Macherey-Nagel NucleoMag 384 Plant kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
Moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d’utilisation
ADN génomique de plante
n NucleoMag® 384 Plant
Novembre 2023 / Rev. 02
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ADN génomique de plante
Table of contents
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
5
1.3 A propos de ce manuel
5
2 Description du produit
6
2.1 Principe général
6
2.2 Caractéristiques du kit
6
2.3 Systèmes de séparation magnétique
6
2.4 Réglage des paramètres d’agitation
7
2.5 Manipulation des billes
7
2.6 Stockage et homogénéisation des échantillons
8
2.7 Procédures d’élution
9
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
9
4 Instructions de sécurité
10
4.1 Elimination des déchets
10
5 Protocole pour l’extraction d’ADN génomique à partir d’échantillons de plantes en format
384 puits
11
5.1 Résumé du protocole
11
5.2 Protocole détaillé
14
6 Annexes
17
6.1 Guide de résolution des problèmes
17
6.2 Informations de commande
18
6.3 Restrictions d’utilisation / ​garantie
19
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
3
ADN génomique de plante
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoMag® 384 Plant
1 × 384 preps
744402.1
4 × 384 preps
744402.4
NucleoMag® V-Beads
2 × 1.5 mL
5 × 1.5 mL
Tampon de lyse MC1
2 × 60 mL
500 mL
Tampon de fixation MC2
50 mL
80 mL
Tampon de lavage MC3
75 mL
300 mL
Tampon de lavage MC4
75 mL
300 mL
Tampon de lavage MC5
60 mL
250 mL
Tampon d’élution MC6
30 mL
125 mL
RNase A (lyophilisée)*
2 × 30 mg
7 × 30 mg
Manuel d’utilisation
1
1
REF
4
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
ADN génomique de plante
1.2
Réactifs, consommables et équipements à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
80 % d’éthanol
Équipement / ​Consommables
Produit
REF
Conditionnement
Tubes de lyse pour l’incubation des échantillons et
la lyse,
p.e., Rack of Tubes Strips (1 set comprend 1 Rack, 12
Barrettes avec 8 tubes (puits de 1,2 mL) chacune, et 12
Cap Strips)
740477
740477.24
4 sets
24 sets
Plaque de lyse pour l’incubation des échantillons et
la lyse,
p.e., Round well block (1 set comprend 1 plaque (96 ×
1,2 mL puits ronds), et 12 barrettes de 8 bouchons).
740475
740475.24
4 sets
24 sets
Tubes de billes G pour le broyage mécanique des
échantillons,
p.e. MN Bead Tubes Type G (50 tubes)
740817.50
50
740486.24
24
740673
20
Plaque d’élution pour la collecte d’acides nucléiques
purifiés,
p.e., plaque d’élution à fond en U (microplaque de 96
puits de 0,3 mL avec des puits à fond en U de 300 µL)
p.e., Plaque d’élution à fond plat (microplaque de 96
puits de 0,3 mL avec des puits à fond plat de 300 µL)
1.3
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs de lire les paragraphes détaillés
du protocole du kit NucleoMag® 384 Plant avant d’utiliser ce produit. Les utilisateurs
expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du
protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil supplémentaire de
référence rapide lors de l’exécution de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible en ligne à l’adresse suivante :
www.mn-net.com.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
5
ADN génomique de plante
2
Description du produit
2.1
Principe général
La procédure NucleoMag® 384 Plant est basée sur l’adsorption réversible des acides
nucléiques sur des billes paramagnétiques dans des conditions de tampons appropriées. Le
tissu végétal est extrait avec le tampon de lyse MC1 contenant du CTAB. L’ajustement des
conditions de fixation des acides nucléiques avec le tampon de fixation MC2 et l’ajout des
billes paramagnétiques peuvent être effectués simultanément. Après la séparation magnétique
et l’élimination du surnageant, les billes paramagnétiques sont lavées avec les tampons de
lavage MC3, MC4 et de l’éthanol à 80 % pour éliminer les contaminants et le sel. Une étape
de séchage n’est pas nécessaire car l’éthanol des étapes de lavage précédentes est éliminé
par le tampon de lavage MC5. Enfin, l’ADN hautement purifié est élué avec le tampon d’élution
MC6 à faible teneur en sel et peut être directement utilisé pour des applications en aval. Le
NucleoMag® 384 Plant est conçu pour une procédure automatisée à haut débit sur des robots
pipeteurs standard en format 384 puits.
