Macherey-Nagel NucleoSpin DNA FFPE XS, Micro kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
Moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d’utilisation
Purification d’ADN à partir d'échantillons FFPE
n NucleoSpin® DNA FFPE XS
Novembre 2023 / Rev. 05
www.mn-net.com
www.mn-net.com
Purification d’ADN des échantillons FFPE
Résumé du protocole (Rev. 05)
NucleoSpin® DNA FFPE XS
Préparer l’échantillon
1 Déparaffiner
l’échantillon
Protocole 5.1:
Protocole 5.2:
Purification d’ADN avec le Paraffin
Dissolver
Purification d’ADN avec le
xylène
Pour la quantité
d’échantillon appropriée,
voir la section 2.4.
Pour la quantité
d’échantillon appropriée,
voir la section 2.4.
400 μL de Paraffin
Dissolver
1 mL de xylène
60 °C, 3 min
Mélanger l’échantillon
chaud
TA, 2 min
Mélanger
11,000 x g, 2 min
Eliminer le surnageant
1 mL ~ 98 % d’éthanol
Laisser refroidir
l’échantillon
Mélanger
11,000 x g, 2 min
Eliminer le surnageant
Sécher à 60 °C,
3 –10 min
2 Lyser l’échantillon
100 μL FL
Mélanger vigoureusement
11,000 x g, 1 min
–
10 μL Protéinase K
10 μL Protéinase K
Mélanger la phase
infé-rieure
Mélanger
TA, 3 heures ou
pendant la nuit
3 Décrosslink
4 Ajuster conditions
de fixation
5 Fixer l’ADN
100 μL FL
TA, 3 heures ou
pendant la nuit
100 μL D-Link
100 μL D-Link
Mélanger doucement
Mélanger doucement
11,000 x g, 30 s
–
90 °C, 30 min
90 °C, 30 min
200 μL ~ 98 % d’éthanol
200 μL ~ 98 % d’éthanol
Mélanger
Mélanger
1,000 x g, 1 s
–
Charger la phase
aqueuse (inférieure)
Charger le lysat
2,000 x g, 30 s
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Tel.: +49 24 21 969-333 · support@mn-net.com · www.mn-net.com
2,000 x g, 30 s
Purification d’ADN des échantillons FFPE
Résumé du protocole (Rev. 05)
6 Laver et sécher
la membrane
de silice
7 Eluer l’ADN
8 Optionnel:
éliminer l’éthanol
résiduel
1ère
2nd
400 μL B5
400 μL B5
11,000 x g, 30 s
11,000 x g, 30 s
400 μL B5
400 μL B5
11,000 x g, 2 min
11,000 x g, 2 min
20 μL BE
20 μL BE
11,000 x g, 30 s
11,000 x g, 30 s
90 °C, 8 min
90 °C, 8 min
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Purification d’ADN des échantillons FFPE
Sommaire
1 Composition du kit
4
1.1 Composants
4
1.2 Réactifs, consommables, et équipement nécessaire
5
1.3 A propos de ce manuel
5
2 Description du kit
6
2.1 Principe général
6
2.2 Caractéristiques du kit
7
2.3 Manipulation, préparation et conditions de stockage des échantillons
8
2.4 Quantité de tissus FFPE
8
2.5 Procédures d’élution
9
2.6 Stabilité de l’ADN purifié
10
2.7 Elimination des traces résiduelles d’éthanol, pour une sensibilité maximale des
applications en aval.
10
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
12
4 Instructions de sécurité
13
4.1 Élimination des déchets
5 Protocoles
13
14
5.1 Purification de l’ADN des échantillons FFPE utilisant le tampon Paraffin Dissolver
14
5.2 Purification de l’ADN avec déparaffinage au Xylène
20
6 Annexes
24
6.1 Information sur la qualité et la quantité d’ADN
24
6.2 Guide de résolution des problèmes
25
6.3 Informations de commande
27
6.4 Restrictions d’utilisation / ​garantie
28
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
3
Purification d’ADN des échantillons FFPE
1
Composition du kit
1.1
Composants
NucleoSpin® DNA FFPE XS
10 preps
740980.10
50 preps
740980.50
250 preps
740980.250
Tampon de dissolution de la
paraffine « Paraffin Dissolver »
5 mL
25 mL
125 mL
Tampon de lyse FL
8 mL
8 mL
4 × 8 mL
Tampon de décrosslink
« D-Link »
8 mL
8 mL
30 mL
Tampon de lavage B5
(concentré)*
6 mL
12 mL
50 mL
Protéinase K (lyophilisée)*
6 mg
30 mg
75 mg
Tampon de protéinase PB
1.8 mL
1.8 mL
8 mL
Tampon d’élution BE**
13 mL
13 mL
13 mL
Colonnes NucleoSpin DNA
FFPE XS (bagues vertes plus
Tubes Collecteurs)
10
50
250
Tubes Collecteurs (2 mL)
20
100
500
Manuel d’utilisation
1
1
1
REF
®
* Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de stockage, voir le chapitre 3.
** Composition du tampon d’élution BE : 5 mM Tris/HCl, pH 8.5
4
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
Purification d’ADN des échantillons FFPE
1.2
Réactifs, consommables, et équipement nécessaire
Réactifs
•
Ethanol 96 – 100 % (de préférence non dénaturé) pour préparer le tampon de lavage B5 et
pour créer les conditions de fixation.
•
Optionnel pour le déparaffinage sans le Tampon Paraffin Dissolver : Xylène, d-Limonène,
mélanges d’hydrocarbures isoparaffiniques ou des réactifs similaires pour le
déparaffinage.
Consommables
•
Tubes à centrifuger 1.5 mL (pour la lyse des échantillons et l’élution de l’ADN)
•
Cônes jetables
Equipement
•
Pipettes manuelles
•
Centrifugeuse pour micro tubes
•
Vortex
•
Bloc chauffant (réglable à 60 °C et 90 °C)
•
Equipements de protection personnelle (ex. blouse, gants, lunettes de protection)
1.3
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs du kit NucleoSpin® DNA FFPE
XS de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce manuel d’utilisation. Les utilisateurs
expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du protocole est
conçu pour être utilisé comme un support permettant le suivi rapide des étapes du protocole
lors de la procédure de purification.
