Macherey-Nagel NucleoSpin Tissue, Mini kit Mode d'emploi
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MACHEREY-NAGEL Biologie moléculaire Bioanalysis Manuel d’utilisation User manual ADN génomique des tissus n NucleoSpin® Tissue Octobre 2024 / Rev. 21 www.mn-net.com www.mn-net.com ADN génomique des tissus Résumé du protocole (Rev. 21) NucleoSpin® Tissue 1 Préparer l’échantillon Couper 25 mg en petits morceaux 180 μL T1 2 25 μL Protéinase K Lyse de l’échantillon 56 °C, 1–3 h 200 μL B3 3 Lyse de l’échantillon 4 Ajustement des conditions de fixation 70 °C, 10 min 210 μL 96–100 % d’éthanol Charger les échantillons 5 Fixation de l’ADN 11,000 x g, 1 min 6 Lavage de la membrane de silice 1er lavage 500 μL BW lavage 600 μL B5 2 ème 1er et 2ème 7 Séchage de la membrane de silice 11,000 x g, 1 min 11,000 x g, 1 min 100 μL BE 8 Elution d’ADN très pur TA, 1 min 11,000 x g, 1 min MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-333 · support@mn-net.com · www.mn-net.com ADN génomique des tissus Sommaire 1 Composants 5 1.1 Contenu du kit 5 1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur 6 1.3 A propos de ce manuel 6 2 Description du produit 7 2.1 Principe général 7 2.2 Caractéristiques du kit 7 2.3 Procédures d’élution 8 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 10 4 Instructions de sécurité 11 4.1 11 Elimination des déchets 5 Protocole standard pour les tissus humains ou animaux et les cellules en culture 12 6 Protocoles additionnels 15 6.1 15 Protocole additionnel pour les queues de souris ou de rats 6.2 Protocole additionnel pour les bactéries 16 6.3 Protocole additionnel pour la levure 17 6.4 Protocole additionnel pour les taches de sang séché (p.e. NucleoCard®s, FTA® cards, Guthrie cards) 18 6.5 Protocole additionnel pour l’ADN génomique et l’ADN viral à partir d’échantillons de sang 19 6.6 Protocole additionnel pour les racines des cheveux 20 6.7 Protocole additionnel pour les tissus inclus en paraffine 21 6.8 Protocole additionnel pour l’ADN génomique provenant des fèces 22 6.9 Protocole additionnel pour la recherche d’ADN viral (p.e. CMV) dans les fèces 23 6.10 Protocole additionnel pour la détection de Mycobacterium tuberculosis ou de Legionella pneumophila dans les expectorations ou les lavages broncho-alvéolaires 25 6.11 Protocole additionnel pour la détection des bactéries EHEC dans les aliments (p.e. lait de vache frais) 26 6.12 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN bactérien (p.e. Chlamydia trachomatis) à partir de cultures, de liquides biologiques ou d’échantillons cliniques. 27 6.13 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN bactérien (p.e. Borrelia burgdorferi) à partir de l’urine 28 6.14 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN viral (p.e. CMV) à partir de l’urine 28 6.16 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN génomique à partir d’écouvillons dentaires 31 6.17 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN génomique à partir d’écouvillons buccaux 32 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 3 ADN génomique des tissus 6.18 Protocole additionnel pour la purification d’ADN génomique à partir du sperme 34 6.19 Protocole additionnel pour la purification d’ADN génomique des cyanobactéries 36 6.20 Utilisation du NucleoSpin® Tissue pour la purification d’ADN de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (MRSA) 37 8 Annexes 43 8.1 Guide de résolution des problèmes 43 8.2 Informations de commande 45 8.3 Restrictions d'utilisation / garantie 47 4 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 ADN génomique des tissus 1 Composants 1.1 Contenu du kit NucleoSpin® Tissue 10 preps 740952.10 50 preps 740952.50 250 preps 740952.250 Tampon de lyse T1 5 mL 20 mL 100 mL Tampon de lyse B3 10 mL 15 mL 75 mL Tampon de lavage BW 6 mL 30 mL 150 mL Tampon de lavage B5 (concentré) 6 mL 12 mL 50 mL Tampon d’élution BE* 13 mL 13 mL 60 mL Protéinase K (lyophilisée) ** 6 mg 30 mg 2 × 75 mg Tampon de protéinase PB 1,8 mL 1,8 mL 8 mL Colonnes NucleoSpin® Tissue (anneaux vert clair) 10 50 250 Tubes collecteurs (2 mL) 20 100 500 Manuel d’utilisation 1 1 1 REF * Composition du tampon d’élution AE : 5 mM Tris/HCl, pH 8,5 ** Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3. MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 5 ADN génomique des tissus 1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur Réactifs • 96 – 100 % d’éthanol Consommables • Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL pour la lyse des échantillons et l’élution de l’ADN • Elimination des déchets cônes jetables Equipment • Pipettes manuelles • Centrifugeuse pour microtubes • Broyeur Vortex • Équipement pour le broyage et l’homogénéisation des échantillons • Équipements de protection individuelle (blouse, gants, lunettes) Pour les protocoles additionnels (voir paragraph 6), du matériel supplémentaire peut être nécessaire - voir les protocoles additionnels individuels pour plus d’informations. 1.3 A propos de ce manuel Il est fortement recommandé de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce manuel d’utilisation si le kit NucleoSpin® Tissue est utilisé pour la première fois. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil supplémentaire de référence rapide pendant l’exécution de la procédure de purification. Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante : www.mn-net.com. Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes. Note : Le tampon B3 est désormais livré mélangé au préalable. 6 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 ADN génomique des tissus 2 Description du produit 2.1 Principe général La méthode NucleoSpin® Tissue permet de préparer de l’ADN génomique à partir de tissus, de cellules (p.e., de bactéries) et de nombreuses autres sources. La lyse est réalisée par incubation de l’échantillon dans une solution de protéinase K / SDS. Les conditions appropriées pour la fixation de l’ADN sur la membrane de silice des colonnes NucleoSpin® Tissue sont obtenues par l’ajout de sels chaotropiques et d’éthanol au lysat. Le processus de liaison est réversible et spécifique aux acides nucléiques. Les contaminations sont éliminées par un lavage ultérieur avec deux tampons différents. L’ADN génomique pur est finalement élué dans des conditions de faible force ionique dans un tampon d’élution légèrement alcalin. 2.2 Caractéristiques du kit • NucleoSpin® Tissue est conçu pour la préparation rapide et à petite échelle d’ADN génomique très pur à partir de n’importe quel tissu, cellule, bactérie, levure, échantillon médico-légal, sérum, plasma ou autre fluide corporel. Il convient également à la préparation d’ADN à partir de sang humain ou animal. L’ADN purifié peut être utilisé directement pour la PCR, le Southern blotting ou tout type de réaction enzymatique. • Le kit permet de purifier jusqu’à 35 μg d’ADN génomique pur avec un rapport A260 / A280 compris entre 1,7 et 1,9. La colonne NucleoSpin® Tissue est capable de fixer jusqu’à 60 μg d’ADN génomique. • Pour la lyse de certaines souches bactériennes et de levure, des enzymes supplémentaires peuvent être nécessaires, qui ne font pas partie de ce kit. Voir le protocole additionnel correspondant pour plus de détails. Table 1: Résumé des caractéristiques du kit Paramètres NucleoSpin® Tissue Technologie Technologie membrane de silice Format Mini colonne à centrifuger Échantillon d’articles < 25 mg de tissue 10² – ¹⁰⁷ cellules en culture Rendement typique 20 – 35 μg Volume d’élution 60 – 100 μL Temps de préparation 20 min/preps (hors lyse) Capacité de fixation 60 μg Utilisation Réserver à l’usage de la recherche MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 7 ADN génomique des tissus • Produit de qualité médico-légale : NucleoSpin® Tissue is certified as forensic quality product. Consumables used in forensics need to be treated carefully to prevent DNA contamination. MACHEREY‑NAGEL therefore has a stringently controlled production process to avoid DNA contamination of consumables. Further, MACHEREY‑NAGEL uses ethylene oxide (EO) treatment to remove amplifiable DNA, which might still be introduced during the manufacturing process. MACHEREY‑NAGEL products carrying the forensic quality seal, contain plastic materials that are EO treated. This means, DNA of any kind, which might still be introduced into plastic consumables during the production process, is inactivated by means of the treatment with ethylene oxide, in order to prevent the generation of accidental human profile by PCR amplification. Ethylene oxide treatment has been shown to be the method of choice to prevent DNA profiles due to DNA contamination (Shaw et al. 2008 ; Figure 1). UV Gamma 100% 30% 40% 30% Full profile Electron beam Partial profile (loadable) 27% Ethylene oxide 3% 13% 87% 70% Partial profile (unloadable) No profile Figure 1 Selon Shaw et al, 2008, Comparaison des effets des techniques de stérilisation sur les profilage d’ADN. Int J Legal Med 122 : 29 – 33. 