collecté dans des tubes Tempus™ Blood RNA 21 7 Extraction d’ARN à partir de sang prélevé dans des tubes collecteurs EDTA / Citrate 29 8 Annexes 35 8.1 Guide de résolution des problèmes 35 8.2 Informations de commande 37 8.3 Restrictions d’utilisation du produit / garantie 38 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 3 ARN à partir de sang 1 Composants 1.1 Contenu du kit NucleoMag® RNA Blood 1 × 96 preps 744352.1 4 × 96 preps 744352.4 NucleoMag® B-Beads 1.8 mL 4 × 1.8 mL Tampon de fixation MRB1 50 mL 200 mL Tampon de lavage MRB2 125 mL 1 × 300 mL REF 1 × 125 mL H2O RNase-free 30 mL 60 mL Protéinase K liquide 1.8 mL 7 mL rDNase, lyophilisée* 3 flacons (taille D) 12 flacons (taille D) Tampon de réaction pour la rDNase Notice d’utilisation 1.2 60 mL 3 × 60 mL 1 1 Réactifs, équipements et consommables à fournir par l’utilisateur Réactifs • Éthanol à 80 % (v/v) pour les étapes de lavage (éthanol absolu ou non dénaturé) Échantillons • Echantillons de sang, collectés dans des tubes collecteurs de sang EDTA / citrate ou dans l’un des tubes collecteurs de sang suivants (les tubes collecteurs de sang ne sont pas fournis avec le kit NucleoMag® RNA Blood) : Tube collecteur de sang ® Fournisseur S-Monovette RNA Exact SARSTEDT (01.2048.001) Tempus™ Blood RNA Tubes Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific (4342792) DNA/RNA Shield™ Blood Tubes Zymo Research (R1150) 4 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 ARN à partir de sang Consommables • Cônes de pipette stériles RNase-free (recommandé) Produit REF Conditionnement Système de séparation magnétique p.e., NucleoMag® SEP (voir le paragraphe 2.3) ; il est également possible d’utiliser des dispositifs de manipulation des liquides ou des extracteurs à barreaux magnétique automatisés tels que IsoPure™ Mini, MagnetaPure 32 Plus ou KingFisher® Flex*. 744900 1 Plaques pour la séparation des billes 740481 4 magnétiques, 740481.24 24 p.e., Square-well Block (bloc 96 puits avec des puits carrés de 2.1 mL) Consommables pour l’automate KingFisher® Flex : ex. Kit d’accessoires ’96-well Accessory Kit B’ pour KingFisher™ (Square-well Blocks, tip combs, plaques d’élution pour 4 × 96 preps NucleoMag® RNA Blood). 744951 1 set Plaques 96 puits profonds pour les systèmes à barreaux magnétiques p.e. pour MagnetaPure 32 Plus ou IsoPure™ Mini 744955 25 Tips comb 8 positions pour les systèmes à barreaux magnétiques p.e. pour MagnetaPure 32 Plus ou IsoPure™ Mini 744960 50 *Veuillez contacter MACHEREY‑NAGEL pour une assistance technique. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 5 ARN à partir de sang 1.3 Tampons, consommables et équipements supplémentaires à fournir pour la procédure de traitement des Tempus™ Blood RNA Tubes • Tampon de lyse DL (REF 740202.32 ; flacon de 100 mL ; voir les informations de commande) • H2O RNase-free (REF 740378.1000 flacon de 1000 mL ; voir les informations de commande) • Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) • Tubes coniques de 50 mL avec bouchon à vis • Vortex, p.e. Vortex-Genie®2 (Scientific Industries) • Centrifugeuse avec rotor à godet pivotant et adaptateurs pour tubes coniques de 50 mL (capacité de 4 °C, 3000 à 4400 × g) 1.4 Tampons supplémentaires à fournir pour la procédure de traitement des tubes collecteurs de sang EDTA / citrate • Tampon de lyse DL (REF 740202.32 ; flacon de 100 mL ; voir les informations de commande) • Tampon de lavage RAW (REF 740361.150 ; flacon de 150 mL ; voir les informations de commande) 1.5 A propos de ce manuel Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs de lire les paragraphes détaillés du protocole du kit NucleoMag® RNA Bood avant d’utiliser ce produit. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil de suivi rapide de la procédure de purification. Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante : www.mn‑net.com 6 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 ARN à partir de sang 2 Description du produit 2.1 Principe général Le kit NucleoMag® RNA Blood permet d’extraire l’ARN à partir d’échantillons de sang. Les tubes collecteurs de sang avec stabilisation des ARN de SARSTEDT, Zymo Research et Thermo Fisher Scientific ainsi que les tubes collecteurs de sang EDTA/citrate peuvent être traités. La procédure NucleoMag® RNA Blood est basée sur l’adsorption réversible d’acides nucléiques sur des billes paramagnétiques dans des conditions de tampons appropriées. La lyse des échantillons est réalisée par une digestion à la protéinase K. Pour ajuster les conditions dans lesquelles les acides nucléiques se lient aux billes paramagnétiques, le tampon MRB1 et les NucleoMag® B-Beads sont ajoutés au lysat. Après la séparation magnétique et deux étapes de lavage, les billes paramagnétiques sont incubées avec une DNase recombinante pour éliminer l’ADN copurifié. Après une étape de refixation de l’ARN, les contaminants résiduels et les sels sont éliminés par une étape de lavage supplémentaire. L’éthanol résiduel de l’étape de lavage précédente est éliminé par séchage à l’air. Enfin, l’ARN hautement pur est élué avec de l’H2O RNase-free et l’ARN peut être directement utilisé pour des applications en aval. Le kit peut être utilisé manuellement ou automatiquement sur des robots pipeteurs standard ou des séparateurs magnétiques automatisés. Les tubes collecteurs de sang S-Monovette® RNA Exact de SARSTEDT et DNA/RNA Shield™ Blood de Zymo Research peuvent être traités avec le même protocole. Les tubes de prélèvement de sang dans EDTA/citrate et de Tempus™ Blood RNA de Thermo Fisher Scientific nécessitent une procédure avec un protocole adapté (voir paragraphe 5 ou paragraphe 6). 