Macherey-Nagel NucleoMag DNA Food kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
Manuel
d’utilisation
User manual
ADN des aliments
n NucleoMag® DNA Food
Septembre 2024 / Rev. 05
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ADN des aliments
Sommaire
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
4
1.3 A propos de ce manuel
5
1.4 Aide à l’automatisation
5
2 Description du produit
6
2.1 Principe général
6
2.2 Caractéristiques du kit
6
2.3 Systèmes de séparation magnétique
7
2.4 Réglage des paramètres d’agitation
8
2.5 Manipulation des billes
8
2.6 Procédures d’élution
9
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
10
4 Safety instructions
10
4.1 Elimination des déchets
5 Remarques générales
10
11
5.1 Informations et conseils importants
6 Protocole pour l’extraction d’ADN à partir d’échantillons de denrées alimentaires
11
13
6.1 Résumé du protocole
13
6.2 Protocole détaillé
15
7 Annexes
18
7.1 Guide de résolution des problèmes
18
7.2 Informations de commande
20
7.3 Restrictions d’utilisation / ​garantie
22
7.4 Versions linguistiques et prédominance
22
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
1
ADN des aliments
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoMag® DNA Food
REF
1 × 96 preps
744945.1
4 × 96 preps
744945.4
NucleoMag® B-Beads
2 × 1.5 mL
12 mL
Tampon de lyse CF
100 mL
500 mL
Tampon de fixation CB
100 mL
300 mL
Tampon de lavage CMW
100 mL
300 mL
Tampon de lavage CQW
125 mL
2 × 250 mL
Tampon d’élution CE
30 mL
125 mL
Protéinase K liquide
1 × 1250 µL
4,5 mL
Manuel d’utilisation
1
1
1.2
Réactifs, consommables et équipements à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
80 % d’éthanol
•
Équipements de protection individuelle (p.e., blouse, gants, lunettes)
Produit
REF
Conditionnement
Aimant pour la séparation des billes magnétiques p.e
NucleoMag® SEP
744900
1
NucleoMag® SEP Mini
744901
1
NucleoMag® SEP Maxi
744902
1
NucleoMag® SEP 24
744903
1
Plaque de séparation pour la séparation des billes
magnétiques, p.e.
Square-well Block (bloc 96 puits avec puits carrés de
2.1 mL)
740481
4
740481.24 24
2
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
ADN des aliments
Produit
REF
Tubes de lyse pour l’incubation des échantillons et la
lyse, p.e
Rack of Tubes Strips (1 set comprend 1 Rack, 12
barrettes avec 8 tubes chacune (puits de 1,2 mL), et 12
Cap Strips
740477
4 sets
740477.24 24 sets
Plaque d’élution pour collecter les acides nucléiques
purifiés, p.e.
Elution Plate U-bottom (microplaque 96 puits à fond en U
de 300 µL)
740486.24 24
Pour l’utilisation du kit sur les instruments KingFisher® 744950
p.e.
KingFisher® 96 Accessory Kit A (Square-well Blocks,
Deep-well tip combs, Plaques pour 4 × 96 preps avec le
NucleoMag® DNA Food
1.3
Conditionnement
1 set
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé aux personnes qui utilisent le kit NucleoMag® DNA Food pour la
première fois de lire le protocole détaillé de ce manuel d’utilisation. Les utilisateurs expérimentés
peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du protocole est conçu pour
être utilisé comme un outil de suivi rapide de l’exécution de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible sur le site www.mn-net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes.
1.4
Aide à l’automatisation
Les kits d’extraction MN sont conçus pour une facilité d’automatisation, offrant une compatibilité
avec une gamme de systèmes robotiques ouverts reconnus. Que vous utilisiez des systèmes
à barreaux magnétiques ou des manipulateurs de liquides comme Hamilton, Tecan, Eppendorf
ou d’autres plateformes, nos kits garantissent des processus d’extraction efficaces et fiables.