2.2
Caractéristiques du kit
Le NucleoMag® 384 Plant est conçu pour une préparation automatisée de l’ADN à partir
d’échantillons de plantes en format 384 puits. Le kit est conçu pour être utilisé avec des plaques
séparatrices magnétiques statiques. L’ADN purifié peut être utilisé directement comme matrice
pour la qPCR, le séquençage nouvelle génération ou tout type de réaction enzymatique.
NucleoMag® 384 Plant permet une automatisation facile sur les instruments courants
de manipulation des liquides. Le temps de préparation réel dépend de la configuration de
l’instrument et du système de séparation magnétique utilisé.
Réserver à l’usage de la recherche
2.3
Systèmes de séparation magnétique
Pour le kit NucleoMag® 384 Plant, il est recommandé d’utiliser une plaque de séparation
magnétique statique en combinaison avec un dispositif multicanaux à 96 ou 384 puits. La
séparation est effectuée dans une plaque à 384 puits (non fournie dans le kit). Le kit convient
également aux séparateurs magnétiques courants pour plaques à 384 puits
Séparateur magnétique
Plaque ou tube de séparation
Séparateur magnétique VP 771G-4A
(V&P Scientific, Inc.)
Plaques 384 puits (puits profonds),
(Greiner BioOne)
Plaque magnétique Alpaqua 384 Post
(Alpaqua Engineering, LLC)
Séparation à aimants statiques
Les séparateurs à aimants statiques sont recommandés en combinaison avec un agitateur de
microplaques approprié pour une remise en suspension optimale des billes pendant les étapes
de lavage et d’élution. Les billes peuvent également être remises en suspension dans le tampon
par pipetages successifs. Pour une utilisation entièrement automatisée sur les stations de travail
de manipulation des liquides, un bras manipulateur est nécessaire, la plaque est transférée vers
6
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
ADN génomique de plante
le séparateur magnétique pour la séparation des billes et transférée vers le module agitateur
pour la remise en suspension des billes.
2.4
Réglage des paramètres d’agitation
Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques pour les étapes de lavage et d’élution, les
réglages des paramètres d’agitation doivent être soigneusement ajustés pour chaque plaque
de séparation spécifique et chaque agitateur afin d’éviter toute contamination croisée d’un puits
à l’autre. Procéder comme suit :
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour les étapes de fixation et de lavage :
•
Verser 105 µL (pour vérifier les paramètres de l’étape de liaison) ou 80 µL (pour vérifier
les paramètres des étapes de lavage) d’eau colorée dans les puits de la plaque de
séparation. Placer la plaque sur l’agitateur et commencer à agiter à une vitesse modérée
pendant 30 secondes. Éteindre l’agitateur et vérifier la présence de petites gouttelettes
d’eau colorée à la surface de la plaque.
•
Augmenter la vitesse, agiter pendant 30 secondes supplémentaires et vérifier à nouveau
la présence de gouttelettes à la surface de la plaque.
•
Continuer à augmenter la vitesse jusqu’à ce que vous observiez des gouttelettes sur le
dessus de la plaque de séparation. Réduiser la vitesse, vérifier à nouveau et utiliser ce
réglage pour l’étape de lavage.
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour l’étape d’élution :
Charger 100 µL d’eau colorée dans les puits de la plaque de collecte et procéder comme décrit
ci-dessus.
2.5
Manipulation des billes
Distribution des billes
Une distribution homogène des billes magnétiques dans les différents puits de la plaque de
séparation est essentielle pour assurer une répétabilité d’un puits à l’autre. Par conséquent,
avant de distribuer les billes, s’assurer que les billes sont complètement remises en suspension.
Bien agiter le flacon de stockage ou le placer brièvement sur un vortex. Le fait de mélanger
au préalable les billes magnétiques avec le tampon de fixation permet une distribution plus
homogène des billes dans les différents puits de la plaque de séparation. Lors de l’automatisation,
il est recommandé d’effectuer une étape de prémélange avant de prélever le mélange billes / ​
tampon de fixation du réservoir afin de maintenir les billes remises en suspension.