2.3 Procédures d’élution Outre la méthode standard (taux de récupération d’environ 70 à 90 %), plusieurs modifications sont possibles pour augmenter le rendement et la concentration. Utiliser le tampon d’élution pour l’une des procédures suivantes : • Rendement élevé : Effectuer deux étapes d’élution avec le volume indiqué dans le protocole individuel. Environ 90 à 100 % de l’acide nucléique lié peut être élué. • Concentration élevée : Effectuer une étape d’élution avec 60 % du volume indiqué dans le protocole individuel. La concentration d’ADN sera environ 30 % plus élevée qu’avec l’élution standard. Le rendement de l’acide nucléique élué sera d’environ 80 %. • Rendement et concentration élevés : Appliquer la moitié du volume de tampon d’élution comme indiqué dans le protocole individuel, incuber pendant 3 min et centrifuger. Appliquer une deuxième aliquote de tampon d’élution, incuber et centrifuger à nouveau. Ainsi, environ 85 à 100 % de l’acide nucléique lié est élué dans le volume d’élution standard à une concentration élevée. • Élution à 70 °C : Pour certains types d’échantillons, le chauffage du tampon d’élution à 70 °C augmente le rendement en ADN. . 8 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 ADN génomique des tissus L’élution peut également être effectuée avec un tampon Tris-EDTA (TE) de pH égal ou supérieur à 8. Cela permet d’accroître la stabilité de l’ADN, en particulier lors d’un stockage à long terme et/ou à usage multiple à 4 °C ou à température ambiante, grâce à l’inhibition des DNases omniprésentes. Cependant, l’EDTA interfère, selon la concentration finale, avec certaines applications en aval. Note : Le tampon d’élution BE (Tris/HCl 5 mM, pH 8,5) fourni avec le kit ne contient pas d’EDTA. Pour une performance optimale de l’ADN isolé dans les applications en aval, nous recommandons l’élution avec le tampon d’élution fourni et le stockage, en particulier à long terme, à -20 °C. Les cycles de congélation-décongélation n’auront aucun effet sur la plupart des applications en aval. Les exceptions possibles sont la détection de traces d’ADN ou la PCR à longue portée (p.e., > 10 kbp). Des cycles multiples de congélation-décongélation ou le stockage de l’ADN à 4 °C ou à température ambiante peuvent influencer les sensibilités de détection ou les efficacités de réaction en raison du cisaillement de l’ADN ou de l’adsorption sur les surfaces. MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 9 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention : Les tampons B3 et BW contiennent du sel chaotropique ! Porter des gants et des lunettes ! ATTENTION : Les tampons B3 et BW contiennent du chlorhydrate de guanidine qui peut former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation des échantillons. • Tous les composants du kit peuvent être conservés à une température comprise entre 15 et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. • Au cours du stockage, en particulier à basse température, un précipité blanc peut se former dans le tampon T1 ou B3. Ces précipités peuvent être facilement dissous en incubant le flacon à 50 – 70 °C avant utilisation. Avant de débuter une procédure NucleoSpin® Tissue, préparer les éléments suivants : • Tampon de lavage B5 : ajouter le volume indiqué d’éthanol (96 – 100 %) au tampon de lavage B5 concentré. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que de l’éthanol a été ajouté. Le tampon de lavage B5 peut être conservé à 15 – 25 °C pendant au moins un an. • Protéinase K : ajouter le volume indiqué de tampon protéinase PB pour dissoudre la protéinase K lyophilisée. La solution de protéinase K est stable à -20 °C pendant au moins 6 mois. NucleoSpin® Tissue 10 preps 50 preps 250 preps REF 740952.10 740952.50 740952.250 Tampon de lavage B5 (concentré) 6 mL Ajouter 24 mL d’éthanol 12 mL Ajouter 48 mL d’éthanol 50 mL Ajouter 200 mL d’éthanol Protéinase 6 mg Ajouter 260 μL de tampon protéinase 30 mg Ajouter 1,35 mL de tampon protéinase 2 × 75 mg Ajouter 3,35 mL de tampon pour protéinase dans chaque flacon ADN génomique des tissus 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® Tissue, portez des vêtements de protection appropriés (p.e., blouse de laboratoire, gants jetables et lunettes de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds). Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon B3 et le tampon BW peut former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, ne pas ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons. Les déchets générés par le kit NucleoSpin® Tissue n’ont pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales. 4.1 Elimination des déchets Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales. MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 11 NucleoSpin® Tissue 5 Protocole standard pour les tissus humains ou animaux et les cellules en culture Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Set un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Tissus Couper 25 mg de tissu humain ou animal en petits morceaux. Placer l’échantillon dans un tube de microcentrifugation (non fourni). Passer à l’étape 2. Les échantillons difficiles à lyser peuvent être broyés sous azote liquide ou traités dans un homogénéisateur mécanique (Polytron®, Ultra-Turrax®) : Ajouter 25 mg de tissu dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni), ajouter 50 – 75 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et homogénéiser. Cellules en culture Remettre en suspension jusqu’à 10⁷ cellules dans un volume final de 200 μL de tampon T1. Ajouter 25 μL de solution de protéinase K et 200 μL de tampon B3. Vortexer pour mélanger et incuber l’échantillon à 70 °C pendant 10 à 15 min. Passer à l’étape 4. 2 Lyse de l’échantillon Ajouter 180 μL de tampon T1 et 25 μL de solution de protéinase K. Vortexer pour mélanger. Veiller à ce que les échantillons soient complètement recouverts de solution de lyse. En cas de procédure sur plusieurs échantillons, la protéinase K et le tampon T1 peuvent être mélangés au préalable, directement avant l’utilisation. Ne pas mélanger le tampon T1 et la protéinase K plus de 10 à 15 min avant de les ajouter à l’échantillon : La protéinase K a tendance à s’autodigérer dans le tampon T1 en l’absence de substrat. 12 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 +180 μL T1 +25 μL Protéinase K Mélanger NucleoSpin® Tissue Incuber à 56 °C jusqu’à obtention d’une lyse complète (au moins 1 à 3 h). Vortex de temps en temps pendant l’incubation ou utiliser un incubateur à paritation. Les échantillons peuvent également être incubés pendant la nuit. Si l’ADN sans ARN est crucial pour les applications en aval, une digestion RNase peut être effectuée : Ajouter 20 μL de solution de RNase A (10 mg/mL) (non inclus ; voir les informations de commande) et incuber pendant 5 min supplémentaires à température ambiante. 3 Lyse de l’échantillon Vortexer les échantillons. Ajouter 200 μL de tampon B3, vortexer vigoureusement et incuber à 70 °C pendant 10 min. Vortexer brièvement. 56 °C, 1–3 h ou 56 °C, pendant une nuit +200 μL B3 70 °C, 10 min Si des particules insolubles sont visibles, centrifuger pendant 5 min à grande vitesse (par exemple, 11 000 × g) et transférer le surnageant dans un nouveau tube de microtubes (non fourni). 4 Ajustement des conditions de fixation Ajouter 210 μL ethanol (96 – 100 %)à l’échantillon et vortexer vigoureusement. Après l’ajout d’éthanol, un précipité filandreux peut devenir visible. Cela n’affectera pas l’extraction de l’ADN. Veillez à charger tout le précipité sur la colonne à l’étape suivante. 