2.2 Caractéristiques du kit • Le kit NucleoMag® RNA Blood est conçu pour la préparation rapide, manuelle et automatisée à petite échelle d’ARN très pur à partir d’échantillons de sang stabilisés ou EDTA/citrate. Le kit est conçu pour être utilisé avec le séparateur magnétique NucleoMag® SEP (voir les informations de commande, paragraphe 8.2) ou d’autres systèmes de séparation magnétique (voir paragraphe 2.4). En règle générale, 96 échantillons peuvent être purifiés en 120 minutes lorsque la purification est effectuée manuellement à l’aide du NucleoMag® SEP, ou en 90 minutes environ avec les systèmes de barreaux magnétiques automatisés, selon le type et la configuration du système. • L’ARN purifié peut être utilisé directement comme matrice pour la RT-PCR ou tout type de réaction enzymatique. • Grâce à la DNase recombinante fournie avec le kit, l’ARN élué est pratiquement exempt d’ADN. • Réserver à l’usage de la recherche. • NucleoMag® RNA Blood permet une automatisation facile sur les instruments courants de manipulation des liquides ou les séparateurs magnétiques automatisés, par exemple les instruments MagnetaPure 32 Plus et IsoPure™ de MACHEREY‑NAGEL ou les instruments KingFisher® deThermo Fisher Scientific. Le MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 7 ARN à partir de sang temps de préparation réel dépend de la configuration de l’instrument et du système de séparation magnétique utilisé. • Le kit fournit des réactifs pour la purification d’un maximum de 6 μg d’ARN pur à partir d’échantillons appropriés. Les rendements typiques se situent entre 3 µg et 4 µg d’ARN. Selon le volume d’élution utilisé, des concentrations de 40 à 80 ng/μL peuvent être obtenues. • Le NucleoMag® RNA Blood peut être entièrement traité à température ambiante. • Les NucleoMag® B-Beads sont des billes superparamagnétiques hautement réactives. La capacité de fixation est d’environ 0,4 μg / μL d’ARN pour 1 μL de suspension de NucleoMag® B-Beads. 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons Environnement de travail Maintenir un environnement de travail exempt de RNase A. Porter des gants à tout moment pendant la préparation. Changer fréquemment de gants. Stockage des échantillons Le protocole est optimisé pour l’extraction de l’ARN à partir des tubes collecteurs de sang S-Monovette® RNA Exact de SARSTEDT, des DNA/RNA Shield™ Blood de Zymo Research. Les tubes Tempus™ Blood RNA de chez Thermo Fisher Scientific nécessite cependant une adaptation du protocole. Manipuler et conserver les tubes collecteurs de sang conformément aux instructions du fabricant. Inverser les tubes collecteurs de sang plusieurs fois avant de prélever une aliquote pour l’extraction. Décongeler les tubes de prélèvement sanguin congelés de SARSTEDT, Zymo Research ou Thermo Fisher Scientific immédiatement avant l’extraction de l’ARN et les laisser s’équilibrer à température ambiante avant de prélever une aliquote pour l’extraction. La congélation des tubes collecteurs de sang EDTA ou citrate présente le risque de dégradation de l’ARN au cours de la procédure de décongélation. Il est fortement recommandé de procéder à la procédure des échantillons de sang EDTA / citrate dans les quelques heures qui suivent leur collecte. Les échantillons doivent être conservés à 4 °C pendant 24 heures au maximum. Les ARNm contenus dans les cellules sanguines ont des stabilités différentes. Par conséquent, afin de s’assurer que l’ARN isolé contient une distribution représentative des ARNm, les échantillons de sang ne doivent pas être stockés pendant de longues périodes avant d’isoler l’ARN. Porter des gants en permanence pendant la préparation. Changer fréquemment de gants. 2.4 Systèmes de séparation magnétique Pour l’utilisation du NucleoMag® RNA Blood, il est recommandé d’utiliser le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. La séparation est effectuée dans un Square-well Blocks (voir les informations de commande, paragraphe 8.2). Le kit peut également être utilisé avec d’autres séparateurs courants. Voir les informations de commande des fournisseurs pour les plaques de séparation appropriées. 8 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 ARN à partir de sang Séparateur magnétique ® Plaque ou tube de séparation NucleoMag SEP (MN REF 744900) Square-well Block (MN REF 740481/.24) Tecan Te-MagS™ Tubes de 1,5 mL sans couvercle (Sarstedt) Séparation à aimants statiques Les séparateurs à aimants statiques, par exemple, NucleoMag® SEP (pour une utilisation manuelle et sur les stations de travail de manipulation des liquides) : Ce type de séparateur sont recommandés en combinaison avec un agitateur de microplaques approprié pour une remise en suspension optimale des billes pendant les étapes de lavage et d’élution. Alternativement, les billes peuvent être remises en suspension dans le tampon par pipetages successifs. Pour une utilisation entièrement automatisée sur les stations de travail de manipulation des liquides, un bras manipulateur est nécessaire. La plaque est transférée vers le séparateur magnétique pour la séparation des billes et transférée vers le module agitateur pour la remise en suspension des billes. Systèmes magnétiques mobiles Pour les séparateurs à aimants mobiles, les aimants / tiges magnétiques sont déplacés d’un côté à l’autre du puits et vice versa. Les billes suivent ce mouvement et sont ainsi entraînées à travers le tampon pendant les étapes de lavage et d’élution. La séparation a lieu lorsque le système s’arrête. Séparateurs automatisés Pour ce type de séparateurs à aimants mobiles, les billes magnétiques sont transférées dans des plaques ou des tubes appropriés. Les billes sont remises en suspension à partir des aimants recouverts de protection. Après chaque étape de fixation, de lavage ou d’élution, les billes sont collectées et transférées automatiquement dans le réactif correspondant à l’étape suivante. 