Toute la littérature technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante : www.mn-net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au manuel d’utilisation actuel par rapport aux révisions précédentes.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
5
Purification d’ADN des échantillons FFPE
2
Description du kit
Les échantillons de tissus fixés à la formaline et inclus en paraffine (dits ’FFPE’ : Formalin-fixed,
paraffin-embedded) sont préparés couramment à partir d’échantillons chirurgicaux humains
par fixation à la formaline suivie d’une inclusion dans la paraffine.
De fines coupes de ces échantillons FFPE sont utilisées en routine pour des analyses
d’histopathologie, et le reste de ces blocs de tissus inclus en paraffine est archivé. L’existence
de vastes collections de tissus FFPE représente une source précieuse pour des études
rétrospectives du profil d’expression des gènes et l’analyse des mutations. Cependant,
l’utilisation de l’ADN de ces échantillons est limitée en raison des modifications chimiques
entraînées par le formaldéhyde et la fragmentation de l’ADN pendant la préparation des
tissus (prélèvement, fixation, inclusion) et leur stockage (humidité, durée, température). Les
procédures standards d’extraction de l’ADN résultent souvent en un faible rendement en ADN
et de mauvaises performances dans les applications en aval (ex. PCR). Un système spécial de
purification prenant en compte les contraintes spécifiques des tissus FFPE est donc nécessaire
pour garantir le succès de l’analyse des acides nucléiques des échantillons
2.1
Principe général
Le kit NucleoSpin® DNA FFPE XS est une méthode pratique, fiable et rapide pour extraire
l’ADN à partir des tissus fixés à la formaline et inclus en paraffine (FFPE).
La procédure offre une alternative à l’utilisation du xylène, inflammable et malodorant, ou du
d-limonène communément utilisé pour le déparaffinage. En outre, la procédure permet d’éviter
les difficultés liées à l’élimination des solvants organiques à partir de culots de tissus souvent à
peine visibles. NucleoSpin® DNA FFPE XS utilise un tampon inodore breveté pout l’élimination
de la paraffine (Paraffin Dissolver) et permet une lyse efficace en deux phases.
Tout d’abord, les coupes de tissue FFPE sont dissoutes dans le tampon Paraffin Dissolver. Les
tissus sont ensuite digérés par la protéinase K pour solubiliser les tissus fixés et libérer l’ADN
en solution.
Ensuite, une incubation à chaud avec un tampon spécialement conçu permet d’éliminer
efficacement les liaisons covalentes (crosslink) de l’ADN précédemment libéré en solution.
Après ajout d’éthanol, le lysat est déposé sur la colonne NucleoSpin® DNA FFPE XS. L’ADN
est fixé à la membrane de silice. Deux étapes de lavage permettent l’élimination des sels, des
métabolites et des composants cellulaires macromoléculaires.
L’ADN purifié est finalement élué dans des conditions de faible force ionique dans un petit volume
(20 μl) de tampon d’élution BE, aboutissant à l’obtention d’un ADN hautement concentré.
La purification de l’ADN avec les kits NucleoSpin® DNA FFPE XS peut être menée à
température ambiante.
L’éluat, cependant, doit être traité précautionneusement, car le tampon d’élution ne contient
pas d’inhibiteurs de DNases tel que l’EDTA. Pour garantir la stabilité de l’ADN, conserver l’ADN
congelé à -20 °C.
6
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
Purification d’ADN des échantillons FFPE
2.2
Caractéristiques du kit
•
Le kit NucleoSpin® DNA FFPE XS est recommandé pour l’extraction de l’ADN à partir
de tissus fixés à la formaline (formaldéhyde) et inclus en paraffine (dits tissus ’FFPE’). Les
échantillons sont généralement de fines sections (environ 3 – 20 μm d’épaisseur) d’origine
humaine ou animale, obtenue généralement par résection ou biopsie.
•
Quantité d’échantillon : la quantité maximale d’échantillon utilisable est déterminée
par : a) la quantité de tissus et b) la quantité de paraffine. NucleoSpin® DNA FFPE XS
est utilisable jusqu’à 5 mg de tissus. La quantité de paraffine est limitée à 15 mg avec
le protocole standard utilisant le tampon Paraffin Dissolver (ex. 7 sections de 10 μm x
250 mm²). Cependant, de plus grandes quantités d’échantillons paraffinés peuvent être
procédées en utilisant, soit un volume supérieur de tampon Paraffin Dissolver ou en
déparaffinant en utilisant le xylène (voir aussi le paragraphe 2.4)
•
Rendement en ADN : il est très dépendant du type, de la qualité, de la quantité
d’échantillon ainsi que de sa durée de stockage. En outre, le rendement en ADN
mesuré peut varier considérablement entre les différentes méthodes de quantification.
Le rendement déterminé par mesure de l’absorption à 260 nm ou par fluorescence
(ex. PicoGreen®) peut varier des résultats de quantification obtenus par PCR. Même
les valeurs de quantification obtenues par PCR d’un amplicon court (ex. 80 pb) par
rapport à un long (ex. 300 pb) peuvent varier considérablement. La déviation de la
quantification dépend également de la distribution de taille des fragments d’ADN, ainsi
que de l’efficacité de la déréticulation (ou de la persistance de réticulation). Merci de voir
également le paragraphe 6.1 pour d’autres informations concernant la détermination de la
quantité et de la qualité de l’ADN extrait.
•
Le design innovant de la colonne, avec une bague en forme d’entonnoir et une petite
membrane de silice permet l’élution de l’ADN dans un volume réduit de 5 – 30 μL. Ainsi,
l’ADN élué est hautement concentré et prêt à l’emploi pour les applications en aval (ex.
PCR).
•
Distribution de taille des fragments d’ADN : l’ADN isolé à partir des tissus fixés à la
formaline et inclus en paraffine présente une large distribution de taille de fragments,
allant de 50 à 5 000 bases. Souvent les fragments d’ADN de faible taille, c’est-à-dire de
100 – 300 bases prédominent, particulièrement quand l’échantillon de départ est ancien.
Cependant, les échantillons qui ont subi une procédure appropriée de fixation, d’inclusion
et de stockage peuvent permettre l’obtention de fragments ADN de taille supérieure à
5000 bases.