5 Fixation de l’ADN Pour chaque échantillon, placer une colonne NucleoSpin® Tissue dans un tube collecteur. Appliquer l’échantillon sur la colonne. Centrifuger pendant 1 min à 11,000 × g. Jeter le tube collecteur avec le filtrat et placer la colonne dans un nouveau tube collecteur (fourni). Si l’échantillon n’est pas aspiré complètement à travers la matrice, répéter l’étape de centrifugation à 11 000 × g. Jeter le filtrat. MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 +210 μL d’éthanol Vortex Charger les échantillons 11,000 × g, 1 min 13 NucleoSpin® Tissue 6 Lavage de la membrane de silice 1er lavage Ajouter 500 μL de tampon BW. Centrifuger pendant 1 min à 11,000 × g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. +500 μL BW 11,000 × g, 1 min 2ème lavage +600 μL B5 Add 600 μL Buffer B5 to the column and centrifuge for 1 min at 11,000 × g. Discard flowthrough and place the column back into the Collection Tube. 11,000 × g, 1 min Ajouter 500 μL de tampon BW. Centrifuger pendant 1 min à 11,000 × g Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 7 Séchage de la membrane de silice Centrifuger la colonne pendant 1 min à 11,000 × g. 11,000 × g, 1 min L’éthanol résiduel est éliminé au cours de cette étape. 8 Élution d’ADN très pur Placer la colonne NucleoSpin® Tissue dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni) et ajouter 100 μL de tampon BE. Incuber à température ambiante pendant 1 min. Centrifuger 1 min à 11,000 × g. Pour d’autres procédures d’élution, voir le chapitre 2.3. 14 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 +100 μL BE TA, 1 min 11,000 × g, 1 min NucleoSpin® Tissue 6 Protocoles additionnels 6.1 Protocole additionnel pour les queues de souris ou de rats Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Set un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Couper deux morceaux de 0,6 cm de queue de souris et les placer dans un tube à centrifuger de 1,5 mL (non fourni). Si l’on procède à la transformation de queues de rats, un morceau de 0,6 cm suffit. 2 Lyse de l’échantillon Ajouter 180 μL de tampon T1 et 25 μL de protéinase K et vortexer. Incuber à 56 °C pendant une nuit ou jusqu’à obtention d’une lyse complète. Le temps de lyse peut être considérablement réduit jusqu’à environ une heure si le tissu est fragmenté mécaniquement (p.e., si le tissu est coupé en très petits morceaux avant la lyse). Vortex occasionnellement pendant l’incubation ou utiliser un bain-marie à agitation. Pour éliminer les os ou les poils résiduels, centrifuger pendant 5 min à vitesse élevée (p.e., 11 000 × g). Transférer 200 μL de surnageant dans un nouveau tube. En cas de procédure sur plusieurs échantillons, la protéinase K et le tampon T1 peuvent être mélangés au préalable directement avant l’utilisation. Ne jamais mélanger le tampon T1 et la protéinase K plus de 10 à 15 min avant de les ajouter à l’échantillon : La protéinase K a tendance à s’autodigérer dans le tampon T1 en l’absence de substrat. 3 Lyse de l’échantillon Ajouter 200 μL de tampon B3 au lysat et vortexer vigoureusement. Le tampon B3 et l’éthanol (voir étape 4) peuvent être mélangés au préalable avant d’être ajoutés au lysat. Fixation de l’ADN aux... Ajouter 210 μL d’éthanol au lysat et vortexer vigoureusement. Passez à l’étape 5 du protocole standard (voir paragraphe5). MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 15 NucleoSpin® Tissue 6.2 Protocole additionnel pour les bactéries Avant de débuter la procédure : Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • 1 Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. Préparer l’échantillon Jusqu’à 1 mL de culture bactérienne peut être utilisé pour la préparation en fonction, par exemple, de la densité de la culture, du milieu de culture et de la souche bactérienne. Centrifuger jusqu’à 1 mL de culture pendant 5 min à 8 000 x g. Retirer le surnageant. 2 Pré-lyse de l’échantillon Remettre en suspension le culot dans 180 μL de tampon T1 par pipetages successifs. Ajouter 25 μL de protéinase K. Vortexer vigoureusement et incuber à 56 °C jusqu’à lyse complète (au moins 1 à 3 h). Vortexer de temps en temps pendant l’incubation ou utiliser un incubateur à agitation. Les échantillons peuvent également être incubés pendant la nuit. Si l’ADN sans ARN est crucial pour les applications en aval, une digestion RNase peut être effectuée : ajouter 20 μL de solution de RNase A (20 mg / mL) (non inclus ; voir les informations de commande) et incuber pendant 5 min supplémentaires à température ambiante. Bactéries difficiles à lyser : certaines souches, en particulier les bactéries Grampositives, sont plus difficiles à lyser. Dans ce cas, une préincubation avec une enzyme lytique est nécessaire : remettre en suspension les cellules en culot dans 20 mM Tris/HCl ; 2 mM EDTA ; 1 % Triton X-100 ; pH 8 (au lieu du tampon T1) additionné d’une concentration finale de 20 mg/mL de lysozyme ou de 0,2 mg/mL de lysostaphine et incuber pendant 30 à 60 min à 37 °C. Ajouter 25 μL de protéinase K, incuber à 56 °C jusqu’à obtention d’une lyse complète. Passer à l’étape 3 du protocole standard (voir le paragraphe 5). 16 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 NucleoSpin® Tissue 6.3 Protocole additionnel pour la levure Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Vérifier que du tampon sorbitol et de la lyse ou de la zymolase (non fournis avec le kit) sont disponibles pour la prélyse des échantillons. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 30 °C et 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Récolter 3 mL de culture de levure YPD (OD600 ≤ 10) par centrifugation pendant 10 min à 5 000 x g. Laver les cellules une fois avec 1 mL d’EDTA 10 mM, pH 8. Retirer le surnageant et culotter les cellules par centrifugation (5 000 x g, 10 min). 2 Pré-lyse de l’échantillon Remettre le culot en suspension dans 600 μL de tampon sorbitol (1,2 M de sorbitol ; 10 M de CaCl2 ; 0,1 M de Tris/HCl pH 7,5 ; 35 M de ß-mercaptoéthanol). Ajouter 50 U de lyticase ou de zymolase*. Incuber à 30 °C pendant 30 min. Cette étape permet de dégrader la paroi cellulaire de la levure et de créer des sphéroplastes. La formation des sphéroplastes peut être vérifiée au microscope. Centrifuger le mélange pendant 10 min à 2 000 x g, éliminer le surnageant et remettre en suspension les sphéroplastes en culot dans 180 μL de tampon T1. Ajouter 25 μL de solution de protéinase K et vortexer vigoureusement. Incuber à 56 °C jusqu’à obtention d’une lyse complète (au moins 1 à 3 h). Vortexer de temps en temps pendant l’incubation ou utiliser un bain-marie à agitation. Les échantillons peuvent également être incubés pendant la nuit. Si l’ADN sans ARN est crucial pour les applications en aval, une digestion RNase peut être effectuée : Ajouter 20 μL de solution de RNase A (20 mg / mL) (non inclus ; voir les informations de commande) et incuber pendant 5 min supplémentaires à température ambiante. Passer à l’étape 3 du protocole standard (voir le paragraphe 5). MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 17 NucleoSpin® Tissue 6.4 Protocole additionnel pour les taches de sang séché (p.e. NucleoCard®s, FTA® cards, Guthrie cards) Avant de débuter la procédure : • Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Découper une ou deux taches de sang séché aussi précisément que possible. Couper les taches en petits morceaux et les placer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni). La surface des taches de sang séché doit être comprise entre 15 et 30 mm². 2 Pré-lyse de l’échantillon Ajouter 180 μL de tampon T1 et mélanger en vortexant. Placer les échantillons dans un bain-marie ou un bloc chauffant et chauffer pendant 10 min à 94 °C. Laisser l’échantillon refroidir. Ajouter 25 μL de solution de protéinase K. Centrifuger brièvement les échantillons, vortexer et incuber à 56 °C pendant 1 h. Vortexer de temps en temps pendant l’incubation ou utiliser un bain-marie d’agitation. Veiller à ce que les échantillons soient complètement recouverts de tampon de lyse pendant l’incubation. 3 Lyse de l’échantillon Ajouter 200 μL de tampon B3, mélanger vigoureusement au vortex et incuber à 56 °C pendant 10 min. Passer à l’étape 4 du protocole standard (voir paragraphe 5). * Other protocols use 5 – 200 U lyticase or zymolase depending on enzyme quality or brand. Increasing the enzyme concentration may be required if spheroplasts are not formed. 