Contactez-nous pour obtenir une assistance complète et des solutions d’automatisation sur
mesure, afin de rendre votre expérience d’extraction transparente et sans effort.
Vous avez des questions sur l’assistance en matière de script ou sur le service d’automatisation
de MACHEREY‑NAGEL ?
Veuillez nous contacter pour une assistance personnalisée :
Téléphone : +49 2421 969‑333
E-mail : support@mn-net.com
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
3
ADN des aliments
2
Description du produit
2.1
Principe général
Le kit NucleoMag® DNA Food est conçu pour l’extraction d’ADN génomique à partir
d’échantillons de denrées alimentaires et d’aliments pour animaux. La procédure est basée
sur l’adsorption réversible des acides nucléiques sur des billes paramagnétiques dans des
conditions de tampons appropriées. La lyse des échantillons est réalisée par incubation des
échantillons avec la protéinase K à 65 °C. Les lysats doivent être clarifiés par centrifugation ou
filtration afin d’éliminer les contaminants et les débris cellulaires résiduels. Pour fixer les acides
nucléiques aux billes paramagnétiques, le tampon de fixation CB et les NucleoMag® B-Beads
sont ajoutés au lysat clarifié. Après la séparation magnétique, les billes paramagnétiques sont
lavées pour éliminer les contaminants et les sels à l’aide des tampons de lavage CMW, CQW
et de l’éthanol à 80 %. L’éthanol résiduel des étapes de lavage précédentes est éliminé par
séchage à l’air. Ensuite, l’ADN hautement purifié est élué avec le tampon d’élution (CE) à faible
teneur en sel et peut être utilisé directement pour des applications en aval. Le kit NucleoMag®
DNA Food peut être utilisé soit manuellement, soit de manière automatisée sur des robots
pipeteurs standards et des séparateurs magnétiques automatisés.
Nous pouvons fournir une assistance personnalisée, des informations sur les protocoles ou des
scripts vérifiés pour de nombreuses plateformes. Pour plus d’informations, veuillez contacter
notre service d’assistance technique ou visiter le site www.mn-net.com/automation.
2.2
Caractéristiques du kit
•
Le kit NucleoMag® DNA Food est conçu pour la préparation rapide, manuelle et
automatisée à petite échelle de l’ADN à partir d’échantillons de denrées alimentaires
ou d’aliments pour animaux. Pour l’extraction de l’ADN des bactéries présentes dans
les échantillons de denrées alimentaires ou d’aliments pour animaux, veuillez suivre les
recommandations du paragraphe 5.1 page 11.
•
Le kit NucleoMag® DNA Food peut être utilisé pour l’identification de l’ADN d’OGM
ou de composants d’origine animale dans les denrées alimentaires et les aliments pour
animaux.
•
Le kit fournit des réactifs pour la purification jusqu’à 200 mg de matériel. En fonction de
l’échantillon, les rendements typiques pour le kit NucleoMag® DNA Food sont de l’ordre
de 0,1 à 10 µg d’ADN.
•
L’ADN élué est prêt à être utilisé pour des réactions ultérieures telles que la PCR en temps
réel, la détection d’OGM, etc.
•
Le kit NucleoMag® DNA Food est conçu pour être utilisé avec la plaque à aimant
magnétique NucleoMag® SEP (voir informations de commande) ou tout autre système de
séparation magnétique (voir paragraphe 2.3 page 7). Le temps de préparation manuel
de 96 échantillons est d’environ 120 minutes.
•
NucleoMag® DNA Food permet une automatisation facile sur les instruments courants
de manipulation des liquides ou les séparateurs magnétiques automatisés. Le temps de
préparation réel dépend de la configuration de l’instrument et du système de séparation
magnétique utilisé. Généralement, 96 échantillons peuvent être purifiés en moins de
120 minutes en utilisant le NucleoMag® SEP sur une plateforme d’automatisation. Pour
plus d’informations sur le processus d’automatisation et la disponibilité de programmes
4
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
ADN des aliments
prêts à l’emploi pour certaines plateformes, veuillez contacter votre distributeur local ou
MN directement.