2.5 Réglage des paramètres d’agitation Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques pour les étapes de lavage et d’élution, les paramètres d’agitation doivent être soigneusement réglés pour chaque plaque de séparation et chaque agitateur afin d’éviter toute contamination croisée d’un puits à l’autre. Procéder comme suit : Réglage de la vitesse de l’agitateur pour les étapes de lavage : • Charger 900 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque sur l’agitateur et commencer à agiter avec un paramètre de vitesse MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 9 ARN à partir de sang modérée pendant 30 secondes. Éteindre l’agitateur et vérifier la présence de petites gouttelettes d’eau colorée à la surface de la plaque. • Augmenter le paramètre de vitesse, agiter pendant 30 secondes supplémentaires et vérifier à nouveau la présence de gouttelettes à la surface de la plaque. • Continuer à augmenter le paramètre de vitesse jusqu’à ce que vous observiez des gouttelettes sur le dessus de la plaque de séparation. Réduire le paramètre de vitesse, vérifier à nouveau et utiliser ce réglage pour l’étape de lavage. Réglage de la vitesse de l’agitateur pour l’étape d’élution : • Charger 100 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de collecte et procéder comme décrit ci-dessus. 10 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 ARN à partir de sang 2.6 Manipulation des billes Distribution des billes Une distribution homogène des billes magnétiques dans les différents puits de la plaque de séparation est essentielle pour assurer une grande cohérence d’un puits à l’autre. Par conséquent, avant de distribuer les billes, s’assurer que les billes sont complètement remises en suspension. Bien agiter le flacon de stockage ou le placer brièvement sur un vortex. Mélanger au préalable les billes magnétiques avec le tampon de fixation permet une distribution plus homogène des billes dans les différents puits de la plaque de séparation. Lors de l’automatisation, il est recommandé de procéder à une étape de prémélange avant d’aspirer le mélange billes / tampon de fixation du réservoir afin de maintenir les billes remises en suspension. Durée de séparation magnétique L’attraction des billes magnétiques sur les aimants dépend de la force magnétique des aimants, de la plaque de séparation choisie, de la distance entre la plaque de séparation et les aimants et du volume à traiter. Les temps d’aimantation des billes doivent être vérifiés et ajustés pour chaque système. Il est recommandé d’utiliser les plaques ou tubes de séparation spécifiés par le fournisseur du séparateur magnétique. Lavage des billes Le lavage des billes peut être réalisé par agitation ou par pipetage. Contrairement au mélange par pipetages successifs, le mélange par agitation permet de mélanger simultanément tous les échantillons. Cela permet de réduire le temps et le nombre de cônes nécessaires à la préparation. La remise en suspension par pipetages successifs est cependant plus efficace que l’agitation de la plaque ou l’agitation magnétique. Efficacité de la remise en suspension Vitesse Nombre de cônes nécessaires Mélange magnétique + ++ Faible Agitateur ++ ++ Faible Pipetage +++ +* Haut Méthode + : acceptable, ++ : bon, +++ : excellent, *pipette 8-canaux MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 11 ARN à partir de sang 2.7 Procédures d’élution L’ARN purifié peut être élué directement avec le H2O RNase-free fourni. L’élution peut être effectuée dans un volume de ≥ 50 μL jusqu’à 100 µL. Il est essentiel de recouvrir complètement les NucleoMag® B-Beads avec du H2O RNase-free pendant l’étape d’élution. Le volume de RNase-free H2O utilisé dépend du système de séparation magnétique (p.e., la position du culot à l’intérieur de la plaque de séparation). Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être entièrement remis en suspension dans l’H2O RNase-free. 2.8 Assistance à l’automatisation Les kits d’extraction MN sont conçus pour une automatisation rationalisée, offrant une compatibilité avec une gamme de systèmes robotiques ouverts. Que vous utilisiez des systèmes à barreaux magnétiques ou des manipulateurs de liquides comme Hamilton, Tecan, Eppendorf ou d’autres plateformes, nos kits garantissent des procédures d’extraction efficaces et fiables. Contactez-nous pour obtenir une assistance complète et des solutions d’automatisation sur mesure, afin de rendre votre expérience d’extraction se déroule sans problème. Des questions pour l’assistance à la programme ou au service d’automatisation de MACHEREY‑NAGEL ? Veuillez nous contacter pour une assistance personnalisée : Téléphone : +49 2421 969 333 Courriel : support@mn-net.com Pour plus d’informations, visitez notre site web : www.mn-net.com/automation 12 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 ARN à partir de sang 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention: : Le tampon MRB2 contient du sel chaotropique ! Porter des gants et des lunettes ! • Vérifier que tous les composants ne sont pas endommagés après avoir reçu le kit. Si le contenu du kit, comme les bouteilles de tampon, est endommagé, contactez l’assistance technique et le service clientèle de MACHEREY‑NAGEL ou votre distributeur local. • N’utiliser pas les composants du kit endommagés. • La rDNase lyophilisée est expédiée à température ambiante dans le kit. Conserver la rDNAse lyophilisée (RNase-free) à 4 °C dès son arrivée (stable jusqu’à : voir l’étiquette du kit). • Tous les autres composants du kit doivent être conservés à une température comprise entre 15 et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le stockage à des températures inférieures peut entraîner la précipitation de sels. • Après la première utilisation, conserver la protéinase K liquide à 4 °C ou -20 °C. • Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi. • Avant de débuter le protocole NucleoMag® RNA Blood,préparer les éléments suivants : Éthanol à 80 % (pour les étapes de lavage) • Solution de travail de la rDNase : Ajouter 800 μL d’H2O RNase-free à chaque flacon de rDNase et incuber pendant 1 min à température ambiante. Agiter doucement les flacons pour dissoudre complètement la rDNase. Veiller à ne pas mélanger vigoureusement la rDNase car elle est sensible à l’agitation mécanique. Si elle n’est pas complètement utilisée, cette solution de travail peut être conservée à -20 °C pendant au moins 6 mois. Ne pas congeler/décongeler la solution de travail de la rDNase plus de trois fois. • Mélange réactionnel pour la rDNase : Ajouter 9,2 mL de tampon de réaction pour la rDNase à 800 μL de solution de travail pour la rDNase et mélanger. Le mélange réactionnel pour la rDNase résultante sera suffisant pour 32 extractions et devrait être utilisé dans sa totalité. Si vous effectuez moins de 32 réactions, préparer une plus petite quantité du mélange réactionnel. Pour chaque extraction, combiner 276 μL de tampon de réaction pour la rDNase avec 24 μL de solution de travail pour la rDNase. NucleoMag® RNA Blood REF rDNase (lyophilized) 1 × 96 preps 744352.1 4 × 96 preps 744352.4 3 flacons (taille D) Ajouter 800 μL de H2O RNase-free à chaque flacon. 12 flacons (taille D) Ajouter 800 μL de H2O RNase-free à chaque flacon. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 13 NucleoMag® RNA Blood 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® RNA Blood, portez des vêtements de protection appropries (p.e., blouse de laboratoire, gants jetables et lunettes de protection). Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées (les FDS sont disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds). Ce manuel fournit des instructions détaillées spécifiques à l’utilisation du kit NucleoMag® RNA Blood. Pour les consignes de sécurité relatives aux tubes collecteurs de sang utilisés, veuillez-vous référer au manuel d’utilisation correspondant. En outre, consultez les fiches de données de sécurité fournies pour prendre connaissance de tous les produits chimiques contenus dans ces tubes. Les instructions générales de sécurité et de manipulation se trouvent dans le manuel d’utilisation correspondant au tube collecteur de sang. Attention : Les échantillons biologiques sont susceptibles de transmettre des maladies infectieuses. Les déchets générés par le kit NucleoMag® RNA Blood n’ont pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison des conditions de lyse rigoureuses, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales. 4.1 Elimination des déchets Elimination des matériaux dangereux, infectieux ou biologiquement contaminés de manière sûre et conforme aux dispositions règlementaires locales. 14 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 NucleoMag® RNA Blood 5 Extraction d’ARN à partir de sang prélevé dans des tubes collecteurs S-Monovette® RNA Exact de SARSTEDT ou DNA/RNA Shield™Blood de Zymo Research. • Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les paragraphes 1.2 et 2.3, respectivement. • Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 17. Avant de débuter la procédure : • 1 Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. Lyse de l’échantillon 820 µL de tubes collecteurs S-Monovette® RNA Exact ou DNA/RNA Shield™ Blood. 15 μL de protéinase K liquide Mélanger par pipetages successifs ou par agitation. Incuber pendant 15 min à température ambiante 2 Fixation de l’ARN aux NucleoMag® B-Beads 15 μL NucleoMag® B-Beads 140 μL MRB1 Mélanger en agitant pendant 5 min à TA. (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 3 Lavage avec le tampon MRB2 Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 900 μL MRB2 Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 15 NucleoMag® RNA Blood Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 4 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 900 μL Éthanol à 80 Resuspend: Shake 5 min at RT (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. Sécher pendant 5 min à TA 5 Digestion de l’ADN Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 300 μL de mélange réactionnel rDNase Mélanger Incuber 15 min à TA 6 Re-fixation 250 μL MRB1 Mélanger en agitant pendant 5 min à TA. (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 16 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 NucleoMag® RNA Blood 7 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 900 μL Éthanol à 80 Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 8 Séchage de l’échantillon Laisser le Square-well Blocks sur le NucleoMag® SEP Sécher à l’air 10 – 15 min à TA 9 Elution de l’ARN Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 50 – 100 μL H₂O RNase-free Agiter 5 – 10 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Séparer 2 min et transférer l’ARN dans une plaque d’élution / tubes. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 17 NucleoMag® RNA Blood Protocole détaillé Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple, NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.3). Il est recommandé d’utiliser un Square-well Blocks pour la séparation (voir paragraphe 1.2). L’extraction de l’ARN peut également être réalisée dans des tubes de réaction avec des séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de ligne directrice pour l’adaptation du kit aux instruments robotisés. Pour plus d’informations sur l’automatisation, veuillez-vous référer au chapitre 2.8. Avant de débuter la procédure : • 1 Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. Lyse de l’échantillon Prélever à la pipette 820 µL de sang dans un tube collecteur S-Monovette® RNA Exact de SARSTEDT ou DNA/RNA Shield™ Blood de Zymo Research et ajouter 15 µL de protéinase K liquide. Mélanger par pipetages successifs 6 fois ou par agitation. Incuber 15 min à température ambiante 2 Fixation de l’ARN aux NucleoMag® B-Beads Ajouter 15 μL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 140 μL de tampon MRB2 à l’échantillon lysé. Mélanger en agitant pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois, et incuber pendant 5 min à température ambiante. Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les prélevés du flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une suspension homogène se forme. Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Éliminer complètement le surnageant. Note: Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’aspiration du surnageant. Le culot de billes n’est pas visible lors de cette étape. Prélever le surnageant de l’autre côté du puits. 18 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 NucleoMag® RNA Blood 3 Lavage avec le tampon MRB2 Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL de tampon MRB2 dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 4 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Maintenir le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape de séchage. 5 Digestion de l’ADN Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 300 μL de mélange réactionnel rDNase et remettre les billes en suspension par pipetages successifs. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Ne pas séparer les billes ! 6 Re-fixation Ajouter 250 μL de tampon MRB1 à chaque échantillon. Mélanger en agitant pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et incuber pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 19 NucleoMag® RNA Blood 7 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 8 Séchage de l’échantillon Sécher les billes à l’air pendant 10 à 15 min à température ambiante. Laisser le Square-well Blocks sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. 9 Elution de l’ARN Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter le volume défini de H2O RNase-free (50 – 100 μL) et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce qu’elles soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ARN purifié dans une plaque de collecte appropriée (voir les informations de commande, paragraphe 8.2). 20 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 NucleoMag® RNA Blood 6 Extraction d’ARN à partir de sang collecté dans des tubes Tempus™ Blood RNA • Du tampon de lyse DL (REF 740202.32, voir les informations de commande) et de l’eau RNase-free (p.e. REF 740378.10000) supplémentaires sont nécessaires et ne sont pas inclus dans le kit NucleoMag® RNA Blood. • Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les paragraphes 1.2 et 1.3. • Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 24. Avant de débuter la procédure : • 1 Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. Verser tout le contenu du tube Tempus™ Blood RNA dans un tube conique de 50 mL. Dilution de l’échantillon Ajouter 3 mL de PBS dans le tube, fermer le couvercle. Mélanger pendant 30 secondes en vortexant vigoureusement. 2 Concentration de l’ARN Centrifuger pendant 30 min à 3000 à 4400 × g à 4 °C Eliminer doucement le surnageant Laisser le tube renversé sur un papier absorbant pendant 1 min, éponger le liquide restant sur les bords du tube. Note: Manipuler chaque tube avec précaution pour éviter de perturber le culot d’ARN non purifié déposé au fond du tube. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 21 NucleoMag® RNA Blood 3 Redissoudre l’ARN Ajouter 620 µL de tampon DL Vortexer ou remettre en suspension l’ARN du fond du tube par pipetage. 4 Lyse de l’échantillon Prédispenser 200 µL d’eau RNase-free (non fournie dans le kit) 620 µL de culot d’ARN remis en suspension Mélanger par pipetages successifs ou par agitation. 