18 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 NucleoSpin® Tissue 6.5 Protocole additionnel pour l’ADN génomique et l’ADN viral à partir d’échantillons de sang Avant de débuter la procédure : • 1 Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. Préparer l’échantillon Pas nécessaire 2 Pré-lyse de l’échantillon Pas nécessaire 3 Lyse de l’échantillon de sang Pipeter 25 μL de protéinase K et jusqu’à 200 μL de sang, de couche leucoplaquettaire ou d’échantillon de fluide corporel (équilibré à température ambiante) dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (non fournis). Pour les volumes d’échantillons inférieurs à 200 μL, ajouter du PBS pour ajuster le volume à 200 μL. Si vous purifiez des virus ADN, nous vous recommandons de commencer avec 200 μL de sérum ou de plasma. Si des cellules en culture sont utilisées, remettre en suspension jusqu’à 5 × 106 cellules dans un volume final de 200 μL de PBS. Ajouter 200 μL de tampon B3 aux échantillons et vortexer vigoureusement le mélange (10 – 20 s). Incuber les échantillons à température ambiante pendant 5 min. Mélanger. Incuber les échantillons à 70 °C pendant 10 à 15 min. Le lysat doit devenir brunâtre pendant l’incubation avec le tampon B3. Augmenter le temps d’incubation avec la protéinase K (jusqu’à 30 min) et vortexer une ou deux fois vigoureusement pendant l’incubation en cas de procédure sur des échantillons de sang plus anciens ou coagulés. 4 Ajustement des conditions de fixation de l’ADN Ajouter 210 μL d’éthanol (96 – 100 %) à chaque échantillon et vortexer à nouveau. 5 Fixation de l’ADN Pour chaque préparation, prendre une colonne NucleoSpin® Tissue placée dans un tube collecteur et charger l’échantillon. Centrifuger 1 min à 11 000 x g. Si les échantillons ne traversent pas complètement la matrice, répéter la centrifugation à une force g plus élevée (< 15 000 x g). Jeter le tube collecteur avec le filtrat et placer la colonne dans un nouveau tube collecteur (fourni). Procéder à l’étape 6 (Lavage de la membrane de silice) du protocole standard (voir paragraphe 5). MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 19 NucleoSpin® Tissue 6.6 Protocole additionnel pour les racines des cheveux Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Coupez les racines des cheveux de l’échantillon de cheveux (jusqu’à 100) et collectez-les dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL (non fourni). 2 Pré-lyse de l’échantillon Ajouter 180 μL de tampon T1 aux racines des cheveux et congeler les échantillons dans l’azote liquide. Décongeler les échantillons dans un bain-marie à 56 °C. Répétez cette procédure 4 fois. Ajouter 25 μL de solution de protéinase K, mélanger en vortexant et incuber 6 – 8 h ou une nuit à 56 °C. Utiliser un bain-marie à agitation ou vortexer de temps en temps. Passer à l’étape 3 du protocole standard (voir le paragraphe 5). 20 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 NucleoSpin® Tissue 6.7 Protocole additionnel pour les tissus inclus en paraffine Avant de débuter la procédure : Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. Vérifier si du xylène ou du n-octane est disponible. Mettre un incubateur ou un bain-marie à 37 °C et 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Préparer de petites sections (jusqu’à 25 mg) à partir de blocs de tissus fixés et inclus. Si possible, enlever l’excès de paraffine du bloc avant de le découper. Manipuler les sections avec des pinces ou des cure-dents et placer les échantillons dans des tubes de microcentrifugation. Ajouter 1 mL de n-octane ou de xylène dans chaque tube. Vortexer vigoureusement et incuber à température ambiante pendant environ 30 min. Vortexer de temps en temps. Centrifuger à 11 000 x g pendant 3 min. Prélever le surnageant à la pipette. Ajouter 1 mL d’éthanol (96 – 100 %) dans chaque tube. Fermer et mélanger en inversant plusieurs fois. Centrifuger à 11 000 x g pendant 3 min. Prélever le surnageant à la pipette. Répéter l’étape de lavage à l’éthanol. Prélever à la pipette la plus grande quantité possible d’éthanol. Incuber le tube ouvert à 37 °C jusqu’à évaporation de l’éthanol (~ 15 min). Passer à l’étape 2 du protocole standard (voir paragraphe 5). MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 21 NucleoSpin® Tissue 6.8 Protocole additionnel pour l’ADN génomique provenant des fèces Avant de débuter la procédure : • Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Vérifier si le tampon TE est disponible. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Ajouter 250 mg de matières fécales à 1 mL de tampon TE (10 mM Tris / Cl ; 1 mM EDTA, pH 8). Remettre l’échantillon en suspension par vortex vigoureux (30 s). Centrifuger l’échantillon pendant 15 min à 4 000 x g. Jeter le surnageant. Remettre le culot en suspension dans 0,2 à 1 mL de tampon T1. Utiliser autant de tampon que nécessaire pour une bonne resuspension de l’échantillon. Le culot préparé contient, entre autres constituants, des cellules du tube digestif et des bactéries. Transférer 200 μL de l’échantillon remis en suspension dans un nouveau tube de microcentrifugation. Procéder à l’ajout de 25 μL de protéinase K à l’étape 2 du protocole standard (voir paragraphe 5). Les cellules humaines, les cellules bactériennes et les cellules d’agents pathogènes présentes dans les fèces se lysent au cours de l’étape d’incubation à 56 °C avec la protéinase K avec une efficacité différente. Pour la détection de cellules difficiles à lyser (p.e., certaines bactéries et certains parasites), il peut être bénéfique d’effectuer une incubation supplémentaire à une température plus élevée (jusqu’à 95 °C ; 5 – 10 min). Le rendement en ADN sera souvent plus élevé avec une telle étape d’incubation supplémentaire à haute température. Il convient toutefois de noter que le rapport entre l’ADN humain et l’ADN non humain changera généralement en raison de la libération accrue d’ADN bactérien/pathogène. 22 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 NucleoSpin® Tissue 6.9 Protocole additionnel pour la recherche d’ADN viral (p.e. CMV) dans les fèces Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Préparer du NaCl à 0,9 %. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Suspendre l’échantillon de fèces dans du NaCl à 0,9 % (environ 0,5 g dans 4 mL au maximum). Centrifuger des aliquotes de l’échantillon de selles pendant 5 min à 800 x g à TA (par exemple, 4 mL : 4 × 1 mL dans un tube de microtubes de 1,5 mL). Réunir soigneusement le surnageant (ne pas toucher le culot). Filtrer le surnageant à travers un filtre stérile de 0,22 – 0,45 μm. Fractionner le filtrat et centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g. 2 Pré-lyse de l’échantillon Retirer soigneusement le surnageant par décantation. Ajouter 400 μL de tampon T1 et 35 μL de protéinase K et mélanger en vortexant. 3 Lyse de l’échantillon Ajouter 400 μL de tampon B3 et mélanger en vortexant. Incuber pendant au moins 30 min à 70 °C. 4 Ajustement des conditions de fixation de l’ADN Ajouter 420 μL d’éthanol (96 – 100 %) et mélanger en vortexant. 5 Fixation de l’ADN Pour chaque échantillon, placer une NucleoSpin® Tissue dans un tube collecteur. Charger successivement les colonnes NucleoSpin® Tissue. Centrifuger pendant 1 min à 4 500 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. Si l’échantillon n’est pas aspiré complètement à travers la matrice, répéter l’étape de centrifugation à 11 000 x g. Jeter le filtrat. MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 23 NucleoSpin® Tissue 6 Lavage de la membrane de silice 1er lavage Ajouter 600 μL de tampon BW. Centrifuger pendant 1 min à 4 500 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 2ème lavage Ajouter 600 μL de tampon B5 à la colonne et centrifuger pendant 1 min à 4 500 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 3ème lavage Ajouter 600 μL de tampon B5 à la colonne et centrifuger pendant 2 min à 11 000 x g. Jeter le filtrat. 7 Séchage de la membrane de silice Placer la NucleoSpin® Tissue dans un nouveau tube collecteur et incuber à couvercle ouvert pendant 1 à 2 min à 70 °C. L’éthanol résiduel est éliminé au cours de cette étape. 8 Élution d’ADN très pur Placer la colonne NucleoSpin® Tissue dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni) et ajouter 100 μL de tampon BE. Incuber avec le couvercle fermé pendant 3 – 5 min. Centrifuger pendant 1 min à 4 500 x g. Pour d’autres procédures d’élution, voir le chapitre 3. Utiliser 10 μL d’extrait d’ADN pour un mélange de réaction PCR de 20 μL. Ajouter le mélange de contrôle d’inhibition (10 μL d’extrait d’ADN avec de l’ADN humain) et amplifier avec par exemple actine- / ß-globine- / ou autre amorce spécifique à l’homme. 24 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 NucleoSpin® Tissue 6.10 Protocole additionnel pour la détection de Mycobacterium tuberculosis ou de Legionella pneumophila dans les expectorations ou les lavages broncho-alvéolaires Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. • Préparer N-acétyl cystéine / NaOH (2 g de NaOH ; 1,45 g de citrate de sodium ; 0,5 g de N-acétyl cystéine. Ajouter de l’eau à 100 mL). 