Durée de séparation magnétique*
L’attraction des billes magnétiques sur les aimants dépend de la force magnétique des aimants,
de la plaque de séparation choisie, de la distance entre la plaque de séparation et les aimants et
du volume à traiter. Les durées pour l’attraction complète des billes sur les aimants doivent être
vérifiées et ajustées pour chaque système. Il est recommandé d’utiliser les plaques ou tubes de
séparation spécifiés par le fournisseur du séparateur magnétique.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
7
ADN génomique de plante
Lavage des billes
Le lavage des billes peut être réalisé par agitation ou par pipetage. Contrairement au mélange
par pipetages successifs, le mélange par agitateur permet de mélanger simultanément tous
les échantillons. Cela permet de réduire le temps et le nombre de cônes nécessaires à la
préparation. La remise en suspension par pipetages successifs est cependant plus efficace
que le mélange par agitateur.
Méthode
Efficacité de
la remise en
suspension
Vitesse
Nombre de cônes
nécessaires
Agitateur
++
++
Faible
Pipetage
+++
+*
Haut
+ : acceptable, ++ : bon, +++ : excellent
* Multipipette à 8 canaux
2.6
Stockage et homogénéisation des échantillons
Nous recommandons d’utiliser des échantillons de jeunes plantes et de conserver les plantes
pendant environ 12 heures dans l’obscurité avant de collecter les échantillons afin de réduire la
teneur en polysaccharides.
Les échantillons de plantes peuvent être conservés à l’état congelé, sous éthanol ou lyophilisés.
Dans de nombreux cas, le matériel lyophilisé et séché peut être traité plus facilement et donne
un rendement plus élevé. Si vous utilisez des échantillons séchés, réduisez la quantité de
matière première par un facteur 5 (p.e., utiliser 10 mg de feuilles végétales séchées au lieu de
50 mg de poids frais).
Les tissus végétaux étant très robustes, la procédure de lyse est plus efficace avec des
échantillons bien homogénéisés et réduits en poudre. Les méthodes appropriées comprennent
le broyage avec un pilon et un mortier en présence d’azote liquide ou l’utilisation de billes
d’acier. Nous recommandons également l’utilisation d’autres homogénéisateurs commerciaux,
de broyeurs à billes, par exemple Crush Express pour l’homogénéisation de 96 puits
(contacter Saaten-Union Resistenzlabor GmbH, D-33818 Leopoldshohe), Tissue Striker
(www.KisanBiotech.com) ou Geno/Grinder 2000 (www.spexcsp.com ou pour l’Allemagne
www.c3-analysentechnik.de).
Méthodes d’homogénéisation des échantillons
Homogénéiser les échantillons dans des MN Bead Tubes Type G, un rack de barrettes de tubes
ou un Round well block avec des barrettes de 8 bouchons (voir informations de commande 6.2)
remplis de billes en acier.
L’homogénéisation d’échantillons plus importants peut également être réalisée à l’aide de billes
d’acier VA (diamètre : 7 mm) : Mettre 4 – 5 billes et le matériel végétal ensemble dans un tube
en plastique de 15 mL (Falcon), refroidir le tube dans l’azote liquide et vortexer pendant environ
30 secondes (par exemple, avec un Multi Pulse Vortex, contacter Schütt Labortechnik GmbH,
Postfach 3454, D-37024 Göttingen, Allemagne). Répéter cette procédure de refroidissement
et de vortex jusqu’à ce que tout le matériel végétal soit broyé en poudre. Refroidir le tube une
fois de plus et retirer les billes en les faisant rouler doucement ou à l’aide d’un aimant. Maintenir
le matériel congelé pendant toute la durée de la procédure d’homogénéisation. N’ajoutez pas
8
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
ADN génomique de plante
d’azote dans le tube ! Cela entraînerait l’adhérence et la perte du matériel végétal attaché aux
billes.
2.7
Procédures d’élution
L’ADN purifié peut être élué directement avec le tampon d’élution MC6 fourni. L’élution peut
être effectuée dans un volume ≥ 50 µL. Il est essentiel de recouvrir complètement les billes
NucleoMag® avec le tampon d’élution pendant l’étape d’élution. Le volume de tampon d’élution
distribué dépend du système de séparation magnétique (p.e., la position du culot à l’intérieur
de la plaque de séparation). Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être
entièrement remis en suspension dans le tampon d’élution. Pour certains séparateurs, des
volumes d’élution plus élevés peuvent être nécessaires pour couvrir la totalité du culot.
L’élution est possible à température ambiante. Le rendement peut être augmenté de 15 à 20 %
si l’élution est effectuée à 55 °C.
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention : Les tampons MC3 et MC4 contiennent du sel chaotropique ! Le tampon MC2 est
hautement inflammable et irritant. Porter des gants et des lunettes de protection !