•
Temps de préparation de l’ADN : il dépend fortement de l’échantillon et de la durée de
lyse nécessaire. Les meilleurs résultats de lyses sont obtenus en incubant à température
ambiante pendant au moins 3 heures. Pour certains types d’échantillons, une lyse
plus longue (par exemple toute une nuit) permettra d’obtenir un rendement d’ADN
significativement supérieur.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
7
Purification d’ADN des échantillons FFPE
Table 1: Résumé des caractéristiques du kit
Paramètre
NucleoSpin® DNA FFPE XS
Echantillon*
Jusqu’à 7 sections, de 10 μm, d’une surface de 250 mm²
Rendement moyen
Fortement dépendant de la qualité et de la quantité
d’échantillon
Volume d’élution
5 – 30 μL
Volume de charge maximal de
la colonne
600 μL
Format
Mini column – Design XS
Utilisation
Pour la recherche uniquement
2.3
Manipulation, préparation et conditions de stockage des
échantillons
De nombreux facteurs influencent le rendement et la possibilité d’utiliser l’ADN obtenu à partir
de tissus FFPE. La procédure d’échantillonnage des tissus, le délai post-prélèvement et avant
fixation, la durée de fixation, l’inclusion et les conditions de stockage ont un fort impact sur la
qualité et le rendement de l’ADN.
A partir d’un bloc de tissus inclus en paraffine, les échantillons doivent être sectionnés
proprement. Les coupes de paraffine peuvent être stockées à +4 °C ou à des températures
plus basses pendant au moins plusieurs semaines sans effets observables sur le rendement de
l’ADN ou la possibilité d’utilisation. Le stockage à long terme des coupes de paraffine peut avoir
un effet négatif sur l’ADN en raison de l’oxydation de l’air.
Porter des gants en permanence pendant la préparation. Changer fréquemment de gants.
2.4
Quantité de tissus FFPE
Le protocole standard (paragraphe 5.1) permet la préparation de l’ADN à partir d’environ 15 mg
(c’est à dire 17 μL) de paraffine. Ceci correspond à :
~ 17 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 100 mm²
~ 7 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 250 mm²
~ 5 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 325 mm²
~ 4 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 400 mm²
~ 3 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 575 mm²
~ 2 sections de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 840 mm²
~ 1 section de 10 μm d’épaisseurs et une surface de 1680 mm²
* Avec l’utilisation de la procédure standard impliquant le tampon Paraffin Dissolver, il est possible d’utiliser de plus
grandes quantités d’échantillon en modifiant le protocole, voir le paragraphe 2.4.
8
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
Purification d’ADN des échantillons FFPE
De plus grandes quantités de paraffine peuvent être dissoutes en utilisant dès le départ un
volume de tampon Paraffin Dissolver (REF 740968.25) supérieur (30 μl de tampon Paraffin
Dissolver par mg de paraffine), ou en utilisant le xylène pour le déparaffinage comme décrit
dans le paragraphe 5.2.
En cas d’utilisation de plus de 400 μl de tampon Paraffin Dissolver par préparation, il est
nécessaire d’utiliser un tube de plus de 1,5 mL pour permettre l’élimination de la phase
inférieure, aqueuse, après l’étape de déréticulation sans débordement.
Note : La procédure standard NucleoSpin® DNA FFPE XS est recommandée pour les
échantillons contenant jusqu’à 15 mg de paraffine (pour assurer une dissolution efficace de
la paraffine avec le volume indiqué de Paraffin Dissolver) et jusqu’à 5 mg de tissu (pour éviter
une surcharge de la membrane).
•
Trois sections de 20 mm x 25 mm de surface et de 10 μm d’épaisseur peuvent contenir
jusqu’à 15 mg de paraffine (en particulier, si seules des parties mineures de la section
contiennent du tissu).
•
Une section de 20 mm x 25 mm de surface et de 10 μm d’épaisseur contient environ
5 mg de tissu, si la section contient du tissu à l’échelle de la zone.
2.5
Procédures d’élution
Une concentration elevée en ADN dans la fraction d’élution est souhaitable pour toutes les
applications courantes. Etant donnée les volumes limités de mix réactionnel, une concentration
élevée de la matrice peut être un critère crucial. En raison d’un volume d’élution par défaut
important, les kits standard produisent souvent un ADN faiblement concentré lorsque de
petits échantillons sont traités. De tels échantillons d’ADN peuvent nécessiter une étape de
concentration supplémentaire pour convenir à l’application prévue.
Les kits NucleoSpin® DNA FFPE XS permettent une élution efficace dans de très faibles volumes
d’élution, permettant d’obtenir une concentration en ADN élevée. Les volumes d’élution
compris entre 5 – 30 μL sont recommandés, le volume par défaut étant de 20 μL.
2.0
0.4
1.5
0.3
1.0
0.2
0.1
Rendement [µg]
Concentration [µg/µL]
0.5
0.5
20 µL
10 µL
5 µL
Diminution du volume d’élution
Figure 1
Corrélation entre le volume d’élution et la concentration d’ADN
(Colonnes NucleoSpin® DNA FFPE XS)
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
9
Purification d’ADN des échantillons FFPE
2.6
Stabilité de l’ADN purifié
Le tampon d’élution ne contient pas d’inhibiteurs de DNases (ex. EDTA) capables de complexer
divers cations divalents. Aussi, veiller à ne pas contaminer ce tampon avec des DNases !
Pour un stockage à court terme, la solution d’ADN peut être conservée à 0 – 4 °C et pour le long
terme, une température de -20 °C est recommandée.
2.7
Elimination des traces résiduelles d’éthanol, pour une
sensibilité maximale des applications en aval.
Le volume d’élution par défaut de NucleoSpin® DNA FFPE XS est de 20 μL. Le kit autorise
des volumes d’élution encore plus faibles, jusqu’à 5 μL, pour augmenter la concentration
d’ADN (voir paragraphe 2.5). Sachez qu’une réduction du volume d’élution par défaut de 20 μL
augmentera également la concentration d’éthanol résiduel dans l’éluat.
Pour les volumes d’élution par défaut, une incubation à chaud est recommandée si la solution
d’ADN éluée représente plus de 20 % du volume final de PCR (incuber l’éluat avec le bouchon
ouvert pendant 8 min à 90 °C). Cette mesure de précaution permet d’éviter l’inhibition de
réactions sensibles en aval.