1 Préparer l’échantillon Ajouter 200 – 500 μL d’expectoration ou de lavage bronchoalvéolaire à un volume égal de N-acétylcystéine / NaOH. Vortexer doucement pour mélanger. Incuber le mélange pendant 25 min à température ambiante avec agitation. Ajuster le volume à 25 mL avec de l’eau stérile. Centrifuger pendant 30 min à 4 000 x g. Jeter le surnageant. Remettre le culot en suspension dans 0,5 – 1 mL de tampon T1 (en fonction de la viscosité de l’échantillon). Transférer 200 μL de l’échantillon remis en suspension dans un nouveau tube de microcentrifugation (non fourni). Procéder à l’étape 2 du protocole standard, voir paragraphe 5 (ajout de la protéinase K et incubation). MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 25 NucleoSpin® Tissue 6.11 Protocole additionnel pour la détection des bactéries EHEC dans les aliments (p.e. lait de vache frais) Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Préparer le mTSB et l’acétate de sodium 3,2 M. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Dans un bouteille stérile de 1 litre, ajouter 25 mL de lait et 225 mL de milieu mTSB préchauffé (37 °C) (fourni avec Novobiocin). Incuber le mélange dans un bain-marie à agitation pendant 5 – 6 h ou toute une nuit à 37 °C. Préparation du milieu mTSB : 30 g de Tryptic Soy Broth (Gibco), 1,5 g de sels biliaires n° 3 (Oxoid), 1,5 g de KH2PO4. Ajouter 900 mL de H2O. Filtrer le milieu et ajuster le pH à 7,4 avec 2 M NaOH. Ajouter de l’eau jusqu’à 1 litre et autoclaver pendant 15 min à 121 °C. Centrifuger 100 mL de culture pendant 40 min à 6 000 x g. Verser doucement le surnageant et remettre le culot en suspension dans 2 mL d’eau stérile. Centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g. 2 Pré-lyse de l’échantillon Remettre le culot en suspension dans 180 μL de tampon T1 et ajouter 25 μL de solution de protéinase K. Suivre le protocole standard, en commençant par l’étape 3 (voir paragraphe 5). Après élution de l’ADN, procéder à l’étape suivante. Précipiter l’ADN en ajoutant 20 μL d’acétate de sodium 3,2 M et 400 μL d’éthanol à 200 μL d’éluat. Centrifuger pendant 30 min à 11 000 x g. Jeter le surnageant et laver le culot avec 1 mL d’éthanol à 70 % et le remettre en suspension dans 10 μL d’eau stérile. 26 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 NucleoSpin® Tissue 6.12 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN bactérien (p.e. Chlamydia trachomatis) à partir de cultures, de liquides biologiques ou d’échantillons cliniques. Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Extraction de l’ADN bactérien à partir de cultures bactériennes ou de liquides biologiques : culotter les bactéries par centrifugation pendant 5 min à 13 000 xg et procéder à l’étape 2 du protocole standard, voir paragraphe 5. Extraction d’ADN bactérien à partir d’écouvillons oculaires, nasaux ou pharyngés : prélever les échantillons, ajouter 2 mL de PBS contenant un fongicide courant et incuber pendant plusieurs heures à température ambiante. Culotter les bactéries par centrifugation pendant 5 min à 13 000 x g. Jeter le surnageant. Passer à l’étape 2 du protocole standard (voir paragraphe 5). MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 27 NucleoSpin® Tissue 6.13 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN bactérien (p.e. Borrelia burgdorferi) à partir de l’urine Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Centrifuger 1 mL d’échantillon d’urine à 13 000 x g pendant 30 min. Jeter le surnageant, ajouter à nouveau 1 mL d’échantillon d’urine au culot et centrifuger à 13 000 x g pendant 30 min. Cette étape peut être répétée jusqu’à trois fois. L’échantillon doit être frais. Un stockage à une température comprise entre - 20 °C et - 80 °C n’est recommandé que pour quelques jours. Après décongélation, incuber l’échantillon à 40 °C jusqu’à ce que tous les précipités soient dissous. L’urine a tendance à former des précipités lorsqu’elle est conservée à basse température. Passer à l’étape 2 du protocole standard (voir paragraphe 5). 6.14 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN viral (p.e. CMV) à partir de l’urine Avant de débuter la procédure : • Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 70 °C. 1 Préparer l’échantillon Centrifuger des aliquotes de l’échantillon d’urine pendant 10 min à pleine vitesse (p.e., 4 mL : 4 × 1 mL dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL). Décanter soigneusement le surnageant. Si des échantillons d’urine congelés sont utilisés, des précipités peuvent apparaître après la décongélation, qui doivent être dissous avant l’étape de centrifugation. Ceci peut être fait par une étape d’incubation de 30 min à 37 – 40 °C. Si une solution complète n’est pas obtenue, laisser le précipité sédimenter et passer à l’étape 1 du protocole additionnel en utilisant uniquement le surnageant. 28 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 NucleoSpin® Tissue 2 Pré-lyse de l’échantillon Remettre le culot en suspension dans 180 μL de tampon T1 et 25 μL de protéinase K. Remettre en suspension le premier culot dans 180 μL de tampon T1 et 25 μL de protéinase K. Transférer la solution remise en suspension du premier tube dans le deuxième tube et la solution remise en suspension du deuxième tube dans le troisième tube et ainsi de suite. Enfin, passer à l’étape 3. 3 Lyse de l’échantillon Ajouter 200 μL de tampon B3, vortexer et incuber au moins pendant 20 min à 70 °C. 4 Ajustement des conditions de fixation de l’ADN Ajouter 210 μL d’éthanol (96 – 100 %) à l’échantillon et vortexer vigoureusement. 5 Fixation de l’ADN Pour chaque échantillon, placer une colonne NucleoSpin® Tissue dans un tube collecteur. Appliquer l’échantillon sur la colonne. Centrifuger pendant 1 min à 4 500 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 6 Lavage de la membrane de silice 1er lavage Ajouter 500 μL de tampon BW. Centrifuger pendant 1 min à 4 500 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 2ème lavage Ajouter 600 μL de tampon B5 à la colonne et centrifuger pendant 2 min à 11 000 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 7 Séchage de la membrane de silice Incuber à couvercle ouvert pendant 1 à 2 min à 70 °C. L’éthanol résiduel est éliminé au cours de cette étape. 8 Élution d’ADN très pur Ajouter 70 μL de tampon BE, fermer le couvercle et incuber pendant 3 à 5 min supplémentaires. Centrifuger pendant 1 min à 4 500 x g. MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 29 NucleoSpin® Tissue 6.15 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN génomique des insectes Avant de débuter la procédure : • Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Homogénéiser au maximum 50 mg d’insectes sous azote liquide et transférer la poudre dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni). Procéder à l’étape 2 du protocole standard (voir paragraphe 5) en ajoutant la protéinase K. 30 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 NucleoSpin® Tissue 6.16 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN génomique à partir d’écouvillons dentaires Avant de débuter la procédure : • Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Placer les écouvillons (papier, coton, brosses, plastique) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni). 2 Pré-lyse de l’échantillon Ajouter 180 μL de tampon T1 et 25 μL de protéinase K à chaque échantillon. Fermer le tube de microcentrifugation et centrifuger brièvement pendant 15 s à 1 500 x g afin de submerger complètement le matériau de l’écouvillon. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Vortexer vigoureusement le tube pendant 15 s et centrifuger brièvement pendant 15 s à 1 500 x g. Incuber les tubes à 70 °C dans un incubateur pendant 10 min. Placer un poids sur le tube afin d’éviter que les bouchons ne s’ouvre. Passer à 95 °C pendant 5 min. Centrifuger brièvement pendant 15 s à 1 500 x g pour recueillir tout échantillon sur les couvercles. Ouvrir les tubes de microcentrifugation. Supprimer l’étape d’incubation à 95 °C, en fonction de la souche bactérienne à détecter. 