•
Réserver à l’usage de la recherche
2.3
Systèmes de séparation magnétique
Pour l’utilisation de NucleoMag® DNA Food, il est recommandé d’utiliser le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. La séparation est effectuée dans un Square-well Block (voir
informations de commande). Le kit peut également être utilisé avec d’autres séparateurs
magnétiques courants.
Séparateur magnétique
Plaque ou tube de séparation
®
NucleoMag SEP (MN REF 744900)
Square-well Block (MN REF 740481)
NucleoMag® SEP Mini (MN REF 744901)
Tubes de réaction de 1,5 mL ou 2 mL
(Sarstedt)
NucleoMag® SEP Maxi (MN REF 744902)
Tubes de 50 mL (Falcon)
NucleoMag® SEP 24 (MN REF 744903)
24 Square-well Block U-bottom (MN
REF 740448.4/.24)
Tecan Te-MagS™
Tubes de 1,5 mL sans couvercle (Sarstedt)
Séparation à aimants statiques
Les séparateurs avec aimants statiques, par exemple le NucleoMag® SEP ou d'autres
séparateurs magnétiques courants, conviennent à une utilisation manuelle et sur les stations de
travail de manipulation des liquides : ce type de séparateur est recommandé en combinaison
avec un agitateur de microplaques approprié pour une remise en suspension optimale des
billes pendant les étapes de lavage et d'élution. Alternativement, les billes peuvent être remises
en suspension dans le tampon par pipetages successifs. Pour une utilisation entièrement
automatisée sur les stations de travail de manipulation des liquides, un bras manipulateur est
nécessaire ; la plaque est transférée vers le séparateur magnétique pour la séparation des billes
et transférée vers le module d'agitation pour la remise en suspension des billes.
Systèmes à aimants mobiles
Ces séparateurs disposent d’aimants se déplaçant d’un côté à l’autre des puits, entraînant les
billes à travers les tampons. La séparation magnétique a lieu lors de l’arrêt du système.
Séparateurs automatisés
Ces séparateurs transfèrent les billes dans les différents tubes ou plaques. Les billes sont
resuspendues par rétractation des aimants à l’intérieur de leur protection. Après chaque étape
de fixation, lavage ou d’élution, les billes sont collectées et transportées dans le tube ou plaque
correspondant à la solution suivante.
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
5
ADN des aliments
2.4
Réglage des paramètres d’agitation
Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques pour les étapes de lavage et d’élution, les
réglages des paramètres d’agitation doivent être soigneusement ajustés pour chaque plaque
de séparation spécifique et chaque agitateur afin d’éviter toute contamination croisée d’un puits
à l’autre. Procéder comme suit :
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour les étapes de fixation et de lavage :
•
Déposer 600 µL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque
sur l’agitateur et commencer à agiter à une vitesse modérée pendant 30 secondes.
Éteindre l’agitateur et vérifier la présence de petites gouttelettes d’eau colorée à la surface
de la plaque.
•
Augmenter la vitesse d’agitation pendant 30 secondes supplémentaires et vérifier à
nouveau la présence de gouttelettes à la surface de la plaque.
•
Continuer à augmenter la vitesse d’agitation jusqu’à ce que vous observiez des
gouttelettes sur le dessus de la plaque de séparation. Réduire progressivement la vitesse,
vérifier l’absence de projections et utiliser ce réglage pour l’étape de lavage.
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour l’étape d’élution :
•
Déposer 100 – 200 µL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation et
procéder comme décrit ci-dessus.
2.5
Manipulation des billes
Distribution des billes
Une distribution homogène des billes magnétiques dans les différents puits de la plaque de
séparation est essentielle pour une bonne reproductibilité. Par conséquent, avant d’utiliser les
billes, s’assurer que les billes sont complètement remises en suspension. Bien agiter le flacon
de stockage ou le placer brièvement sur un vortex. Lors de l’automatisation, une étape de
mélange des billes au préalable avant d’aspirer les billes du réservoir est recommandée pour
garder les billes remises en suspension.