15 μL de protéinase K liquide Mélanger par pipetages successifs ou par agitation. Incuber pendant 15 min à température ambiante 5 Fixation de l’ARN aux NucleoMag® Beads 15 μL NucleoMag® B-Beads 140 μL MRB1 Mélanger en agitant pendant 5 min à TA. (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 6 Lavage avec le tampon MRB2 Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 900 μL MRB2 Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) 22 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 NucleoMag® RNA Blood Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 7 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 900 μL Éthanol à 80 Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. Sécher pendant 5 min à TA 8 Digest DNA Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 300 μL de mélange réactionnel rDNase Mélanger Incuber 15 min à TA 9 Re-fixation 250 μL MRB1 Mélanger en agitant pendant 5 min à TA. (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 23 NucleoMag® RNA Blood 10 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanoll Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 900 μL Éthanol à 80 Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 11 Séchage de l’échantillon Laisser le Square-well Blocks sur le NucleoMag® SEP Sécher à l’air 10 – 15 min à TA 12 Elution de l’ARN Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 50 – 100 μL H2O RNase-free Agiter 5 – 10 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Séparer 2 min et transférer l’ARN dans une plaque d’élution / tubes. 24 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 NucleoMag® RNA Blood Protocole détaillé Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple, NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.3). Il est recommandé d’utiliser un Square-well Blocks pour la séparation (voir paragraphe 1.2). Alternativement, l’extraction de l’ARN peut être effectuée dans des tubes de réaction avec des séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de ligne directrice pour l’adaptation du kit aux instruments robotisés. Pour plus d’informations sur l’automatisation, veuillez-vous référer au chapitre 2.8. Avant de débuter la procédure : • 1 Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. Dilution des échantillons Verser la totalité du contenu - environ 9 mL - d’un tube Tempus™ Blood RNA dans un tube conique de 50 mL. Ajouter 3 mL de PBS au tube pour obtenir un volume total de 12 mL, fermer le couvercle. Mélanger pendant 30 secondes en vortexant vigoureusement. 2 Concentration de l’ARN Centrifuger pendant 30 min à 3000 à 4400 x g à 4 °C à l’aide d’un rotor oscillant afin de concentrer l’ARN au fond du tube. Eliminer le surnageant Note: Le culot d’ARN est invisible. Eliminer le surnageant très soigneusement afin de ne pas perdre le culot d’ARN. Éliminer les déchets conformément à la réglementation locale. Poser le tube à l’envers sur un papier absorbant et le laisser reposer pendant 1 min. Épongez le liquide restant sur le bord du tube en le tamponnant très soigneusement sur le papier. Redissoudre l’ARN Ajouter 620 µL de tampon DL au fond du tube Vortexer ou remettre en suspension l’ARN au fond du tube par pipetage. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 25 NucleoMag® RNA Blood 3 Lyse de l’échantillon Distribuer au préalable 200 µL d’eau RNase-free dans un nouveau tube de réaction (non fourni). Transférer le culot d’ARN de 620 µL remis en suspension dans le tampon DL dans le nouveau tube de réaction. Mélanger par pipetages successifs ou agiter avant d’ajouter la protéinase K liquide. Ajouter 15 μL de protéinase K liquide. Mélanger par pipetages successifs ou par agitation. Incuber pendant 15 min à température ambiante 4 Fixation de l’ARN aux NucleoMag® B-Beads Ajouter 15 μL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 140 μL de tampon MRB1 à l’échantillon lysé. Mélanger par agitation pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois, et incuber pendant 5 min à température ambiante. Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de prélever dans le flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une suspension homogène soit obtenue. Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Éliminer complètement le surnageant. Note: Ne pas perturber les billes attirées lors de l’aspiration du surnageant. Le culot de billes n’est pas visible lors de cette étape. Prélever le surnageant de l’autre côté du puits. 5 Lavage avec le tampon MRB2 Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL de tampon MRB2 dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 26 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 NucleoMag® RNA Blood 6 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Maintenir le Squarewell Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape de séchage. 7 Digestion de l’ADN Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 300 μL de mélange réactionnel rDNase et remettre les billes en suspension par pipetages successifs. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Ne pas séparer les billes ! 8 Re-fixation Ajouter 250 μL de tampon MRB1 à chaque échantillon. Mélanger par agitation pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et incuber pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 9 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 27 NucleoMag® RNA Blood 10 Séchage de l’échantillon Sécher les billes à l’air pendant 10 à 15 min à température ambiante. Laisser le Square-well Blocks sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. 11 Elution de l’ARN Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter le volume désiré de H2O RNase-free (50 – 100 μL) et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ARN purifié dans une plaque de collecte appropriée (voir les informations de commande, paragraphe 2.6). 