Dans ce contexte, veuillez tenir compte des remarques ci-dessous :
a)
une incubation de la fraction éluée à plus hautes températures augmentera le signal
PCR. Ceci est particulièrement important si la matrice représente plus de 20 % du
volume total de la réaction de PCR (ex. plus de 4 μl d’éluat utilisés comme matrice
dans un volume de PCR total de 20 μl). La matrice peut représenter jusqu’à 40 %* du
volume total de la réaction de PCR, si la solution d’ADN est incubée à 90 °C pendant
8 min, comme mentionné ci-dessus.
b) Typiquement, 20 μL d’éluat s’évaporent à 12 – 14 μL pendant l’incubation à chaud
pendant 8 min à 90 °C. Si des volumes finaux plus élevés sont nécessaires, veuillez
augmenter le volume du tampon d’élution (par exemple, de 20 μL à 30 μL).
c)
Une incubation de la solution éluée pendant 8 min à 90 °C dénature l’ADN. Si, pour
certaines applications autres que la PCR (telles le clonage, la ligation) l’ADN est souhaité
non dénaturé, nous recommandons d’incuber la solution d’ADN à une température
inférieure à 80 °C pendant une durée supérieure étant donné que la majorité des
fragments d’ADN a un point de fusion supérieur à 80 °C. Suggestion : incuber pendant
17 min à 75 °C.
d) L’incubation de l’ADN élué à des températures supérieures peut être ajustée selon
les données présentées dans la Figure 2. Les durées et températures d’incubation
présentées réduiront un volume d’élution de 20 μl à environ 12 – 14 μl et les traces
d’éthanol seront éliminées comme mentionné ci-dessus.
e)
Si le volume initial de tampon d’élution appliqué à la colonne est inférieur à 20 μL, le
temps d’incubation à chaud doit être réduit afin d’éviter un assèchement complet. Si le
volume d’élution est par exemple de 5 μL, une incubation à chaud de l’éluat pendant
2 min à 80 °C permet d’éliminer convenablement l’éthanol résiduel.
* Le pourcentage maximal représenté par le volume matrice dans la réaction de PCR peut varier en fonction de la
robustesse du système de PCR ; 40 % de volume de matrice ont été testés en utilisant le LightCycler® PCR (Roche)
avec le kit DyNAmo™ Capillary SYBR® Green qPCR Kit (Finnzymes).
10
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
Purification d’ADN des échantillons FFPE
Temps d’incubation [min]
25
sans agitation
700 rpm
1400 rpm
20
15
10
Incubation time [min]
5
0
65
70
75
80
85
90
95
Température d’incubation [°C]
Figure 2
Élimination de l’éthanol résiduel de la fraction d’élution par traitement à chaud.
Afin d’obtenir une sensibilité maximale à la PCR, il est recommandé d’incuber l’éluat à la chaleur.
L’incubation à chaud peut être effectuée à des températures de 70 à 90 °C dans un bloc chauffant,
avec ou sans agitation. Les conditions efficaces (température, durée et vitesse d’agitation) pour
l’élimination de l’éthanol peuvent être lues sur le diagramme ; un volume initial de 20 μL s’évaporera
à 12 – 14 μL au cours de l’incubation décrite.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
11
Purification d’ADN des échantillons FFPE
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention :
Le tampon FL1 contient des sels chaotropiques. Portez des gants et des lunettes de protection !
Tous les composants doivent être stockés à température ambiante (15 – 25 °C) et sont stables
jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le stockage à des températures inférieures peut entraîner la
précipitation de sels.
Vérifier la disponibilité de l’éthanol 96 – 100 % (de préférence non dénaturé) pour créer les
conditions de fixation du lysat pour préparer le Tampon de Lavage B5 (voir ci-dessous).
Avant de débuter le protocole, préparer :
La Protéinase K : ajouter le volume indiqué de tampon de protéinase PB (voir le tableau cidessous ou sur le flacon) pour dissoudre la Protéinase K. La solution de Protéinase K est stable
à - 20 °C pendant 6 mois.
•
Tampon de lavage B5 : ajouter le volume indiqué d’éthanol 96 – 100 % (voir le tableau
ci- dessous ou sur le flacon) au tampon B5 concentré. Conserver le tampon de lavage B5
à température ambiante (15 – 25 °C) pendant un an maximum.
NucleoSpin® DNA FFPE XS
10 preps
740980.10
50 preps
740980.50
250 preps
740980.250
Tampon de
lavage B5
(concentré)
6 mL
Ajouter 24 mL
d’éthanol 96 – 100 %
12 mL
Ajouter 48 mL
d’éthanol 96 – 100 %
50 mL
Ajouter 200 mL
d’éthanol 96 – 100 %
Protéinase K
(lyophilisée)
30 mg
75 mg
6 mg
Ajouter 260 μL de
Ajouter 1.35 mL
Ajouter 3.35 mL
tampon Protéinase PB tampon Protéinase PB tampon Protéinase PB
REF
12
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
Purification d’ADN des échantillons FFPE
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin®DNA FFPE XS, portez des vêtements de
protection appropriés (par exemple, une blouse de laboratoire, des gants jetables et des
lunettes de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité
appropriées (FDS disponibles en ligne à l’adresse suivante : http ://www.mn-net.com/msds).
Les déchets générés par le kit NucleoSpin®DNA FFPE XS n’ont pas été testés pour détecter
la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du
matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du fort pouvoir dénaturant du
tampon de lyse et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue.
Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être
manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Élimination des déchets
Éliminer les substances dangereuses, potetiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sûre et conforme aux dispositifs réglementaires locales.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
13
Purification d’ADN des échantillons FFPE
5
Protocoles
Le kits NucleoSpin® DNA FFPE XS est compatible avec deux méthodes différentes pour le
déparaffinage des échantillons. L’une utilise le tampon Paraffin Dissolver (fourni dans le kit) et
l’autre fait intervenir le xylène ou un solvant organique comparable (non fourni avec le kit). Les
deux méthodes ont la même efficacité et performance.
Déparaffinage avec le tampon Paraffin Dissolver :
Paragraphe 5.1
Déparaffinage avec le xylène : Paragraphe 5.2
5.1
Purification de l’ADN des échantillons FFPE utilisant le
tampon Paraffin Dissolver
Avant de débuter la purification :
•
Vérifier que la Protéinase K et le Tampon B5 ont été préparés selon le chapitre 3.