Conditions de stockage :
•
Tous les composants du kit NucleoMag® 384 Plant doivent être conservés à
température ambiante (18 – 25 °C) et sont stables jusqu’à un an.
•
Tous les tampons sont livrés prêts à l’emploi.
Avant de débuter une procédure NucleoMag® 384 Plant, préparer les éléments suivants :
•
RNase A : avant la première utilisation, ajouter le volume d’eau indiqué à chaque flacon
de RNase A lyophilisée. Conserver la RNase A à 4 °C.
•
Éthanol à 80 % : Utiliser de l’éthanol de qualité biologie moléculaire, diluer avec de l’eau
appropriée jusqu’à 80 %.
NucleoMag® 384 Plant
REF
1 × 384 preps 744402.1 4 × 384 preps 744402.4
RNase A (lyophilized)
2 × 30 mg
Ajouter 2,5 mL d’eau à
chaque flacon
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
7 × 30 mg
Ajouter 2,5 mL d’eau à
chaque flacon
9
ADN génomique de plante
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® 384 Plant, porter des vêtements de
protection appropriés (p.e. blouse de laboratoire, gants jetables et lunettes de protection).
Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées
(les FDS sont disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds).
Les déchets générés par le kit NucleoMag® 384 Plant n’ont pas été testés pour détecter
la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du
matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement
dénaturant et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue. Par
conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être
manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
10
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
ADN génomique de plante
5
Protocole pour l’extraction d’ADN génomique à
partir d’échantillons de plantes en format 384
puits
5.1
Résumé du protocole
Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir respectivement
les paragraphes 1.2 et 2.3.
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 14.
Avant de débuter la procédure :
Vérifier si la RNase A a été préparée conformément au paragraphe 3.
1
Homogénéiser et lyser
l’échantillon de plantes
(~30 mg)
Ajouter 200 μL de MC1
et 10 μL de RNase A.
Mélanger
56 °C, 60 min
2
3
Clarifier les lysats par
centrifugation, transférer
50 µL de lysat clarifié pour
la suite de la procédure.
Fixation de l’ADN aux
NucleoMag® V-Beads
Centrifuger à 5 600 x g,
3 min
Transférer 50 μL de lysat clarifié
Ajouter 4 μL de NucleoMag®
V-Beads et 50 μL de MC2
(Note : Remettre en suspension les
NucleoMag® V-Beads avant de les
retirer du flacon de stockage).
Mélanger par agitation
pendant 5 min à TA.
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 3 min de séparation.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
11
ADN génomique de plante
4
Lavage avec le tampon
MC3
Retirer la plaque de séparation du
séparateur magnétique
Ajouter 80 μL de MC3
Remettre en suspension : Agiter
5 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
5
Lavage avec le tampon
MC4
Retirer la plaque de séparation du
séparateur magnétique
Ajouter 80 μL de MC4
Remettre en suspension : Agiter
5 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
12
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
ADN génomique de plante
6
Lavage avec le tampon à
80 % d’éthanol
Retirer la plaque de séparation du
séparateur magnétique
Ajouter 80 μL d’éthanol à 80 %.
Remettre en suspension : Agiter
5 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
7
Lavage avec le tampon
MC5
Laisser la Square-well Block sur le
séparateur magnétique !
Ajouter 80 μL MC5
Incuber pendant 45 – 60 s
Note : Ne pas remettre les
billes en suspension
dans le tampon MC5 !
Retirer le surnageant
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
13
ADN génomique de plante
8
Eluer l’ADN
Retirer la plaque de séparation du
séparateur magnétique
Ajouter 60 μL de MC6
(Volume d’élution possible de 50
à 200 µL ; Optionnel : élution à
55 °C)
Agiter 10 min à TA
(Optionnel : mélanger par
pipetages successifs)
Séparer 2 min et transférer l’ADN
(surnageant) dans la plaque
d’élution / ​les tubes.
5.2
Protocole détaillé
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques et les agitateurs
de plaques appropriés (voir le chapitre 3). Il est recommandé d’utiliser une plaque de séparation
384 puits appropriée (voir le chapitre 3). L’extraction de l’ADN peut également être réalisée dans
d’autres formats (voir paragraphe 6.2). Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et
sert de guide pour l’adaptation du kit aux instruments robotisés.