28 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 NucleoMag® RNA Blood 7 Extraction d’ARN à partir de sang prélevé dans des tubes collecteurs EDTA / Citrate • Des tampons de lyse DL (REF 740202.32, voir les informations de commande) et de lavage RAW (REF 740361.150) supplémentaires sont nécessaires et ne sont pas inclus dans le kit NucleoMag® RNA Blood. • Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les paragraphes 1.2 et 1.3. • Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 24. Before starting the preparation: • 1 Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. Lyse de l’échantillon 260 µL de sang provenant de tubes collecteurs EDTA ou citrate 540 µL DL 15 μL de protéinase K liquide Mélanger par pipetages successifs ou par agitation Incuber pendant 15 min à température ambiante 2 Fixation de l’ARN aux NucleoMag® B-Beads 15 μL NucleoMag® B-Beads 160 μL MRB1 Mélanger en agitant pendant 5 min à TA. (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 29 ARN à partir de sang 3 Lavage avec le tampon Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 900 μL RAW Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 4 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 900 μL d’éthanol à 80 % Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. Sécher pendant 5 min à TA 5 Digestion de l’ADN Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 300 μL de mélange réactionnel rDNase Mélanger Incuber 15 min à TA 30 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 ARN à partir de sang 6 Re-fixation 250 μL MRB1 Mélanger en agitant pendant 5 min à TA. (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 7 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP 900 μL d’éthanol à 80 % Remettre en suspension : Agiter 5 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Retirer le surnageant après 2 min de séparation. 8 Séchage de l’échantillon Laisser le Square-well Blocks sur le NucleoMag® SEP Sécher à l’air 10 – 15 min à TA MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 31 ARN à partir de sang 9 Retirer le Square-well Blocks du NucleoMag® SEP Elution de l’ARN 50 – 100 μL H2O RNase-free Agiter 5 – 10 min à TA (Optionnel : mélanger par pipetages successifs) Séparer 2 min et transférer l’ARN dans une plaque d’élution / tubes. Protocole détaillé Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple, NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.3). Il est recommandé d’utiliser un Square-well Blocks pour la séparation (voir paragraphe 1.2). L’extraction de l’ARN peut également être réalisée dans des tubes de réaction avec des séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de ligne directrice pour l’adaptation du kit aux instruments robotisés. Pour plus d’informations sur l’automatisation, veuillez-vous référer au chapitre 2.8. Avant de débuter la procédure : • 1 Vérifier que la rDNase a été préparée conformément au chapitre 3. Lyse de l’échantillon Prélever à la pipette 260 µL de sang dans un tube collecteur EDTA ou citrate et ajouter 540 µL de tampon DL et 15 µL de protéinase K liquide. Mélanger par pipetages successifs 6 fois ou par agitation. Incuber 15 min à température ambiante 32 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 ARN à partir de sang 2 Fixation de l’ARN aux NucleoMag® B-Beads Ajouter 15 μL de NucleoMag® B-Beads remises en suspension et 160 μL de tampon MRB1 à l’échantillon lysé. Mélanger en agitant pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et incuber pendant 5 min à température ambiante. Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les prélevé du flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une suspension homogène soit obtenue. Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Éliminer complètement le surnageant. Note: Ne pas perturber les billes attirées lors de l’aspiration du surnageant. Le culot de billes n’est pas visible lors de cette étape. Prélever le surnageant de l’autre côté du puits. 3 Lavage avec le tampon RAW Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL de tampon RAW dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 4 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Sécher les billes pendant 5 min à température ambiante. Maintenir le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP pour l’étape de séchage. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 33 ARN à partir de sang 5 Digestion de l’ADN Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 300 μL de mélange réactionnel rDNase et remettre les billes en suspension par pipetages successifs. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Ne pas séparer les billes ! 6 Re-fixation Ajouter 250 μL de tampon MRB1 à chaque échantillon. Mélanger par agitation pendant 5 min à température ambiante ou par pipetages successifs 6 fois et incuber pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 7 Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber pendant 1 min. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. 8 Séchage de l’échantillon Sécher les billes à l’air pendant 10 à 15 min à température ambiante. Laisser le Square-well Blocks sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. 9 Elute RNA Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Ajouter le volume désiré d’H2O RNase-free (50 – 100 μL) et remettre les billes en suspension en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (5 min). Alternativement, remettre en suspension les billes par pipetages successifs (15 fois). Incuber la suspension pendant 5 min à température ambiante. Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ARN purifié dans une plaque de collecte appropriée (voir les informations de commande, paragraphe 8.2). 