Flow Cell HiSeq X
Préparez la Flow Cell modélisée HiSeq X, puis les réactifs de génération d’amplifiats. Pour préparer des réactifs de génération d’amplifiats, décongelez la plaque des réactifs cBot et préparez le mélange principal ExAmp.
Si vous utilisez la trousse 10-pack, préparez quatre Flow Cell et décongelez quatre plaques des réactifs cBot. Veillez à ce que quatre instruments cBot soient disponibles. Les réactifs ne peuvent pas être stockés après la préparation.
À propos des réactifs
}
Les réactifs ExAmp sont visqueux, en particulier EPX2 et EPX3. Aspirez et distribuez les réactifs lentement pour assurer la précision du pipetage.
} Le réactif EPX3 ne bouge pas lorsqu’il est inversé en raison de sa viscosité.
} N’agitez jamais les réactifs ExAmp et évitez de les recongeler après les avoir décongelés.
}
Le mélange principal ExAmp peut être trouble, ce qui est normal. Si la solution se sépare en une partie trouble et une partie transparente, pipettez-la lentement pour la mélanger.
Préparer la Flow Cell
1 Sortez un nouvel emballage de Flow Cell de son lieu de stockage entre 2 et 8 °C.
2 Laissez l’emballage de la Flow Cell à température ambiante pendant au moins
30 minutes.
REMARQUE
Si l’emballage en papier aluminium est intact, la Flow Cell peut rester à température ambiante durant 12 heures. Vous pouvez remettre la Flow Cell emballée au stockage à
2 à 8 °C pour une utilisation ultérieure une seule fois. Évitez les modifications de température répétées de la Flow Cell.
3 Enfilez une nouvelle paire de gants sans talc.
4 Retirez l’emballage en aluminium en partant de l’extrémité, à l’aide de l’opercule angulaire. Utilisez la Flow Cell jusqu’à quatre heures après ouverture de l’emballage en aluminium.
Figure 5 Ouverture de l’emballage de la Flow Cell
5 Sortez l’emballage double coque de son emballage en aluminium.
Guide du système cBot
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Figure 6 Retrait de l’emballage en aluminium
6 Ouvrez l’emballage double coque et sortez la Flow Cell.
Figure 7 Retrait de la Flow Cell de l’emballage double coque
7 Nettoyez la Flow Cell avec un chiffon non pelucheux imbibé d’alcool. Séchez à l’aide d’un tissu non pelucheux.
8 Préservez à température ambiante.
Décongeler la plaque des réactifs cBot
1 Retirez la plaque des réactifs cBot du lieu de stockage à une température entre -25 et
-15 °C.
2 Décongelez dans un bain d’eau à température ambiante (environ 60 minutes).
Décongeler les réactifs EPX1, EPX2, EPX3 et RSB
1 Retirez un tube de chacun des réactifs suivants de leur lieu de stockage où la température se situe entre -25 et -15 °C.
}
Trousse single-pack : EPX1, EPX2, EPX3 et RSB. Chaque tube contient suffisamment de réactifs pour une Flow Cell.
}
Trousse 10-pack : EPX1M, EPX2M, EPX3M et RSB. Chaque tube contient suffisamment de réactifs pour quatre Flow Cell.
2 Décongelez à température ambiante pendant dix minutes.
3 Préservez sur la glace.
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Ressource nº 20004794
Document nº 15006165 v02 FRA
Préparer une nouvelle dilution de NaOH
1 Mélangez les volumes suivants dans un tube de microcentrifuge pour préparer 1 ml de
NaOH 0,1 N :
}
Eau de laboratoire (900 µl)
}
Stockez 1 N NaOH (100 µl)
2 Inversez pour mélanger.
Dénaturer des librairies et ajouter un contrôle PhiX facultatif
La concentration de chargement d’une librairie dépend de la librairie à séquencer. Les instructions suivantes s’appliquent aux librairies d’ADN Nano TruSeq (350 bp) ou d’ADN sans PCR TruSeq (350 bp). Diluez à une concentration appropriée pour le type de librairie.
}
Une concentration de chargement d’ADN trop élevée entraîne une réduction du %PF.
}
Une trop faible concentration de chargement d’ADN entraîne une réduction du %PF ainsi qu’un pourcentage élevé de doublons qui affecte négativement la profondeur de couverture.
