Trousse universelle MiSeqDx 1.0
3 Retournez les Billes de nettoyage PCR 10 fois. Mélangez vigoureusement à l’aide d’un agitateur vortex, puis retournez 10 fois de plus. Inspectez visuellement la solution pour vous assurer que les billes sont resuspendues.
4 Ajoutez 45 µl de Billes de nettoyage PCR dans chaque puits de la plaque CLP.
5 Transférez la totalité du produit PCR de la plaque AMP à la plaque CLP.
6 Scellez la plaque CLP et agitez-la sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 2 minutes.
7 Incubez à température ambiante sans secouer pendant 10 minutes.
8 Placez la plaque sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit
évacué.
9 Avec la plaque CLP sur le support magnétique, retirez soigneusement et jetez le surnageant.
10 Avec la plaque CLP sur le support magnétique, lavez les billes comme suit : a Ajoutez 200 µl d’éthanol à 80 % fraîchement préparé dans chaque puits d’échantillon.
b Placez la plaque sur le support magnétique pendant 30 secondes ou jusqu’à ce que le surnageant soit
éliminé.
c Retirez le surnageant et mettez-le au rebut.
11 Répétez le lavage comme décrit à l’étape précédente.
12 Utilisez une pipette multicanaux P20 réglée sur 20 µl pour retirer l’excès d’éthanol.
13 Retirez la plaque CLP du support magnétique et séchez à l’air libre pendant 10 minutes.
14 Ajoutez 30 µl de Tampon d’élution à chaque échantillon, puis mélangez brièvement.
15 Scellez la plaque CLP et agitez-la sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 2 minutes. Après l’avoir secouée, vérifiez si les échantillons ont été resuspendus. Dans le cas contraire, répétez cette étape.
16 Incubez à température ambiante pendant 2 minutes.
17 Placez la plaque CLP sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit évacué.
18 Préparez une nouvelle plaque MIDI (ci-après désignée comme la plaque LNP).
19 Transférez 20 µl de surnageant de la plaque CLP à la plaque LNP.
20 [Facultatif] Transférez les 10 µl restants du surnageant de la plaque CLP à la nouvelle plaque et étiquetez la plaque avec un nom et une date d’analyse. Conservez cette plaque entre -25 °C et -15 °C jusqu’à la fin de l’analyse de séquençage et de l’analyse de données. Les produits PCR nettoyés peuvent être utilisés pour des efforts de dépannage en cas de pannes d’échantillon.
POINT D’ARRÊT DE SÉCURITÉ
Si vous arrêtez à ce point, scellez la plaque LNP et centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute. La plaque est stable pendant une durée maximale de 3 heures entre 2 °C et 8 °C.
Normalisation de librairie
Préparation
1 Préparez une nouvelle solution 0,1 N NaOH.
2 Ramenez le Diluant de normalisation de librairie, les Billes de librairie et le Lavage de normalisation de librairie à température ambiante.
3 Mélangez le Diluant de normalisation de librairie vigoureusement et assurez-vous que tous les précipités ont
été dissous.
4 Mélangez les Billes de librairie vigoureusement pendant une minute avec inversion intermittente jusqu’à ce que les billes soient remises en suspension et qu’aucun culot ne se trouve au fond du tube lorsque celui-ci est retourné.
Procédure
1 Mélangez le Diluant de normalisation de librairie et les Billes de librairie dans un tube conique de 15 ml tout juste rempli comme suit :
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Référence 15039608, rév. B FRA
Février 2015