34 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 ARN à partir de sang 8 Annexes 8.1 Guide de résolution des problèmes Problème Causes possibles et suggestions Contamination par la RNase L’ARN est dégradé / aucun ARN n’est obtenu • Créer un environnement de travail RNase-free. Porter des gants pendant toutes les étapes de la procédure. Changer de gants fréquemment. Il est recommandé d’utiliser des tubes ou des plaques en polypropylène stériles et jetables. La verrerie doit être cuite au four pendant au moins 2 heures à 250 °C avant d’être utilisée. Volume de tampon d’élution insuffisant • Le culot des billes doit être entièrement recouvert de tampon d’élution. Performance insuffisante du tampon d’élution pendant l’étape d’élution. • Éliminer complètement les tampons résiduels lors des étapes de séparation. Les tampons résiduels diminuent l’efficacité des étapes de lavage et d’élution suivantes. Séchage excessif des billes • Faible rendement en ARN Ne pas laisser sécher les billes excessivement, car cela pourrait entraîner une baisse de l’efficacité de l’élution. Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant • Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de l’aspiration du surnageant, en particulier lorsque le culot de billes magnétiques n’est pas visible dans le lysat. Aspiration et perte de billes • Durée de séparation magnétique trop courte ou vitesse d’aspiration trop élevée. • Perte du culot d’ARN (Tempus™ Blood RNA Tube) • S’assurer que la force g et la durée de centrifugation sont suffisantes et que la température est ajustée à 4 °C. Faire très attention au surnageant. Laisser le tube inversé seulement pendant 1 min sur le papier absorbant. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 35 ARN à partir de sang Problème Causes possibles et suggestions Procédure de lavage insuffisante Pureté insuffisante • Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de séparateur et de plaque, par exemple Square-well Block en combinaison avec NucleoMag® SEP. • S’assurer que les billes sont remises en suspension complètement pendant la procédure de lavage. Si l’agitation n’est pas suffisante pour remettre les billes en suspension complètement, mélanger en effectuant des pipetages successifs. Elimination de l’éthanol des tampons de lavage Faible performance de l’ARN dans les applications en aval • Veillez à éliminer toute la solution de lavage éthanolique, car l’éthanol résiduel interfère avec les applications en aval. Pureté insuffisante • Voir ci-dessus. Durée de séparation magnétique trop courte • Perte des billes Augmenter la durée de séparation pour permettre aux billes d’être complètement attirées par les aimants avant d’aspirer tout le liquide du puits. Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution) • Une vitesse d’aspiration élevée pendant l’étape d’élution peut entraîner une perte des billes. Réduire la vitesse d’aspiration pour l’étape d’élution. Contaminations des parties supérieures des puits Contamination croisée 36 • Ne pas souiller les bords du Square-well Blocks lors du transfert du lysat tissulaire. Si le bord des puits est contaminé, sceller le Square-well Block avec une feuille PE auto-adhésive (voir les informations de commande, paragraphe 6.2) avant de mettre l’agitateur en marche. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 NucleoMag® RNA Blood 8.2 Informations de commande Produit REF Conditionnement NucleoMag RNA Blood 744352.1 744352.4 1 × 96 preps 4 × 96 preps Tampon de lyse DL 740202.32 100 mL Tampon de lavage RAW 740361.150 150 mL H2O RNase-free 740378.1000 1000 mL NucleoMag SEP 744900 1 Square-well Blocks 740481.4 740481.24 4 24 Pour l’utilisation du kit sur l’instrument KingFisher® Flex : 744951 1 set ® ® p.e., 96-well Acessory Kit B for KingFisher® (Square-well Blocks, Deep-well tip combs, Plaques d’élution pour 4 × 96 NucleoMag® RNA preps avec la plateforme KingFisher® Flex) Tip combs 8 positions pour systèmes à barreaux 744960 magnétiques (Pour l’utilisation du kit NucleoMag® RNA Blood sur l’instrument MagnetaPure 32 Plus ou l’instrument IsoPure™ Mini). 50 pièces 744955 25 pièces Plaques 96 puits profonds pour systèmes à barreaux magnétiques (Pour l’utilisation du kit NucleoMag® RNA Blood sur l’instrument MagnetaPure 32 Plus ou l’instrument IsoPure™ Mini). Pour toute commande ou demande de renseignements concernant le Magnetapure 32 Plus ou l’appareil IsoPure™ Mini, veuillez contacter le service technique MACHEREY‑NAGEL. Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 37 NucleoMag® RNA Blood 8.3 Restrictions d’utilisation du produit / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04 Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tel. : +49 24 21 969‑333 support@mn-net.com 38 MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 NucleoMag® RNA Blood Marques déposées : NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL. KingFisher® est une marque déposée de Thermo Scientific Inc. Tempus™ est une marque déposée d’Applied Biosystems par Thermo Fisher Scientific. DNA/RNA Shield™ est une marque déposée de Zymo Research Corporation. Monovette® est une marque déposée de SARSTEDT. IsoPure™ est une marque d’Accuris Instruments. Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur fonctionnement. MACHEREY-NAGEL – 04/2024, Rev. 02 39 A0xxxxx/113 www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 info@mn-net.com CH +41 62 388 55 00 sales-ch@mn-net.com FR +33 388 68 22 68 sales-fr@mn-net.com US +1 888 321 62 24 sales-us@mn-net.com ">
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