Durée de séparation magnétique
L’attraction des billes magnétiques sur les aimants dépend de la force magnétique des aimants,
de la plaque de séparation choisie, de la distance entre les parois des puits et les aimants ainsi
que du volume à traiter. Les temps d’aimantation des billes doivent être vérifiés et ajustés pour
chaque système. Il est recommandé d’utiliser les plaques ou des tubes de séparation spécifiés
par le fournisseur du séparateur magnétique.
Lavage des billes
Le lavage des billes peut être réalisé par agitation ou par pipetage. Contrairement au mélange
par pipetages successifs, le mélange par agitation permet de mélanger simultanément tous
les échantillons. Cela permet de réduire le temps et le nombre de cônes nécessaires à la
préparation. La remise en suspension par pipetages successifs est cependant plus efficace que
l’agitation de la plaque ou l’agitation magnétique.
6
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
ADN des aliments
Méthode
Efficacité de
la remise en
suspension
Rapidité
Petit volume
d’élution
possible
Nombre
de cônes
nécessaires
Magnétique
+
++
+
Faible
Agitateur
++
++
+++
Faible
Pipetage
+++
+*
++
Haut
+ : acceptable, ++ : bon, +++ : excellent, * Dispositif de pipetage à 8 canaux
2.6
Procédures d’élution
L’ADN purifié peut être élué directement avec le tampon d’élution CE fourni. L’élution peut être
effectuée dans un volume ≥ 50 µL. Il est essentiel de recouvrir complètement les NucleoMag®
B-Beads avec le tampon d’élution pendant l’étape d’élution. Le volume de tampon d’élution
distribué dépend du système de séparation magnétique (p.e., la position du culot à l’intérieur
de la plaque de séparation). Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être
entièrement remis en suspension dans le tampon d’élution. Pour certains séparateurs, des
volumes d’élution plus élevés peuvent être nécessaires pour recouvrir la totalité du culot.
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
7
ADN des aliments
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention : Les tampons CB, CMW et CQW contiennent des sels chaotropiques ! Porter des
gants et des lunettes !
Tous les composants du kit NucleoMag® DNA Food doivent être conservés à température
ambiante (15 – 25 °C) et sont stables jusqu’au : voir étiquette du kit.
Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi.
4
Safety instructions
Lorsque vous travaillez avec les kits NucleoMag® DNA Food, portez des vêtements de
protection appropriés (p.e. une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de
protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées
(les FDS sont disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds).
Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon CMW et le tampon CQW peut former
des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, ne
pas ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation
d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoMag® DNA Food n’ont pas été testés pour détecter
la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du
matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du traitement par le tampon
de lyse fortement dénaturant, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les
déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés
conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sûre et conforme aux dispositions règlementaires locales.
8
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
ADN des aliments
5
Remarques générales
5.1
Informations et conseils importants
•
En raison de la faible teneur en ADN des aliments transformés, il convient de commencer
ce protocole avec un maximum de 0,2 g de matériel.
•
Des tampons de lyse ont été testés (voir liste à la page suivante) pour l’extraction d’ADN
à partir de divers types d’échantillons, notamment des aliments d’origine végétale ou
animale et des bactéries. Pour détecter l’ADN bactérien dans les échantillons alimentaires,
nous recommandons une pré-culture d’une nuit de l’échantillon dans un milieu de culture
approprié. Centrifuger une aliquote de la culture et commencer la préparation avec le
culot bactérien.
•
L’ajout de RNase A (non incluse dans le kit, voir les informations de commande) peut
être recommandé pour les échantillons riches en ARN. Ajouter 10 μL (solution mère
de 20 mg/mL) par 550 μL de tampon de lyse à l’étape 2 du protocole ou effectuer une
digestion à la RNase A dans l’éluat avant toute autre utilisation.