•
Vérifier la disponibilité d’éthanol 96 – 100 %.
•
Régler le(s) incubateur(s) à 60 °C (dissolution de la paraffine) et 90 °C (déréticulation).
Préparation de l’échantillon
Déposer la(es) coupe(s) de tissus FFPE dans un micro
tube.
Pour les quantités de tissus appropriées, voir le paragraphe
2.4
14
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
Purification d’ADN avec le Paraffin Dissolver
1
Déparaffinage de l’échantillon
Ajouter 400 μL de tampon Paraffin Dissolver à
l’échantillon.
Incuber 3 min à 60 °C (pour faire fonder la paraffine).
Mélanger au vortex immédiatement (à
vigoureusement pour dissoudre la paraffine.
60 °C)
et
Note : Dans l’idéal, utilisez un thermostat pour l’incubation !
Refroidir l’échantillon à température ambiante.
+ 400 μL
Paraffin
Dissolver
60 °C,
3 min
Mélanger au
vortex
l’échantillon chaud
Veiller à ce que la paraffine soit complètement fondue
pendant l’étape d’incubation à chaud et bien mélanger
après la dissolution pour dissoudre complètement la
paraffine.
Un mélange insuffisant de l’échantillon chauffé peut
entraîner la réapparition de particules de paraffine solides.
S’assurer que l’échantillon ne contient pas plus de 15 mg
de paraffine ou ajuster le volume du dissolvant de paraffine
(voir paragraphe 2.4).
Pour les échantillons comprenant plus de 15 mg de
paraffine, utiliser 30 μL de dissolvant de paraffine pour
1 mg de paraffine. Si plus de 400 μL de dissolvant de
paraffine sont nécessaires, placer l’échantillon dans un
tube de 2 mL (non fourni).
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
15
Purification d’ADN avec le Paraffin Dissolver
2
Lyse de l’échantillon
Ajouter 100 μL de tampon FL.
Mélanger au vortex vigoureusement.
+ 100 μL FL
Vortexer
Centrifuger à 11,000 x g pour 1 min
Deux phases se forment : une phase inférieure (aqueuse)
et une phase supérieure (organique). Le tissu de départ
est transféré dans la phase inférieure (aqueuse).
11,000 x g,
1 min
Optionnel : La phase organique supérieure peut être
retirée et jetée après centrifugation.
Pipeter 10 μL de solution de protéinase K directement
dans la phase inférieure (aqueuse).
Mélanger la phase aqueuse par pipetages successifs.
(Ne mélanger par pipetage que la phase inférieure,
aqueuse. Eviter de trop mélanger la phase inférieure à la
phase supérieure)
S’assurer que la protéinase K est bien mélangée au
tampon de lyse.
+ 10 μL
Protéinase K
Mélanger par
pipetages
successifs
(phase inférieure)
Si plusieurs échantillons sont traités, il est recommandé
de préparer un pré-mix de tampon FL / ​
protéinase K.
Ajouter 110 μL du pré-mix dans le tube, mélanger et
centrifuger pour séparer les phases et assurer le transfert
du tissu dans la phase aqueuse (inférieure). Mélanger la
phase aqueuse à la pipette plusieurs fois pour disperser
les tissus dans le tampon de lyse.
Incuber à température ambiante pendant 3 heures pour
lyser le tissu de l’échantillon.
Si des particules résiduelles de tissu non lysé sont visibles
après 3 heures, ajouter 10 μL supplémentaires de solution
de protéinase K et poursuivre la digestion pendant 3
heures supplémentaires ou toute la nuit.
Note : Le rendement de l’ADN amplifiable augmente
généralement avec un temps de lyse prolongé. Pendant
cette étape d’incubation, les protéines sont digérées et
l’ADN est libéré dans la solution.
Mélanger au vortex pendant 5 s.
Régler le bloc chauffant à 90 °C.
Etape de pause possible : à ce stade, la procédure peut
être temporairement interrompue. En cas de pause, il est
recommandé de conserver les échantillons à -20 °C.
16
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
TA,
3 heures
Vortexer 5 s
Purification d’ADN avec le Paraffin Dissolver
3
Décrosslink
Ajouter 100 μL de tampon de décrosslink D-Link dans
le tube et mélanger doucement au vortex pour mélanger
le tampon D-Link dans la phase aqueuse (inférieure)
Centrifuger à 11 000 x g pendant 30 s pour obtenir la
séparation de phases.
+ 100 μL
D-Link
Vortexer
11,000 x g,
30 s
Incuber à 90 °C pendant exactement 30 min.
Mélanger au vortex 5 s et laisser refroidir à température
ambiante (env. 2 min).
Si nécessaire, centrifuger brièvement pour éliminer les
gouttes du bouchon (environ 1 s à 1 000 x g).
90 °C,
30 min
Vortexer
Note : cette étape de déréticulation est nécessaire pour
éliminer les liaisons chimiques (causées par la formaline)
de l’ADN libéré en solution lors de l’étape de lyse
précédente. L’ADN non réticulé est généralement plus
performant dans les applications en aval.
4
Ajustement des conditions de fixation
Ajouter 200 μL d’éthanol (96 – 100 %) dans le tube et
mélanger au vortex (2 × 5 s).
Centrifuger brièvement pendant 1 s à 1 000 x g pour
obtenir la complète séparation des phases.
Note : Éviter de centrifuger à une force x g beaucoup plus
élevée, car l’acide nucléique pourrait précipiter.
+ 200 μL
d’éthanol
Vortexer
1,000 x g,
1s
L’éthanol se retrouve dans la phase aqueuse (inférieure)
uniquement.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
17
Purification d’ADN avec le Paraffin Dissolver
5
Fixation de l’ADN
Pour chaque échantillon, prendre une colonne
NucleoSpin® DNA FFPE XS (bague verte) placée dans
un Tube Collecteur (2 mL).
Charger la
phase aqueuse
(inférieure)
Pipeter toute la phase aqueuse (inférieure) dans la colonne
NucleoSpin® DNA FFPE XS.
Il est recommandé de pipeter un volume de 450 μL sur
la colonne, afin de s’assurer que la totalité de la phase
aqueuse (inférieure) est transférée (le volume de la phase
aqueuse est d’environ 410 μL). Un petit transfert de la
phase organique (supérieure) n’a pas d’effet négatif sur la
procédure de fixation.