Avant de débuter la procédure :
Vérifier si la RNase A a été préparée conformément au paragraphe 3.
1
Homogénéiser et lyser l’échantillon
Homogénéiser environ 30 mg (frais) ou < 10 mg (lyophilisé) de tissu végétal, par
exemple à l’aide de barrettes de microtubes dans un broyeur, et ajouter 200 µL de
tampon MC1. Ne pas souiller le bord. Fermer les puits individuels avec des barrettes
de 8 bouchons. Mélanger par agitation ou par pipetage pendant 15 à 30 s. Centrifuger
brièvement pendant 30 s à 1 500 x g pour collecter tout échantillon des barrettes.
Incuber les barrettes fermées à 56 °C pendant 60 min.
Optionnel : Si les échantillons contiennent de grandes quantités d’ARN, nous
recommandons d’ajouter 10 µL de solution de RNase A (solution mère 12 mg/ml) au
mélange de lyse MC1.
14
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
ADN génomique de plante
2
Lysats clarifiés
Centrifuger les échantillons pendant 3 min à pleine vitesse (5 600 – 6 000 x g). Retirer
les barrettes de 8 bouchons.
Transférer 50 µL du lysat clarifié (équilibré à température ambiante) sur une plaque de
séparation appropriée. Ne pas souiller les bords du puits.
Note : Voir les recommandations concernant les plaques ou tubes appropriés et les
séparateurs magnétiques compatibles au paragraphe 1.2.
3
Fixation de l’ADN aux NucleoMag® V-Beads
Ajouter 4 µL de NucleoMag® V-Beads et 50 µL de tampon MC2 dans chaque
puits de la plaque de séparation. Mélanger par pipetages successifs 6 fois et agiter
pendant 5 min à température ambiante. Alternativement, lors de la procédure du kit
sans agitateur, pipeter successivement 10 fois et incuber pendant 5 min à température
ambiante.
Note : Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® V-Beads avant de les retirer
du flacon de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une
suspension homogène soit formée.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant la plaque de
séparation sur un séparateur magnétique approprié. Attendre au moins 3 min jusqu’à
ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à
l’aide d’une pipette.
Note : Ne pas perturber les culots de billes attirés lors de l’aspiration du surnageant.
Le culot de billes n’est pas visible lors de cette étape. Prélever le surnageant de l’autre
côté du puits.
4
Lavage avec le tampon MC3
Retirer la plaque de séparation du séparateur magnétique.
Ajouter 80 µL de tampon MC3 dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension
(5 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par pipetages
successifs (15 fois).
Séparer les billes magnétiques en plaçant la plaque de billes sur le séparateur
magnétique. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées
par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
15
ADN génomique de plante
5
Lavage avec le tampon MC4
Retirer la plaque de séparation du séparateur magnétique.
Ajouter 80 µL de tampon MC4 dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension
(5 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par pipetages
successifs (15 fois).
Séparer les billes magnétiques en plaçant la plaque de billes sur le séparateur
magnétique. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées
par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant en pipettant
6
Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol
Retirer la plaque de séparation du séparateur magnétique.
Ajouter 80 µL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension
(5 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par pipetages
successifs (15 fois).
Séparer les billes magnétiques en plaçant la plaque de billes sur le séparateur
magnétique. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées
par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant en pipettant
7
Lavage avec le tampon MC5
Laisser la plaque de séparation sur le séparateur magnétique.
Note : Le surnageant est incolore, le culot de billes magnétiques est clairement visible.
Ajouter délicatement 80 µL de tampon MC5 dans chaque puits et incuber pendant
45 – 60 s tant que les billes sont encore attirées par les aimants. Aspirer et jeter le
surnageant.
Note : Ne pas remettre en suspension les billes dans le tampon de lavage MC5. Cette
étape permet d’éliminer les traces d’éthanol et de supprimer l’étape de séchage !
8
Elution
Retirer la plaque de séparation du séparateur magnétique.
Ajouter le volume souhaité de tampon MC6 (50 – 200 µL) à chaque puits de la plaque
de séparation et remettre les billes en suspension par agitation pendant 5 – 10 min à
température ambiante. Alternativement, remettre les billes en suspension complètement
par pipetages successifs et incuber pendant 5 – 10 min à température ambiante.
Séparer les billes magnétiques en plaçant la plaque de billes sur le séparateur
magnétique. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées
par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ADN génomique purifié sur la
plaque d’élution.