•
Le ketchup, les sauces et les échantillons de liquides similaires (équivalents à 0,2 g)
peuvent être mélangés avec du tampon de lyse (500 – 1000 μL chacun) et incubés
avec de la protéinase K liquide comme décrit dans le protocole (voir les informations de
commande pour du tampon de lyse CF supplémentaire).
•
Pour les échantillons hygroscopiques en poudre, il est possible d’utiliser plus de tampon
de lyse que ce qui est indiqué dans le protocole jusqu’à ce que la solution de lyse
soit au moins semi-liquide et puisse être pipetée (voir les informations de commande
pour le tampon de lyse CF). L’extraction peut être améliorée par une préincubation de
l’échantillon avec le tampon de lyse pendant 1 à 2 heures.
•
Selon les réglementations locales, différentes quantités d’échantillons doivent être
analysées pour la détection des OGM, par exemple, jusqu’à 1 – 2 g d’échantillons peuvent
être utilisés avec des volumes de tampon de lyse ajustés. Nous recommandons d’utiliser
une seule aliquote de 400 µL maximum (étape 3) du surnageant clarifié pour la procédure
avec le kit NucleoMag® DNA Food. Sinon, il vous faudra augmenter proportionnellement
les quantités respectives de tampons de fixation et de lavage.
•
Pour la procédure de volumes d’échantillons plus importants, il est nécessaire
d’augmenter le volume du tampon de lyse et la quantité de protéinase K. Pour chaque
0,1 g d’échantillon, ajouter 275 μL de tampon CF et 5 μL de protéinase K liquide. Après
incubation et clarification du lysat, passer à l’étape 3 du protocole et traiter jusqu’à 400 μL
du lysat clarifié.
•
Pour les jus de fruits ou les échantillons similaires ayant une faible valeur pH, un
ajustement du pH à 8 (p.e. par NaOH) peut améliorer de manière significative la
récupération des acides nucléiques.
•
Pour la procédure d’échantillons complexes ou difficiles, il est possible d’utiliser une plus
grande quantité de tampon de lyse que celle indiquée dans le protocole. Transférer le
surnageant clarifié après centrifugation dans un récipient de réaction approprié et ajouter
1,5 vol de tampon de fixation et la quantité respective de NucleoMag® B-Beads
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
9
ADN des aliments
Échantillons testés positivement (PCR)
Aliments (d’origine
végétale)
Produits bruts : maïs, soja, colza, etc. (poudre ou huile)
Produits à base de chocolat : cacao, produits de nougat
Céréales pour petit-déjeuner, muesli, pâte à tartiner aux noix/au
chocolat
Confitures et concentrés de fruits
Pollen / ​miel
Lécithine
Épices
Pain
Semences diverses
Aliments (d’origine
animale)
Produits bruts et transformés (viande, saucisse, tourte)
Cosmétiques
Ingrédients végétaux et animaux (p.e., en crème ou en poudre)
Bactéries
Cultures starter, etc.
10
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
NucleoMag® DNA Food
6
Protocole pour l’extraction d’ADN à partir
d’échantillons de denrées alimentaires
6.1
Résumé du protocole
•
Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les
paragraphes 1.2 et 2.3, respectivement.
•
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 15.
Avant de débuter la procédure :
1
Homogénéiser les
échantillons
0,2 g d’échantillon
550 µL de CF préchauffé (65 °C)
10 µL de protéinase K liquide
Mélanger
65 °C, 30 min
2
Clarifier le lysat
5 600 x g,
20 min
3
Fixer l’ADN aux
NucleoMag® B-Beads
Jusqu’à 400 µL de lysat clarifié
25 µL NucleoMag® B-Beads
600 µL CB
Mélanger par agitation
pendant 10 min à TA.
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 5 min de
séparation.