Répétez les instructions suivantes pour chaque Flow Cell à séquencer.
1 Diluez la librairie ou le groupement de librairies à la concentration appropriée :
}
Librairies d’ADN Nano TruSeq : diluez 2 à 3 nM dans le RSB.
} Librairies d’ADN sans PCR TruSeq : diluez en une solution de 1 à 2 nM dans le
RSB.
2 [Facultatif] Préparez des librairies non dénaturées en y ajoutant une substance de contrôle PhiX d’Illumina non dénaturée dans un rapport de 1 % :
}
Librairies d’ADN Nano TruSeq : ajoutez 0,5 µl de contrôle PhiX à 2 à 3 nM à 50 µl d’une librairie à 2 à 3 nM.
}
Librairies d’ADN sans PCR TruSeq : ajoutez 0,5 µl de contrôle PhiX à 1 à 2 nM à
50 µl d’une librairie à 1 à 2 nM.
3 Étiquetez les tubes d’une barrette de huit tubes de 1 à 8.
4 Dénaturez la librairie dans la barrette de huit tubes comme suit : a Ajoutez 5 µl de librairie non dénaturée au fond de chaque puits.
b Ajoutez 5 µl de NaOH 0,1 N nouvellement dilué. Pipettez lentement pour mélanger.
c Incubez à température ambiante pendant 8 minutes.
d Ajoutez 5 µl de Tris-HCl 200 mM pH 8,0. Pipettez lentement pour mélanger.
5 Réservez sur la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à ajouter le mélange principal
ExAmp.
ATTENTION
Préparez et ajoutez le mélange principal ExAmp dans un délai de 30 minutes.
Préparer la plaque des réactifs cBot
1 Inversez pour mélanger.
2 Agitez pour déloger les éventuelles bulles d’air piégées.
Guide du système cBot
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3 Tapotez la plaque des réactifs sur une surface dure pour recueillir les éventuelles gouttelettes de réactif. Vous pouvez également passer les tubes à la centrifugeuse à impulsions.
4 Préservez sur la glace.
Préparer la réaction ExAmp
Préparez le mélange principal de la réaction ExAmp immédiatement avant utilisation.
Suivez les instructions appropriées pour le nombre de Flow Cell que vous préparez.
Réaction ExAmp pour une Flow Cell (trousse Single-pack)
1 Inversez les réactifs EPX1 et EPX2 pour les mélanger.
2 Centrifugez brièvement les réactifs EPX1, EPX2 et EPX3.
3 Préparez le mélange principal ExAmp dans un tube de 1,5 ml comme suit.
a Ajoutez 210 µl du réactif EPX1.
b Ajoutez 30 µl du réactif EPX2. Pipettez lentement pour mélanger.
c Ajoutez 110 µl du réactif EPX3. Pipettez lentement pour mélanger. Assurez-vous que le fond du tube est exempt de bulles.
4 Ajoutez 35 µl du mélange principal au fond de chaque puits de la barrette de huit tubes. Pipettez lentement pour mélanger. Changez les extrémités entre les échantillons.
5 Centrifugez brièvement, puis réservez sur la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à charger le cBot.
ATTENTION
Vous avez 15 minutes pour charger la barrette de huit tubes sur le cBot.
Réaction ExAmp pour quatre Flow Cells (trousse 10-pack)
1 Inversez les réactifs EPX1M et EPX2M pour les mélanger.
2 Centrifugez brièvement les réactifs EPX1M, EPX2M et EPX3M.
3 Ajoutez les volumes suivants dans un tube de 1,5 ml dans l’ordre indiqué : a Ajoutez 756 µl du réactif EPX1M.
b Ajoutez 108 µl du réactif EPX2M. Pipettez lentement pour mélanger.
c Ajoutez 396 µl du réactif EPX3M. Pipettez lentement pour mélanger. Assurez-vous que le fond du tube est exempt de bulles.
4 Ajoutez 35 µl du mélange principal au fond de chaque puits des barrettes de huit tubes. Pipettez lentement pour mélanger. Changez les extrémités entre les
échantillons.
5 Centrifugez brièvement la barrette de huit tubes, puis réservez-la sur la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à charger le cBot.
ATTENTION
Chargez le mélange principal ExAmp et la solution de librairie sur le cBot dans un délai de 15 minutes.
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Ressource nº 20004794
Document nº 15006165 v02 FRA