Centrifuger pendant 30 s à 2,000 x g. Si la solution ne
passe pas complètement, centrifuger pendant 30 s à 11
000 x g jusqu’à ce que la totalité de la solution passe dans
la colonne.
2,000 x g,
30 s
La vitesse de centrifugation recommandée de 2,000 x g
est plus efficace qu’à 11,000 x g.
Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la
colonne dans un nouveau Tube Collecteur (2 mL).
6
Lavage et séchage de la membrane de silice
+ 400 μL B5
1er lavage
Déposer 400 μl de Tampon
NucleoSpin® DNA FFPE XS.
B5
sur
la
colonne
Centrifuger pour 30 s à 11,000 x g.
Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la
colonne dans un nouveau Tube Collecteur (2 mL).
11,000 x g,
30 s
2ième lavage
Déposer 400 μl de Tampon
NucleoSpin® DNA FFPE XS.
B5
sur
la
colonne
Centrifuger pour 2 min à 11,000 x g pour sécher la
membrane.
Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la
colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation
exempt de nucléase (1,5 mL, non fourni).
18
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
+ 400 μL B5
11,000 x g,
2 min
Purification d’ADN avec le Paraffin Dissolver
7
Elution de l’ADN
Déposer 20 μl de tampon BE directement au centre de la
membrane de silice de la colonne.
+ 20 μL BE
Le volume d’élution peut varier de 5 – 30 μl. Pour la
corrélation entre le volume d’élution, la concentration
d’ADN et le rendement, voir le paragraphe 2.4.
Centrifuger pendant 30 s à 11,000 x g.
8
11,000 x g,
30 s
Optionnel : Eliminer l’éthanol résiduel
Incuber la solution d’ADN éluée (20 μl) avec le bouchon
ouvert pendant 8 min à 90 °C.
90 °C,
8 min
Voir le paragraphe 2.7 pour des informations détaillées et
recommandations concernant l’élimination des résidus
d’éthanol.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
19
Purification d’ADN avec le xylène
5.2
Purification de l’ADN avec déparaffinage au Xylène
Avant de débuter la purification :
•
Vérifier que la Protéinase K et le Tampon B5 ont été préparés selon le chapitre 3.
•
Vérifier la disponibilité d’éthanol 96 – 100 %.
•
Vérifier que le xylène (ou un réactif similaire*) est disponible pour le déparaffinage.
•
Régler le(s) incubateur(s) à 60 °C (dissolution de la paraffine) et 90 °C (déréticulation).
Préparation de l’échantillon
Déposer la(es) coupe(s) de tissus FFPE dans un micro
tube.
Pour les quantités de tissus appropriées, voir le paragraphe
2.4
1
Déparaffiner l’échantillon
Ajouter à l’échantillon 1 mL de xylène (ou un réactif
similaire*)
Incuber à température ambiante jusqu’à ce que la
paraffine soit complètement dissoute (généralement
environ 2 min) et mélanger au vortex vigoureusement
(10 s).
S’assurer que la paraffine soit complètement dissoute.
Centrifuger pendant 2 min à 11,000 x g.
1 mL xylène
TA,
2 min
Vortexer
11,000 x g,
2 min
Eliminer le
surnageant
Eliminer le surnageant en pipettant. Ne pas prélever le
culot.
Ajouter 1 mL d’éthanol (96 – 100 %) sur le culot et
mélanger au vortex (5 s).
1 mL d’éthanol
Centrifuger pendant 2 min à 11,000 x g.
Vortexer
Eliminer le surnageant en pipettant. Ne pas prélever le
culot.
11,000 x g,
2 min
Eliminer le
surnageant
Incuber le tube ouvert à 60 °C pendant 3 – 10 min pour
sécher le culot.
Il est important d’évaporer tout résidu d’éthanol. L’éthanol
résiduel peut réduire le rendement d’ADN.
60 °C,
3 – 10 min
* Exemples d’alternatives au xylène : d-Limonène (par exemple, Roti®-Histol, Hemo-De) ou mélanges d’hydrocarbures
isoparafiniques (par exemple, Roticlear®, Micro-ClearTM, Neo-Clear®). (par exemple, Roticlear®, Micro-ClearTM,
Neo-Clear®).
20
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
Purification d’ADN avec le xylène
2
Lyse de l’échantillon
Ajouter 100 μL de tampon FL et 10 µL de Protéinase
K sur le culot. Mélanger au vortex vigoureusement (5 s).
Si plusieurs échantillons sont extraits, il est recommandé
de préparer un pré-mix Tampon FL / ​Protéinase K. Ajouter
110 μL du pré-mix au culot.
+ 100 μL FL
+ 10 μL
Protéinase K
Vortexer
Centrifuger brièvement (env. 1 min à 1,000 x g).
Les résidus solides des coupes collées aux parois
doivent être récupérés dans la solution en pipetant.
Homogénéiser les coupes dans le tampon en pipetant la
solution plusieurs fois.
Incuber à température ambiante pendant 3 heures pour
lyser les échantillons de tissus.
S’il persiste des résidus de tissus non lysés après 3 heures
d’incubation, ajouter 10 µL de solution de Protéinase K et
continuer la digestion pour 3 nouvelles heures ou toute
une nuit.
TA,
3 heures
Note : le rendement d’ADN amplifiable augmente avec
la durée de lyse. Pendant cette incubation, les protéines
sont digérées et l’ADN est libéré en solution.
Mélanger au vortex pendant 5 s.
Etape de pause possible : à ce stade, la procédure
peut être stoppée temporairement. Dans ce cas, nous
recommandons de stocker les échantillons à -20 °C.
Régler le bloc chauffant à 90 °C (pour l’étape suivante de
déréticulation).
3
Décrosslink
Ajouter 100 μL de Tampon Décrosslink D-Link au lysat
et mélanger au vortex vigoureusement (5 s).
+ 100 μL
D-Link
Vortexer
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
21
Purification d’ADN avec le xylène
Incuber à 90 °C pendant exactement 30 min.
Mélanger au vortex pendant 5 s, laisser refroidir à
température ambiante (environ 2 min).
