Flow Cell HiSeq 3000/4000
Préparez la Flow Cell modélisée HiSeq 3000/4000, puis les réactifs de génération d’amplifiats. Pour préparer les réactifs de génération d’amplifiats, décongelez la plaque des réactifs cBot et préparez le mélange réactif principal ExAmp.
À propos des réactifs
} Les réactifs ExAmp sont visqueux, en particulier EPX2 et EPX3. Aspirez et distribuez les réactifs lentement pour assurer la précision du pipetage.
}
Le réactif EPX3 ne bouge pas lorsqu’il est inversé en raison de sa viscosité.
}
N’agitez jamais les réactifs ExAmp et évitez de les recongeler après les avoir décongelés.
} Le mélange principal ExAmp peut être trouble, ce qui est normal. Si la solution se sépare en une partie trouble et une partie transparente, pipettez-la lentement pour la mélanger.
Préparer la Flow Cell
1 Sortez un nouvel emballage de Flow Cell de son lieu de stockage entre 2 et 8 °C.
2 Laissez l’emballage de la Flow Cell à température ambiante pendant au moins
30 minutes.
REMARQUE
Si l’emballage en papier aluminium est intact, la Flow Cell peut rester à température ambiante durant 12 heures. Vous pouvez remettre la Flow Cell emballée au stockage à
2 à 8 °C pour une utilisation ultérieure une seule fois. Évitez les modifications de température répétées de la Flow Cell.
3 Enfilez une nouvelle paire de gants sans talc.
4 Retirez l’emballage en aluminium en partant de l’extrémité, à l’aide de l’opercule angulaire. Utilisez la Flow Cell jusqu’à quatre heures après ouverture de l’emballage en aluminium.
Figure 8 Ouverture de l’emballage de la Flow Cell
5 Sortez l’emballage double coque de son emballage en aluminium.
Guide du système cBot
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Figure 9 Retrait de l’emballage en aluminium
6 Ouvrez l’emballage double coque et sortez la Flow Cell.
Figure 10 Retrait de la Flow Cell de l’emballage double coque
7 Nettoyez la Flow Cell avec un chiffon non pelucheux imbibé d’alcool. Séchez à l’aide d’un tissu non pelucheux.
8 Préservez à température ambiante.
Décongeler la plaque des réactifs cBot
1 Retirez la plaque des réactifs cBot du lieu de stockage à une température entre -25 et
-15 °C.
2 Placez la plaque des réactifs dans un bain dʼeau à température ambiante pendant
60 minutes.
Décongeler les réactifs EPX1, EPX2, EPX3 et RSB
1 Retirez les réactifs EPX1, EPX2, EPX3 et RSB du lieu de stockage où la température se situe entre -25 et -15 °C.
2 Décongelez à température ambiante pendant dix minutes.
3 Préservez sur la glace.
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Ressource nº 20004794
Document nº 15006165 v02 FRA
Préparer une nouvelle dilution de NaOH
1 Mélangez les volumes suivants dans un tube de microcentrifuge pour préparer 1 ml de
NaOH 0,1 N :
}
Eau de laboratoire (900 µl)
}
Stockez 1 N NaOH (100 µl)
2 Inversez pour mélanger.
Dénaturer des librairies et ajouter un contrôle PhiX facultatif
La concentration de chargement d’une librairie dépend de la librairie à séquencer. Les instructions suivantes s’appliquent aux librairies d’Illumina prises en charge et sousentendent une taille d’insert type pour le type de librairie associé. Assurez-vous de diluer à une concentration appropriée pour le type de librairie.
}
Une concentration de chargement d’ADN trop élevée entraîne une réduction du %PF.
}
Une trop faible concentration de chargement d’ADN entraîne une réduction du %PF ainsi qu’un pourcentage élevé de doublons qui affecte négativement la profondeur de couverture.
1 Diluez la librairie ou le groupement de librairies à la concentration appropriée.
Type de librairie
ADN sans PCR TruSeq
ADN Nano TruSeq
Nextera Rapid Capture Exome
ARN total à brins TruSeq
ARNm à brins TruSeq
Dilution
Diluez à 1 à 2 nM dans le RSB.
Diluez à 2 à 3 nM dans le RSB.
2 [Facultatif] Préparez des librairies non dénaturées en y ajoutant une substance de contrôle PhiX d’Illumina non dénaturée dans un rapport de 1 %.
Type de librairie
ADN sans PCR TruSeq
ADN Nano TruSeq
Nextera Rapid Capture Exome
ARN total à brins TruSeq
ARNm à brins TruSeq
Substance de contrôle
Ajoutez 5 µl de contrôle PhiX de 100 à 200 pM à 45 µl d’une librairie de 1 à 2 nM.
Ajoutez 5 µl de contrôle PhiX de 200 à 300 pM à 45 µl d’une librairie de 2 à 3 nM.
3 Étiquetez une barrette de huit tubes de 1 à 8.
4 Dénaturez la librairie dans la barrette de huit tubes comme suit : a Ajoutez 5 µl de librairie non dénaturée au fond de chaque puits.
b Ajoutez 5 µl de NaOH 0,1 N nouvellement dilué. Pipettez lentement pour mélanger.
c Incubez à température ambiante pendant 8 minutes.
d Ajoutez 5 µl de Tris-HCl 200 mM pH 8,0. Pipettez lentement pour mélanger.
5 Réservez sur la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à ajouter le mélange principal
ExAmp.
ATTENTION
Préparez et ajoutez le mélange principal ExAmp dans un délai de 30 minutes.
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Préparer la plaque des réactifs cBot
1 Inversez pour mélanger.
2 Agitez pour déloger les éventuelles bulles d’air piégées.
3 Tapotez la plaque des réactifs sur une surface dure pour recueillir les éventuelles gouttelettes de réactif. Vous pouvez également passer les tubes à la centrifugeuse à impulsions.
4 Préservez sur la glace.
Préparer la réaction ExAmp
Préparez le mélange réactif principal ExAmp juste avant son utilisation.
1 Inversez les réactifs EPX1 et EPX2 pour les mélanger.
2 Centrifugez brièvement les réactifs EPX1, EPX2 et EPX3.
3 Préparez le mélange principal ExAmp dans un tube de 1,5 ml comme suit.
a Ajoutez 210 µl du réactif EPX1.
b Ajoutez 30 µl du réactif EPX2. Pipettez lentement pour mélanger.
c Ajoutez 110 µl du réactif EPX3. Pipettez lentement pour mélanger. Assurez-vous que le fond du tube est exempt de bulles.
4 Ajoutez 35 µl du mélange principal au fond de chaque puits de la barrette de huit tubes. Pipettez lentement pour mélanger. Changez les extrémités entre les échantillons.
5 Bouchez les tubes et centrifugez-les brièvement.
6 Réservez sur la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à charger le cBot.
ATTENTION
Vous avez 15 minutes pour charger la barrette de huit tubes sur le cBot.
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Ressource nº 20004794
Document nº 15006165 v02 FRA