4
Laver avec le tampon
CMW
Retirer le Square-well Block du
NucleoMag® SEP
600 µL CMW
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
11
NucleoMag® DNA Food
Remettre en suspension : Agiter 2 min
à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
5
Laver avec le tampon
CQW
Retirer le Square-well Block du
NucleoMag® SEP
600 µL CQW
Remettre en suspension : Agiter 2 min
à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
6
Laver avec le tampon
80 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du
NucleoMag® SEP
600 µL d’éthanol 80 %
Remettre en suspension : Agiter 2 min
à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Remove supernatant
after 2 min separation
7
12
Sécher les billes
15 min à TA
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
NucleoMag® DNA Food
Eluer l’ADN
8
Retirer le Square-well Block du
NucleoMag® SEP
50 – 100 µL CE
(Optionnel : élution à 56 °C)
Agiter 5 min à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages
successifs)
Séparer 2 min et transférer l’ADN dans
la plaque d’élution.
6.2
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple,
NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.3 page 7). Il
est recommandé d’utiliser un Square-well Block pour la séparation (voir paragraphe 1.2 page
4). L’extraction d’ADN peut également être réalisée dans des tubes de réaction avec des
séparateurs magnétiques appropriés. Ce protocole est destiné pour une utilisation manuelle et
sert de guide pour l’adaptation du kit aux systèmes automatisés.
•
Pour les exigences matérielles, voir le paragraphe 2.3 page 7.
Avant de débuter la procédure :
•
Préchauffer le tampon CF à 65 °C.
Pour chaque préparation, recueillir jusqu’à 200 mg d’échantillon dans un contenant approprié
pour la lyse (p.e., Rack of Tubes Strips).
1
Homogénéiser les échantillons
Homogénéiser jusqu’à 200 mg d’échantillon à l’aide d’un broyeur commercial. Transférer
les échantillons homogénéisés dans un rack de Tubes Strips et ajouter 550 µL de
Tampon de Lyse CF préchauffé à 65 °C. Ajouter 10 µL de Protéinase K liquide. Fermer
les barrettes de tubes à l’aide des barrettes de bouchons et mélanger par agitation
vigoureuse pendant 15 à 30 s. Centrifuger brièvement pendant 30 s à 1 500 x g pour
recueillir tout l’échantillon au fond des barrettes de tubes.
Si le volume du tampon de lyse n’est pas suffisant pour dissoudre complètement
l’échantillon, ajouter du tampon (et de la protéinase K liquide proportionnellement)
jusqu’à ce que l’échantillon soit totalement remis en suspension.
Incuber à 65 °C pendant 30 min. Pour une lyse optimale, incuber avec agitation.
Optionnel : Si l’ADN sans ARN est crucial pour les applications en aval, une digestion
RNase peut être effectuée : Après incubation à 65 °C pendant 30 min, ajouter 10 µL de
RNase A (solution mère de 10 mg/mL, non fournie, voir les informations de commande)
par 550 µL de tampon de lyse, bien mélanger et incuber à TA (18 – 25 °C) pendant
30 min. Poursuivre le protocole avec l’étape de centrifugation.
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
13
NucleoMag® DNA Food
2
Clarifier le lysat
Centrifuger les échantillons pendant 20 min à pleine vitesse (5 600 – 6 000 x g) pour
culotter les contaminations et les débris cellulaires. Retirer les barrettes de 8 bouchons.
Après homogénéisation et traitement de l’échantillon avec du tampon de lyse, les
mélanges peuvent être clarifiés facilement et efficacement soit par centrifugation, soit
avec la plaque filtrante NucleoSpin® 96 Filter (voir informations de commande).
3
Fixer l’ADN aux NucleoMag® B-Beads
Transférer jusqu’à 400 µL de lysat clarifié dans un Square-well Block. Ajouter
25 µL de NucleoMag® B-Beads et 600 µL de tampon de fixation CB. Mélanger
par pipetages successifs 6 fois et agiter pendant 5 min à température ambiante.
Alternativement, lors de la procédure du kit sans agitateur, pipeter successivement 10
fois et incuber pendant 5 min à température ambiante.
Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer du flacon
de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une suspension
homogène se forme.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 5 min jusqu’à ce que
toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide
d’une pipette.