90 °C,
30 min
Si nécessaire, centrifuger brièvement pour collecter les
gouttes du bouchon (environ 1 s à 1,000 x g)
Note : cette étape de déréticulation est nécessaire pour
éliminer les liaisons chimiques (modifications causées
par la formaline) de l’ADN qui est libéré en solution lors
de l’étape précédente de lyse. L’ADN non réticulé est
généralement plus performant dans les applications en
aval.
4
Ajustement des conditions de fixation
Ajouter 200 μL d’éthanol (96 – 100 %) au lysat et
mélanger au vortex (2 × 5 s).
Centrifuger brièvement pour collecter les gouttes du
bouchon (environ 1 s à 1,000 x g).
5
+ 200 μL
d’éthanol
Vortexer
Fixation des ADN
Pour chaque échantillon, prendre une colonne
NucleoSpin® DNA FFPE XS (bagues vertes) placée dans
un Tube Collecteur.
Charger
le lysat
Pipeter le lysat par aspiration-refoulement deux fois avant
de charger le lysat.
Charger le lysat sur la colonne.
Centrifuger pendant 30 s à 2,000 x g. Si la solution ne
s’écoule pas totalement, centrifuger pendant 30 s à
11,000 x g jusqu’à ce que la solution complète passe
dans la colonne.
2,000 x g,
30 s
La vitesse de centrifugation recommandée de 2,000 x g
est plus efficace qu’à 11,000 x g.
Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la
colonne dans un nouveau Tube Collecteur (2 mL)
6
Lavage et séchage de la membrane de silice
+ 400 μL B5
1er lavage
Déposer 400 μl de Tampon B5 sur la colonne
NucleoSpin® DNA FFPE XS.
Centrifuger pour 30 s à 11,000 x g.
Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la
colonne dans un nouveau Tube Collecteur (2 mL).
22
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
11,000 x g,
30 s
Purification d’ADN avec le xylène
2ième lavage
Déposer 400 μl de Tampon B5 sur la colonne
NucleoSpin® DNA FFPE XS.
Centrifuger pour 2 min à 11,000 x g pour sécher la
membrane.
+ 400 μl B5
11,000 x g,
2 min
Eliminer le Tube Collecteur avec le filtrat et placer la
colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation
exempt de nucléase (1,5 mL, non fourni).
7
Elution de l’ADN
Déposer 20 μl de Tampon BE directement au centre de
la membrane de silice de la colonne.
+ 20 μL BE
Le volume d’élution peut varier de 5 – 30 μl. Pour la
corrélation entre le volume d’élution, la concentration
d’ADN et le rendement, voir le paragraphe 2.5.
Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g.
8
11,000 x g,
30 s
Optionnel : Eliminer l’éthanol résiduel
Incuber la solution d’ADN éluée (20 μl) avec le bouchon
ouvert pendant 8 min à 90 °C.
90 °C,
8 min
Voir le paragraphe 2.7 pour des informations détaillées et
recommandations concernant l’élimination des résidus
d’éthanol.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
23
Purification d’ADN des échantillons FFPE
6
Annexes
6.1
Information sur la qualité et la quantité d’ADN
En raison de la fixation des tissus, les acides nucléiques des échantillons FFPE sont couramment
fragmentés et modifiés par le formaldéhyde. Ces modifications ne peuvent pas être détectées
par des mesures standards de contrôle qualité, telles que les gels d’électrophorèse, la
spectrophotométrie, la fluorométrie ou les analyses microfluidiques. Cependant, l’efficacité des
réactions enzymatiques (ex. PCR) avec cet ADN modifié est significativement réduite.
Les méthodes d’analyse et les applications de cet ADN sont par exemple :
•
Spectrophotométrie (ex. mesures de l’absorption A₂₃₀, A₂₆₀, A₂₈₀)
•
Fluorométrie (ex. RiboGreen®)
•
Electrophorèse sur gel d’agarose denaturant
•
Analyses microfluidiques (ex Bioanalyzer Agilent 2100, Experion de BioRad)
•
PCR
•
Analyses de Puces à ADN (ex. microarray)
Les points suivants sont à considérer pour les méthodes listées précédemment, en particulier
lors de la comparaison de l’efficacité de différentes méthodes d’extraction et de déréticulation
de l’ADN ou des performances de l’ADN purifié dans les applications :
•
Un rendement d’ADN élevé déterminé par mesure de l’A₂₆₀ ou par fluorescence (ex.
PicoGreen®) n’aboutit pas systématiquement à une bonne performance de l’ADN dans la
PCR, l’ADN peut être hautement dégradé (ex. fragments de taille plus faible que la cible
de le PCR) ou insuffisamment déréticulé.
•
Un rendement faible ou nul d’ADN déterminé par mesure de l’A₂₆₀ aboutira
probablement à de faibles résultats en PCR, mais il est tout de même possible d’obtenir
de bons résultats. Il se peut qu’une petite quantité d’ADN suffisamment déréticulé
présente une bonne réactivité.
•
Un ADN de haut poids moléculaire ne garantit pas une bonne amplification en PCR
ou une bonne réactivité dans d’autres réactions enzymatiques. L’ADN, bien que de haut
poids moléculaire, peut être insuffisamment déréticulé.
•
Un ADN de faible poids moléculaire, par ex. très dégradé, avec des fragments en
deçà de 200 nucléotides uniquement, ne permettra certainement pas l’amplification
de fragments de taille supérieure. Mais de petites séquences cibles (ex. 80 – 150 bp)
peuvent être amplifiables, en particulier si l’ADN est bien déréticulé.
Ni le rendement d’ADN, ni le poids moléculaire, ni les ratios d’absorbance, ou la distribution de
taille de l’ADN ne peuvent prédire les performances des PCR en aval, particulièrement lors de la
comparaison de différents systèmes de purification et de déréticulation. L’indicateur majeur de
qualité de l’ADN extrait à partir d’un échantillon FFPE est sa performance dans les applications
souhaitées.
24
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
Purification d’ADN des échantillons FFPE
6.2
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possible et suggestions
L’ADN est
dégradé,
rendement
d’ADN nul.
Mauvaise qualité de l’échantillon
•
La qualité de l’échantillon a un impact important sur la quantité et la
qualité de l’ADN.
Mauvaise utilisation ou préparation des réactifs
•
Réactifs mal préparés. Ajouter le volume indiqué d’éthanol au tampon
B5 concentré et mélanger. Reconstituer et conserver la Protéinase K
selon les instructions données au paragraphe 3.