2a Séparer la solution de lyse des écouvillons dentaires Alternative A : Transférer l’écouvillon dans un NucleoSpin® Forensic Filter (non fourni ; voir informations de commande). Couper la tige de l’écouvillon. Centrifuger le NucleoSpin® Forensic Filter pendant 1 min à 11 000 x g. Jeter le NucleoSpin® Forensic Filters. Continuer avec le filtrat. Alternative B : Placer un NucleoSpin® Filter(non fourni ; voir les informations de commande) dans un tube collecteur (2 mL). Transférer l’écouvillon (couper la tige de l’écouvillon) et la solution restante sur le NucleoSpin® Filter. Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g. Jeter le NucleoSpin® Filter. Continuer avec le filtrat. Alternative C : Transférer autant que possible la solution de lysat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni). Jeter l’écouvillon et continuer avec la solution récupérée. Passer à l’étape 3 du protocole standard (voir le paragraphe 5). MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 31 NucleoSpin® Tissue 6.17 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN génomique à partir d’écouvillons buccaux Avant de débuter la procédure : • Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Vérifier si le PBS est disponible. • Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C. 1 Préparer l’échantillon Prélever les échantillons avec des écouvillons en coton, en dacron® (Daigger) ou en C.E.P. (Gibco BRL). Gratter fermement l’intérieur de chaque joue à plusieurs reprises et laisser les écouvillons sécher à l’air. La personne concernée ne doit pas avoir consommé de nourriture ou de boisson dans les 30 min précédant le prélèvement de l’échantillon. 2 Pré-lyse de l’échantillon Placer le matériau sec des écouvillons dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL (non fournis). Ajouter 400 – 600 μL de PBS et 25 μL de solution de protéinase K aux écouvillons. Le volume de PBS dépend du type d’écouvillon utilisé : pour les écouvillons en coton et en dacron, 400 μL suffisent ; pour les écouvillons en C.E.P., 600 μL sont nécessaires. Mélanger en vortexant 2 × 5 s et incuber 10 min à 56 °C. 32 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 NucleoSpin® Tissue 2a Séparer la solution de lyse des écouvillons buccaux Alternative A : Transférer l’écouvillon dans un NucleoSpin® Forensic Filter (non fourni ; voir informations de commande). Couper la tige de l’écouvillon. Centrifuger le NucleoSpin® Forensic Filter pendant 1 min à 11 000 x g. Jeter le NucleoSpin® Forensic Filters. Continuer avec le filtrat. Alternative B : Placer un NucleoSpin® Filter (non fourni ; voir les informations de commande) dans un tube collecteur (2 mL). Transférer l’écouvillon (couper la tige de l’écouvillon) et la solution restante sur le NucleoSpin® Filter. Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g. Jeter le NucleoSpin® Filtre. Continuer avec le filtrat. Alternative C : Transférer autant que possible la solution de lysat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni). Jeter l’écouvillon et continuer avec la solution récupérée. 3 Lyse de l’échantillon Ajouter un volume de tampon B3 (400 ou 600 μL ; selon le type d’écouvillon / le volume de tampon PBS utilisé) et vortexer vigoureusement. Incuber les échantillons à 70 °C pendant 10 min. Note : En fonction du nombre de préparations, du tampon B3 supplémentaire peut être nécessaire (voir informations de commande). 4 Ajustement des conditions de fixation de l’ADN Ajouter un volume d’éthanol à 96 – 100 % (400 ou 600 μL, selon le type d’écouvillon) à chaque échantillon et mélanger en vortexant. 5 Fixation de l’ADN Transférer 600 μL des échantillons des tubes de microcentrifugation de 2 mL dans les colonnes NucleoSpin® Tissue. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 min. Si les échantillons ne sont pas passés complètement, répéter la centrifugation. Jeter le filtrat. Remettre les colonnes dans les tubes collecteurs et répéter l’étape 5 une ou deux fois, selon le volume de lyse. Lorsque tout le lysat a été appliqué sur les colonnes, jeter le tube collecteur et placer la colonne dans un nouveau tube collecteur. Passer à l’étape 6 du protocole standard (paragraphe 5). MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 33 NucleoSpin® Tissue 6.18 Protocole additionnel pour la purification d’ADN génomique à partir du sperme Avant de débuter la procédure : • Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Le tampon d’élution BE peut être préchauffé à 70 °C avant l’élution. 1 Préparer 200 mL de tampon GuEX (2 mL de solution stérile de chlorhydrate de guanidine 5 M, 2.1 mL de solution Tris-Cl 1 M (pH 8), 1.05 mL de solution NaCl 2 M, 4.2 mL de solution EDTA 0.5 M, 0.2 mL de solution NaOH 1 M, ajouter de l’eau pour obtenir un volume de 200 mL, le pH doit être compris entre 8 et 8.5). 2 Transférer 20 µL à 60 µL d’échantillon dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Ajouter 950 µL de tampon GuEX et 50 µL de protéinase K. Incuber le mélange pendant 15 minutes au maximum à 37 °C. Centrifuger le mélange pendant 5 minutes à 12 000 × g à température ambiante. Le culot contient les spermatozoïdes (échantillon A) tandis que l’ADN libre des cellules épithéliales et des leucocytes (échantillon B) se trouve dans le surnageant. 3 Le surnageant (échantillon B) est prélevé avec précaution et transféré dans un nouveau tube et traité séparément (étape 6). 4 Ajouter 700 µL de tampon GuEX au culot (échantillon A), centrifuger pendant 5 minutes à 12 000 × g et jeter le surnageant. Répéter cette étape de lavage 2 à 3 fois. 5 Le culot (échantillon A) est remis en suspension dans un minimum de 300 µL de tampon T1. 6 Échantillon A : Ajouter 25 µL de solution mère de protéinase K, mélanger en vortexant et incuber de 60 °C à 65 °C pendant une nuit. Échantillon B : ajouter 10 µL de solution mère de protéinase K, mélanger en vortexant et incuber entre 60 °C et 65 °C pendant une nuit. 7 34 Centrifuger les échantillons pendant 5 minutes à 12 000 × g à température ambiante pour éliminer tout matériel cellulaire insoluble. Procéder avec le surnageant clarifié. MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 NucleoSpin® Tissue 8 Échantillon A : Ajouter 300 µL de tampon et 300 µL d’isopropanol au surnageant clarifié et appliquer l’échantillon successivement sur la colonne NucleoSpin® Tissue. Centrifuger 1 minute à 6 000 × g (TA). Si l’échantillon n’est pas complètement aspiré à travers la matrice, répéter l’étape de centrifugation. Échantillon B : ajouter 400 µL d’isopropanol au surnageant clarifié et appliquer l’échantillon successivement sur la colonne NucleoSpin® Tissue. Centrifuger 1 minute à 6 000 × g (TA). Si l’échantillon n’est pas complètement aspiré à travers la matrice, répéter l’étape de centrifugation. 9 Ajouter 500 µL de tampon B5 à la colonne de centrifugation et centrifuger 1 minute à 6 000 × g à température ambiante. Jeter le filtrat et répéter cette étape de lavage. 10 Après les deux étapes de lavage avec le tampon B5, jeter le filtrat, placer à nouveau la colonne NucleoSpin® Tissue dans la centrifugeuse et centrifuger 2 minutes à 6 000 × g à température ambiante pour éliminer complètement le tampon B5. 11 Placer la colonne NucleoSpin® Tissue dans un tube à centrifuger propre de 1,5 mL et éluer l’ADN avec 100 µL à 200 µL de tampon BE préchauffé. Après deux minutes d’incubation, centrifuger pendant 1 minute à 6 000 × g à température ambiante. MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 35 NucleoSpin® Tissue 6.19 Protocole additionnel pour la purification d’ADN génomique des cyanobactéries Avant de débuter la procédure : • Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Le tampon d’élution BE peut être préchauffé à 70 °C avant l’élution. 1 Préparer la quantité requise de tampon EX, contenant 50 mM de Tris HCl (pH 8), 50 mM d’EDTA, complété par 1 % (v/v) de Triton X-100, 20 mg/mL de lysozyme et 12 mg/mL de RNase. 2 Centrifuger un volume approprié de culture à pleine vitesse pendant 5 minutes. La teneur finale en chlorophylle A du culot doit être comprise entre 30 µg et 40 µg. 3 Remettre soigneusement en suspension le culot dans 170 µL de tampon EX en pipetant de haut en bas. Incuber pendant 30 à 60 minutes à 37 °C en mélangeant doucement. Note : Le lysat devient clarifié à ce stade. Ajouter 25 µL de protéinase K (22 mg/ml) et poursuivre l’incubation à 56 °C pendant 60 minutes. Inverser les échantillons plusieurs fois pour les mélanger pendant l’incubation. Passer à l’étape 3 du protocole standard. 