Note : Ne pas perturber les culots de billes attirés lors de l’aspiration du surnageant.
Le culot de billes peut ne pas être visible lors de cette étape. Prélever le surnageant de
l’autre côté du puits.
4
Laver avec le tampon CMW
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 µL de tampon CMW dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension
(1 – 3 min). Il est également possible de remettre les billes en suspension par pipetages
successifs.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 – 5 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
5
Laver avec le tampon CQW
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 µL de tampon CQW dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension
(1 – 3 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par
pipetages successifs.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
14
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
NucleoMag® DNA Food
6
Laver avec le tampon à 80 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 µL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension
(1 – 3 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par
pipetages successifs.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
7
Sécher les billes magnétiques à l’air
Sécher à l’air les billes magnétiques pendant 10 à 15 min à température ambiante.
8
Eluer l’ADN
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter le volume souhaité de tampon CE (50 – 100 µL) à chaque puits du Square-well
Block et remettre les billes en suspension par agitation pendant 5 min à température
ambiante. Il est également possible de remettre les billes en suspension en les pipetant
successivement puis incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante ou à 56 °C.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
soient attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ADN purifié dans des
plaques d’élution ou des barrettes de tubes (voir informations de commande).
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
15
ADN des aliments
7
Annexes
7.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possibles et suggestions
L’homogénéisation des denrées alimentaires n’est pas
suffisante
•
Pour la plupart des échantillons, nous recommandons
le broyage avec des billes d’acier (voir paragraphe 2.5
page 8 du kit NucleoSpin® Food) ou l’utilisation
de systèmes commerciaux permettant le broyage, le
mélange ou l’homogénéisation.
Extraction d’ADN à partir de matériel alimentaire insuffiisante
•
Pour obtenir des rendements plus élevés d’ADN, le
temps d’incubation dans le tampon de lyse peut être
prolongé (jusqu’à une nuit).
Echantillon riche en ARN
•
Faible rendement en ADN
Ajouter 10 – 20 µL de solution de RNase A (10 mg/mL)
au tampon de lyse avant l’incubation à chaud. En cas
d’échec, ajouter l’enzyme au lysat clarifié et incuber
pendant 30 min à 37 °C.
Volume de tampon d’élution insuffisant
•
Le culot des billes doit être entièrement recouvert de
tampon d’élution.
Performance insuffisante du tampon d’élution pendant
l’étape d’élution
•
Éliminer complètement les tampons résiduels lors
des étapes de séparation. Les tampons résiduels
diminuent l’efficacité des étapes de lavage et d’élution.
Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant
•
Ne pas perturber les billes attirées lors de l’aspiration
du surnageant, en particulier lorsque le culot
magnétique n’est pas visible dans le lysat.
Aspiration et perte de billes
•
16
Durée de séparation magnétique trop courte ou
vitesse d'aspiration trop élevée.
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
ADN des aliments
Problème
Causes possibles et suggestions
Procédure de lavage insuffisante
Pureté insuffisante / ​Faible
sensibilité
•
Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de
séparateur et de plaque, par exemple, le Square-well
Block en combinaison avec le NucleoMag® SEP.
•
S’assurer que les billes sont remises en suspension
complètement pendant la procédure de lavage. Si
l’agitation n’est pas suffisante pour remettre les billes
en suspension complètement, mélanger par pipetages
successifs.
•
Répéter le lavage avec de l’éthanol à 80 %.
Procédure de lavage insuffisante
Mauvaise performance de
l’ADN lors des applications
avales
•
Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de
séparateur et de plaque, par exemple, le Square-well
Block en combinaison avec le NucleoMag® SEP.
•
S’assurer que les billes sont remises en suspension
complètement pendant la procédure de lavage. Si
l’agitation n’est pas suffisante pour remettre les billes
en suspension complètement, mélanger par pipetages
successifs.
•
Répéter le lavage avec de l’éthanol à 80 %.