Note : Le rendement peut être augmenté de 15 à 20 % en utilisant un tampon d’élution
préchauffé (55 °C) ou en incubant la suspension billes/tampon d’élution à 55 °C pendant
10 min.
16
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
ADN génomique de plante
6
Annexes
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possibles et suggestions
Volume de tampon d’élution insuffisant
Le culot des billes doit être entièrement recouvert de tampon d’élution.
Performance insuffisante du tampon d’élution pendant l’étape d’élution
Éliminer complètement les tampons résiduels lors des étapes de
séparation. Les tampons résiduels diminuent l’efficacité des étapes de
lavage et d’élution suivantes.
Séchage excessif des billes
Ne pas laisser les billes sécher, car cela pourrait entraîner une baisse de
l’efficacité de l’élution.
Faible rendement
en ADN
Élution partielle dans le tampon de lavage MC5
Maintenir les billes sur l’aimant pendant la distribution du tampon de
lavage MC5. Ne pas remettre les billes en suspension dans ce tampon
et ne pas incuber les billes dans ce tampon pendant plus de 2 min, car
ce tampon est à base d’eau et pourrait déjà éluer l’ADN.
Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant
Ne pas perturber les billes attirées lors de l’aspiration du surnageant,
en particulier lorsque le culot magnétique n’est pas visible dans le lysat.
Incubation après distribution des billes dans le lysat
Mélanger immédiatement après avoir distribué les NucleoMag®
V-Beads / ​tampon MC2 au lysat.
Procédure de lavage insuffisante
Pureté insuffisante
N’utiliser que les combinaisons appropriées de séparateur et de plaque,
par exemple.
Contamination par l’éthanol par le tampon de lavage à 80 % d’éthanol
Mauvaise
performance de
l’ADN lors des
applications avales
Eliminer toute la solution de lavage éthanolique, car l’éthanol résiduel
interfère avec les applications en aval.
Pureté insuffisante
Voir ci-dessus
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
17
ADN génomique de plante
Problème
Causes possibles et suggestions
Durée de séparation magnétique trop courte
Perte des billes
Augmenter la durée de séparation pour permettre aux billes d’être
complètement attirées par les aimants avant d’aspirer tout liquide du
puits.
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
Une vitesse d’aspiration élevée pendant l’étape d’élution peut entraîner
une perte des billes. Réduire la vitesse d’aspiration pour l’étape
d’élution.
Contaminations des parties supérieures des puits
Contamination
croisée
6.2
Ne pas souiller les bords de la plaque lors du transfert du lysat végétal.
Si le bord des puits est contaminé, sceller la plaque avec une feuille
PE auto-adhésive (voir informations de commande) avant de mettre
l’agitateur en marche.
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoMag® 384 Plant
744402.1
744402.4
1 × 384 preps
4 × 384 preps
NucleoMag® SEP
744900
A utiliser uniquement avec des plaques à 96 puits, telles
que la 740481 (plaque Deep-well). Non recommandé
pour l’utilisation de blocs de 384 puits.
1
740481
740481.24
4
24
Film PE auto-adhésif
740676
50 feuilles
Rack of Tubes Strips
(le set comprend 1 Rack, 12 barrettes de 8 tubes
chacune et 12 barrettes de bouchons)
740477
740477.24
4 sets
24 sets
Round well block avec barrettes de 8 bouchons
(set composé de 1 plaque (96 puits ronds de 1,2 mL) et
de 12 barrettes de 8 bouchons)
740475
740475.24
4 sets
24 sets
MN Bead Tubes Type G
(tubes de 2 mL avec des billes d’acier pour
l’homogénéisation des échantillons)
740817.50
50
Plaque d’élution à fond en U
740486.24
24
Square-well Blocks
(Blocs 96-well avec puits carrés pour utilisation avec
NucleoMag® SEP 744900)
18
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
ADN génomique de plante
Produit
REF
Conditionnement
Plaque d’élution à fond plat
740673
20
Cap Strips (barrettes de 8 bouchons)
740638
30 barrettes
Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le
produit.
6.3
Restrictions d’utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un
représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne
font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société.
MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez
contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur
les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour
obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la
documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04
Veuillez contacter:
MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Tel.: +49 24 21 969 333
support@mn-net.com
Marques déposées :
NucleoMag® est une marque déposée de MACHEREY-NAGEL GmbH & Co KG.
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux
marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne
ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur
fonctionnement.
MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 02
19
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