36 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 NucleoSpin® Tissue 6.20 Utilisation du NucleoSpin® Tissue pour la purification d’ADN de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (MRSA) Avant de débuter la procédure : • Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3. • Le tampon d’élution BE peut être préchauffé à 70 °C avant l’élution. 1 Vortexer vigoureusement les écouvillons dans le milieu de Stuart pendant 1 minute pour libérer toutes les cellules bactériennes. Retirer l’écouvillon et centrifuger l’échantillon pendant 5 minutes à 8 000 × g. Retirer et jeter le surnageant. 2 Remettre en suspension le culot dans 160 µL d’EDTA 50 mM (pH 8) par pipetages successifs. Pour une lyse efficace, ajouter 20 µL de 10 mg/ml de lysozyme et 20 µL de 10 mg/ml de lysostaphine. Vortexer vigoureusement et incuber pendant 40 à 60 minutes à 37 °C. Vortexer de temps en temps. 3 200 µL de tampon B3, vortexer vigoureusement et incuber à 70 °C pendant 10 minutes. Vortexer brièvement. Passer à l’étape 4 du protocole standard. MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 37 ADN génomique des tissus 7 Références concernant les protocoles additionnels Protocoles additionels Références Queues de souris et de rats • Colvin, S. et al., 341 repeats is not enough for methylation in a new fragile X mouse model. eNeuro 2022, 9 (5), ENEURO.0142 – 22.2022. https ://doi.org/10.1523/eneuro.0142 – 22.2022. • Mimouni, N. E. H. et al., Fertilization, but not postimplantation development, can occur in the absence of sperm and oocyte Beta1 integrin in mice. International Journal of Molecular Sciences 2022, 23 (22), 13812. https ://doi.org/10.3390/ijms232213812. • Garcia-Fernandez, A. et al., Producing Escherichia coli Sequence Type 167 High-Risk Clone. mSphere 2020, 5 (2). https ://doi.org/10.1128/msphere.00269 – 20. • Kempf, F et al., Genome Sequences of Two Bovine MastitisCausing Escherichia coli Strains. Genome Announcements 2015, 3 (2). https ://doi.org/10.1128/genomea.00259 – 15. • Dzanaeva, L. S. et al., Riboflavin overproduction on lignocellulose hydrolysate by the engineered yeast Candida famata. FEMS Yeast Research 2024. https ://doi.org/10.1093/femsyr/foae020. • Dmytruk, K. V. et al., Efficient production of bacterial antibiotics aminoriboflavin and roseoflavin in eukaryotic microorganisms, yeasts. Microbial Cell Factories 2023, 22 (1). https ://doi.org/10.1186/s12934‑023‑02129 – 8. • Glapa-Nowak, A. et al., Leukocyte Telomere Length Is Not Reduced in Children and Adults with Cystic Fibrosis but Associates with Clinical Characteristics—A Cross-Sectional Study. Journal of Clinical Medicine 2021, 10 (4), 590. https ://doi.org/10.3390/jcm10040590. • Tadesse, H. et al., Epidemiological Survey on Tick-Borne Pathogens with Zoonotic Potential in Dog Populations of Southern Ethiopia. Tropical Medicine and Infectious Disease 2023, 8 (2), 102. https ://doi.org/10.3390/tropicalmed8020102. Bactéries Levure Tâches de sang séché 38 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 ADN génomique des tissus Protocoles additionels Références ADN génomique et ARN viral d’échantillon de sang • Godler, D. E. et al., Detection of skewed X-chromosome inactivation in Fragile X syndrome and X chromosome aneuploidy using quantitative melt analysis. Expert Reviews in Molecular Medicine 2015, 17. https ://doi.org/10.1017/erm.2015.11. • Costantini, D. et al., Physiological costs of infection : herpesvirus replication is linked to blood oxidative stress in equids. Scientific Reports 2018, 8 (1). https ://doi.org/10.1038/s41598‑018‑28688 – 0. • Lippold, S. et al., Whole mitochondrial genome sequencing of domestic horses reveals incorporation of extensive wild horse diversity during domestication. BMC Evolutionary Biology 2011, 11 (1), 328. https ://doi.org/10.1186/1471‑2148‑11 – 328. • Van Den Hoven, R. et al., Putative regulation mechanism for the MSTN gene by a CpG island generated by the SINE marker Ins227bp. BMC Veterinary Research 2015, 11 (1). https ://doi.org/10.1186/s12917‑015‑0428 – 3. • Campo, I. et al., A large kindred of pulmonary fibrosis associated with a novel ABCA3 gene variant. Respiratory Research 2014, 15 (1). https ://doi.org/10.1186/1465‑9921‑15 – 43. • Grbavac, L. et al., Comprehensive Diagnosis, Treatment, and Outcome of Taenia crassiceps Cysticercosis in a RingTailed Lemur (Lemur catta) from a Croatian Zoo : No Longer Unusual? Pathogens 2024, 13 (4), 283. https ://doi.org/10.3390/pathogens13040283. • Fernández-Soto, P. et al., A Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Early Detection of Schistosoma mansoni in Stool Samples : A Diagnostic Approach in a Murine Model. PLoS Neglected Tropical Diseases 2014, 8 (9), e3126. https ://doi.org/10.1371/journal.pntd.0003126. • Fernández-Soto, P. et al., A. Strong-LAMP : A LAMP Assay for Strongyloides spp. Detection in Stool and Urine Samples. Towards the Diagnosis of Human Strongyloidiasis Starting from a Rodent Model. PLoS Neglected Tropical Diseases 2016, 10 (7), e0004836. https ://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004836. Racines des cheveux Tissu inclus en paraffine ADN génomique des fèces MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 39 ADN génomique des tissus Protocoles additionels Références ADN Viral (ex., CMV) dans les fécès • Balboni, A. et al., Canine circovirus and Canine adenovirus type 1 and 2 in dogs with parvoviral enteritis. Veterinary Research Communications 2021, 46 (1), 223 – 232. https ://doi.org/10.1007/s11259‑021‑09850-y. Détection de Mycobacterium tuberculosis ou de Legionella pneumophila dans les expectorations ou le lavage broncho-alvéolaire • Doughty, E. L. et al., Culture-independent detection and characterisation of Mycobacterium tuberculosisand & M. africanumin sputum samples using shotgun metagenomics on a benchtop sequencer. PeerJ 2014, 2, e585. https ://doi.org/10.7717/peerj.585. Détection des bactéries EHEC dans les aliments • Galia, W. et al., Strand-specific transcriptomes of Enterohemorrhagic Escherichia coli in response to interactions with ground beef microbiota : interactions between microorganisms in raw meat. BMC Genomics 2017, 18 (1). https ://doi.org/10.1186/s12864‑017‑3957 – 2. Purification de l’ADN bactérien • Jalkh, A. P. et al., Chlamydia trachomatis in human immunodeficiency virus-infected men treated at a referral hospital for sexually transmitted diseases in the Amazonas, Brazil. The Brazilian Journal of Infectious Diseases 2013, 18 (2), 158 – 163. https ://doi.org/10.1016/j.bjid.2013.06.007. Purification de l’ADN bactérien (p.e. Borrelia burgdorferi) à partir de l’urine • Mazlina, M. et al., Pathological changes and bacteriological assessments in the urinary tract of pregnant goats experimentally infected with Brucella melitensis. BMC Veterinary Research 2018, 14 (1). https ://doi.org/10.1186/s12917‑018‑1533-x. Purification de l’ADN viral (p.e. CMV) à partir de l’urine • Balboni, A. et al., Integrated Use of Molecular Techniques to Detect and Genetically Characterise DNA Viruses in Italian Wolves (Canis lupus italicus). Animals 2021, 11 (8), 2198. https ://doi.org/10.3390/ani11082198. 40 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 Protocoles additionels Références Purification de l’ADN génomique d’insectes • Pittermannová, P. et al., Wild Small Mammals and Ticks in Zoos—Reservoir of Agents with Zoonotic Potential? Pathogens 2021, 10 (6), 777. https ://doi.org/10.3390/pathogens10060777. • Kranzfelder, P. et al., Trace DNA from insect skins : a comparison of five extraction protocols and direct PCR on chironomid pupal exuviae. Molecular Ecology Resources 2015, 16 (1), 353 – 363. https ://doi.org/10.1111/1755 – 0998.12446. Purification de • l’ADN génomique à partir d’écouvillons dentaires Frerejacques, M. et al., Human Skin Bacterial Community Response to Probiotic (Lactobacillus reuteri DSM 17938) Introduction. Microorganisms 2020, 8 (8), 1223. https ://doi.org/10.3390/microorganisms8081223. Purification de • l’ADN génomique à partir d’écouvillons buccaux Eipel, M. et al., Epigenetic age predictions based on buccal swabs are more precise in combination with cell typespecific DNA methylation signatures. Aging 2016, 8 (5), 1034 – 1048. https ://doi.org/10.18632/aging.100972. Purification de • l’ADN génomique à partir du sperme Bongiorni, S. et al., Identification of a short region on chromosome 6 affecting direct calving ease in piedmontese cattle breed. PLoS ONE 2012, 7 (12), e50137. https ://doi.org/10.1371/journal.pone.0050137. Purification de l’ADN génomique de cyanobactéries • Capra, E. et al., Epigenetic analysis of high and low motile sperm populations reveals methylation variation in satellite regions within the pericentromeric position and in genes functionally related to sperm DNA organization and maintenance in Bos taurus. BMC Genomics 2019, 20 (1). https ://doi.org/10.1186/s12864‑019‑6317 – 6. • Walter, J. M. et al., Occurrence of Harmful Cyanobacteria in Drinking Water from a Severely Drought-Impacted Semi-arid Region. Frontiers in Microbiology 2018, 9. https ://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00176. • Grubišić, M. et al., Bioprospecting of Microalgae Isolated from the Adriatic Sea : Characterization of Biomass, Pigment, Lipid and Fatty Acid Composition, and Antioxidant and Antimicrobial Activity. Molecules 2022, 27 (4), 1248. https ://doi.org/10.3390/molecules27041248. Protocoles additionels Références Purification de l’ADN de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) • Kwon, S.