Contamination par l’éthanol provenant des tampons de
lavage
•
Veillez à éliminer toute la solution de lavage
éthanolique, car l’éthanol résiduel interfère avec les
applications en aval.
Évaporation de l’éthanol des tampons de lavage
•
Fermer hermétiquement les flacons de tampons, éviter
l’évaporation de l’éthanol des flacons de tampons ainsi
que des tampons remplis dans les réservoirs. Ne pas
réutiliser les tampons des réservoirs de tampons.
Durée de séparation magnétique trop courte
•
Perte des billes
Augmenter la durée de séparation pour permettre aux
billes d’être complètement attirées par les aimants
avant d’aspirer tout liquide du puits.
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
•
Une vitesse d’aspiration élevée pendant l’étape
d’élution peut entraîner une perte des billes. Réduire la
vitesse d’aspiration pour l’étape d’élution.
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
17
ADN des aliments
Problème
Causes possibles et suggestions
Contaminations des parties supérieures des puits
•
Contamination croisée
Présence dans l’échantillon de contaminants dégradant
l’ADN (p.e. composés phénoliques, métabolites).
Qualité de l’ADN faible
•
7.2
Ne pas souiller les bords du Square-well Block lors du
transfert du lysat. Si le bord des puits est contaminé,
sceller le Square-well Block avec une feuille PE autoadhésive (voir informations de commande) avant de
démarrer l’agitateur.
Répéter l’étape de lavage avec le tampon CMW.
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoMag DNA Food
744945.1
744945.4
1 × 96 preps
4 × 96 preps
Plaque NucleoSpin® 96 Filter
740663.2
20
Tampon CF
740946
1L
Protéinase K (lyophilisée)
Protéinase K liquide
740506
740396
100 mg
5 mL
RNase A
740505.50
50 mg
100 mg
®
740505
®
Plaque NucleoSpin Trace Filter
740677
20
NucleoMag® SEP
744900
1
NucleoMag® SEP Mini
744901
1
®
NucleoMag SEP Maxi
744902
1
®
NucleoMag SEP 24
744903
1
Square-well Blocks
740481
740481.24
4
24
Film PE auto-adhésif
740676
50 feuilles
Rack of Tube Strips
(le set comprend 1 rack, 12 barrettes de 8 tubes
chacune, et 12 barrettes de bouchons)
740477
740477.24
4 sets
24 sets
Barrettes de 8 bouchons
740638
30 barrettes
18
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
ADN des aliments
Produit
REF
Conditionnement
Elution Plate U-bottom
(microplaque de 96 puits avec des puits de
300 µL à fond en U)
740486.24
24
744950
1 set
Plaque 96 Deep-well pour système à barreaux
magnétiques
744955
25
Tip Combs 8-puits pour système à barreaux
magnétiques
744960
50
Kit accessoires 8-puits pour système à barreaux
magnétiques - IsoPure Mini ou MagnetaPure 32
Plus. Le kit contient 5 plaques 96 Deep-well et 10
Tip Combs 8-puits.
744961
1 set
Pour l’utilisation du kit sur les instruments
KingFisher® :
p.e., 96-well Accessory Kit A pour KingFisher
(Square Well Blocks, Deep-well tip combs,
Plaques pour 4 × 96 preps)
Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit.
MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
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ADN des aliments
7.3
Restrictions d’utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour
obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la
documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Veuillez contacter :
MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Tél : +49 24 21 969‑333
support@mn‑net.com
7.4
Versions linguistiques et prédominance
Ce document est disponible en plusieurs langues. En cas de divergence ou de problème
d’interprétation, la version anglaise prévaut.
Marques déposées :
KingFisher® est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific.
NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG.
Te-MagS™ est une marque déposée de Tecan Group Ltd, Suisse.
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux
marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
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MACHEREY-NAGEL – 09/2024, Rev. 05
Plasmid DNA
Clean up
RNA
DNA
Viral RNA and DNA
Protein
High throughput
Accessories
Auxiliary tools
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