•
L’échantillon et les réactifs n’ont pas été bien homogénéisés.
Mélanger au vortex vigoureusement après l’ajout de chaque réactif.
•
Ajout d’éthanol omis après la lyse. La fixation de l’ADN à la membrane
de silice est effective uniquement en présence d’éthanol.
Stockage du kit
Mauvaise
qualité ou
mauvais
rendement en
ADN
•
Reconstituer et conserver la Protéinase K selon les instructions
données au paragraphe 3.
•
Conserver les composants du kit tel que mentionné dans le
paragraphe 3.
•
Garder les flacons de tampons bien fermés afin de prévenir toute
évaporation ou contamination.
Force ionique et pH influence la mesure de l’absorbance A₂₆₀ ainsi que le
ratio A₂₆₀ / ​A₂₈₀
•
Pour les mesures de l’absorbance, utiliser du Tris/HCl 5mM pH 8,5
comme diluant. Voir aussi :
- Manchester, K. L. 1995. Value of A₂₆₀/A₂₈₀ ratios for measurement of
purity of nucleic acids. Biotechniques 19, 208 – 209.
- Wilfinger, W. W., Mackey, K. and Chomczyski, P. 1997. Effect of pH
and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic
acid purity. Biotechniques 22, 474 – 481.
Durée de la digestion Protéinase K
•
En fonction de la nature de l’échantillon, la durée optimale de
digestion, comprise entre 3 et 16 heures doit être déterminée
empiriquement. S’il subsiste des résidus de tissus non lysés après
3 h, prolonger l’incubation jusqu’à 16 heures. Après les 3 premières
heures d’incubation, de la protéinase K supplémentaire peut être
ajoutée à l’échantillon.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
25
Purification d’ADN des échantillons FFPE
Problème
Colmatage
de la colonne
NucleoSpin®
DNA FFPE
XS / ​ mauvais
rendement
ou qualité de
l’ADN
Causes possible et suggestions
Echantillon de départ
•
Quantité d’échantillon utilisée trop élevée. La surcharge de la colonne
peut entraîner une chute du rendement d’ADN. Réduire la quantité
d’échantillon ou utiliser des volumes supérieurs de tampon Paraffin
Dissolver et / ​ou de tampon de lyse FL.
•
Digestion et/ou homogénéisation de l’échantillon de départ
insuffisante. Mener une incubation pendant une nuit, si le tissu n’est
pas totalement digéré après 3 heures.
Contamination par l’éthanol ou des sels
Performance
de l’ADN dans
les expériences
en aval
•
Ne pas laisser le filtrat entrer en contact avec l’extrémité inférieure
de la colonne après le second lavage au tampon B5. S’assurer
de centrifuger pendant la durée et la vitesse recommandées afin
d’éliminer totalement le tampon B5.
•
Vérifier que le tampon B5 a été remis à température ambiante avant
utilisation. Le lavage à plus faible température diminue l’efficacité de
l’élimination des sels par le tampon B5.
•
En fonction de la robustesse du système de PCR utilisé, la PCR peut
être inhibée si la quantité de solution d’ADN purifié utilisée est trop
importante. Utiliser comme matrice de PCR un volume de solution
d’ADN élué moindre.
Stocké les ADN purifiés convenablement
•
Pour une stabilité optimale, l’ADN élué doit toujours être conservé sur
la glace afin de prévenir sa dégradation par de possibles traces de
DNases.
Abrasion de la silice de la membrane
•
Divergence
entre la
quantification
par mesure
de A₂₆₀ et par
PCR
26
En raison du contenu en ADN généralement faible des petits
échantillons FFPE, résultant en un faible rendement total d’ADN
extrait, la quantification de l’ADN par mesure de l’absorbance A₂₆₀ est
souvent altérée en raison de la faible sensibilité de ce type de mesure.
Lorsque les mesures effectuées sont proches de la limite de détection
du spectrophotomètre, la mesure peut être influencée par de minimes
quantités d’abrasion de silice. Afin de se prémunir des mesures de
A₂₆₀ et donc de quantifications incorrectes des petites quantités
d’ADN, centrifuger les éluats pendant 30 s à 11 000 x g et prélever
un aliquote dénué de tout sédiment pour la mesure. Alternativement,
utiliser une méthode de quantification insensible à l’abrasion de la
silice (ex. Picrogreen®).
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
Purification d’ADN des échantillons FFPE
Problème
Causes possible et suggestions
Mesure hors de la plage de la limite de détection du photomètre
Ratio A₂₆₀/A₂₈₀
incohérent
6.3
•
Afin d’obtenir un ratio A₂₆₀ / ​A₂₈₀ significatif, il est nécessaire que les
valeurs initiales de A₂₆₀ et A₂₈₀ soient significativement au-delà de la
limite de détection du spectrophotomètre. Une valeur de A₂₆₀ proche
du bruit de fond du spectrophotomètre entraînera un ratio A₂₆₀ / ​A₂₈₀
incohérent.
Informations de commande
Produit
NucleoSpin® DNA FFPE XS
REF
Conditionnement
740980.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
®
740982.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
®
NucleoSpin totalRNA FFPE XS
740969.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
NucleoSpin® Tissue XS
740901.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250
Paraffin Dissolver
740968.25
25 mL
Paraffin Dissolver blue
740343.60
60 mL
Tubes Collecteurs (2 mL)
740600
1000
Tampon de Décrosslink D-Link
740979.30
30 mL
NucleoSpin totalRNA FFPE
Visitez notre site web www.mn‑net.com pour des informations plus détaillées.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
27
Purification d’ADN des échantillons FFPE
6.4
Restrictions d’utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour
obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la
documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
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LighCycler est une marque déposée d’un membre du groupe Roche
Micro-Clear est une marque déposée de Micron Environmental Industries
Neo-Clear est une marque déposée de Merck KGaA
NucleoSpin® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG
RiboGreen et PicoGreen est une marque déposée de Molecular Probes Inc.
Roticlear est une marque déposée de CARL ROTH GmbH & Co KG
Roti est une marque déposée de CARL ROTH GmbH & Co KG
SYBR est une marque déposée de Molecular Probes, Inc.
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux
marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
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MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 05
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