-J. et al., Quantitative PCR for Etiologic Diagnosis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Pneumonia in Intensive care unit. Tuberculosis & Respiratory Diseases 2012, 72 (3), 293. https ://doi.org/10.4046/trd.2012.72.3.293. • Conrad, C. C. et al., Zoonotic fecal pathogens and antimicrobial resistance in Canadian petting zoos. Microorganisms 2018, 6 (3), 70. https ://doi.org/10.3390/microorganisms6030070. ADN génomique des tissus 8 Annexes 8.1 Guide de résolution des problèmes Problème Causes possibles et suggestions Lyse incomplète • L’échantillon n’a pas été complètement homogénéisé et mélangé avec le tampon T1 / protéinase K. Le mélange doit être vigoureusement vortexé immédiatement après l’ajout du tampon T1. • Diminution de l’activité de la protéinase K : Conserver la protéinase K dissoute à - 20 °C pendant 6 mois. Réactifs mal utilisés • Faible ou inexistant rendement en ADN Préparer le tampon B5 et la solution de protéinase K selon les instructions (voir chapitre 3). Ajouter de l’éthanol aux lysats avant de les charger sur les colonnes. Elution sous-optimale de l’ADN de la colonne • Pour certains types d’échantillons, préchauffer le tampon BE à 70 °C avant l’élution. Appliquer le tampon BE directement au centre de la membrane de silice. • L’efficacité de l’élution diminue considérablement si l’élution est effectuée avec des tampons dont le pH est inférieur à 7,0. Utiliser des tampons d’élution légèrement alcalins comme le tampon BE (pH 8,5). • En particulier lorsque l’on s’attend à des rendements élevés à partir de grandes quantités de matériel, nous recommandons l’élution avec 200 μL de tampon BE et l’incubation des colonnes fermées dans un incubateur à 70 °C pendant 5 min avant la centrifugation. Lyse incomplète Mauvaise qualité de l’ADN • L’échantillon n’a pas été complètement homogénéisé et mélangé avec le tampon T1 / protéinase K. Le mélange doit être vigoureusement vortexé immédiatement après l’ajout du tampon T1. • Diminution de l’activité de la protéinase K : Conserver la protéinase K dissoute à - 20 °C pendant 6 mois. MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 43 ADN génomique des tissus Problème Causes possibles et suggestions Réactifs mal utilisés • Mauvaise qualité de l’ADN (suite) Préparer le tampon B5 et la solution de protéinase K selon les instructions (voir chapitre 3). Ajouter de l’éthanol aux lysats avant de les charger sur les colonnes. ARN dans l’échantillon • Si l’on souhaite obtenir un ADN exempt d’ARN, ajouter 20 μL de solution de RNase A (10 mg / mL ; non fournie avec le kit) avant l’ajout du tampon B3 et incuber à 37 °C pendant 5 min. Trop d’échantillons utilisés • Colonnes bouchées Ne pas utiliser plus d’échantillon que la quantité recommandée (25 mg pour la plupart des types de tissus). Si du matériel insoluble comme des os ou des cheveux reste dans le lysat, centrifuger les débris et transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube de microcentrifugation avant de procéder à l’ajout du tampon B3 et de l’éthanol. L’utilisation du filtre NucleoSpin® avant le chargement de la colonne permet d’éviter le colmatage de la colonne. Lyse incomplète • L’échantillon n’est pas complètement homogénéisé et mélangé avec le tampon T1/protéinase K. Le mélange doit être vigoureusement vortexé immédiatement après l’ajout du tampon T1. • Diminution de l’activité de la protéinase K : Conserver la protéinase K dissoute à -20 °C pendant 6 mois. Réactifs mal utilisés • Préparer le tampon B5 et la solution de protéinase K selon les instructions (voir chapitre 3). Ajouter de l’éthanol aux lysats avant de les charger sur les colonnes. Elimination de l’éthanol ou du sel Performance sous-optimale de l’ADN génomique dans les réactions enzymatiques 44 • Veiller à centrifuger ≥ 1 min à 11 000 x g afin d’éliminer la totalité du tampon éthanolique B5 avant d’éluer l’ADN. Si, pour une raison quelconque, le niveau de Buffer B5 a atteint la sortie de la colonne après séchage, répéter la centrifugation. • Ne pas refroidir le tampon B5 avant de l’utiliser. Un tampon froid n’éliminera pas efficacement le sel. Équilibrer le tampon B5 à la température ambiante avant de l’utiliser. MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 ADN génomique des tissus Problème Causes possibles et suggestions Contamination de l’ADN par des substances inhibitrices Performance sous-optimale de l’ADN génomique dans les réactions enzymatiques (suite) 8.2 • Ne pas éluer l’ADN avec le tampon TE. L’EDTA peut inhiber les réactions enzymatiques. Repurifier l’ADN et l’éluer dans le tampon BE. • Si le rapport A260 / A280 de l’éluat est inférieur à 1,6, répéter la procédure de purification : Ajouter 1 volume de tampon B3 plus 1 volume d’éthanol (96 – 100 %) à l’éluat. Charger le mélange sur une colonne NucleoSpin® Tissue Column et procéder à l’étape 5 du protocole standard (voir paragraphe 5). Informations de commande Produit REF Conditionnement NucleoSpin® Tissue 740952.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 preps NucleoSpin® Tissue XS 740901.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 preps NucleoSpin® DNA RapidLyse 740100.10/.50/.250 10/50/250 preps NucleoSpin® Blood 740951.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 preps Tampon T1 740940.25 50 mL Tampon B3 740920 100 mL Concentré de tampon B5 (pour 100 mL de tampon B5) 740921 20 mL Tampon BW 740922 100 mL Protéinase K 740506 100 mg RNase A 740505.50 740505 50 mg 100 mg NucleoSpin® Microbial DNA 740235.10 / .50 10 / 50 preps MN Bead Tube Holder 740469 1 piece MN Bead Tubes Type A (billes en céramique de 0,6 – 0,8 mm ; recommandé pour les sols et les sédiments) 740786.50 50 pièces MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 45 ADN génomique des tissus Produit REF Conditionnement MN Bead Tubes Type B (40 – 400 μm μm billes de verre ; recommandé pour les bactéries) 740812.50 50 pièces MN Bead Tubes Type C (1 – 3 mm de corindon ; recommandé pour les levures) 740813.50 50 pièces MN Bead Tubes Type D (billes d’acier de 3 mm ; recommandé pour les insectes) 740814.50 50 pièces MN Bead Tubes Type E (billes de verre de 40 à 400 μm et billes d’acier de 3 mm ; recommandé pour les bactéries difficiles à tolérer dans les échantillons d’insectes ou de tissus) 740815.50 50 pièces MN Bead Tubes Type F (1 – 3 mm de corindon + 3 mm de billes d’acier ; à utiliser uniquement avec MN Bead Tube Holder !) 740816.50 50 pièces NucleoSpin® DNA FFPE XS 740980.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 pièces NucleoSpin® Forensic Filters 740988.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 pièces NucleoSpin® Forensic Filters (en vrac) 740988.50B / .250B / 1000B 50 / 250 / 1000 pièces Collection Tubes (2 mL) 740600 1000 NucleoSpin® Filters 740606 50 NucleoCard® 740403.10 / .100 10 / 100 cartes Visitez le site www.mn‑net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit. 46 MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 ADN génomique des tissus 8.3 Restrictions d'utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente deMACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL‑GmbH & Co. KG Tél : +49 24 21 969‑333 support@mnnet.com MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21 47 Plasmid DNA Clean up RNA DNA Viral RNA and DNA Protein High throughput Accessories Auxiliary tools www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 info@mn-net.com CH +41 62 388 55 00 sales-ch@mn-net.com FR +33 388 68 22 68 sales-fr@mn-net.com US +1 888 321 62 24 sales-us@mn-net.com ">
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