Macherey-Nagel NucleoMag DNA Bacteria Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
Moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d’utilisation
ADN de bactéries et de levures
n NucleoMag® DNA Bacteria
Mai 2024 / ​Rev. 03
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ADN de bactéries et de levures
Sommaire
1 Composants
4
1.1 Contenu du kit
4
1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
5
1.3 A propos de ce manuel
7
1.4 Support pour l’automatisation
7
2 Description du produit
8
2.1 Principe général
8
2.2 Caractéristiques du kit
8
2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons
9
2.4 Lyse et broyage des échantillons
9
2.4.1 Dispositif de broyage
9
2.4.2 Type de tubes ou de plaques de billes
10
2.4.3 Durée et fréquence du broyage
10
2.5 Systèmes de séparation magnétique
14
2.6 Réglage des paramètres d’agitation
15
2.7 Manipulation des billes magnétiques
15
2.8 Procédures d’élution
16
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
17
4 Instructions de sécurité
18
4.1 Elimination des déchets
5 Protocole d’extraction d’ADN à partir d’échantillons de bactéries et de levures
18
19
5.1 Résumé du protocole utilisant les MN Bead Tubes Type B
19
5.2 Protocole détaillé d’utilisation des MN Bead Tubes Type B
22
5.3 Protocole détaillé d’utilisation de la MN 96 Bead Plate Types B
25
6 Annexes
27
6.1 Guide de résolution des problèmes
27
6.2 Informations de commande
29
6.3 Restriction d’utilisation / ​garantie
31
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
3
ADN de bactéries et de levures
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoMag® DNA Bacteria
REF
1 × 96 preps
744310.1
4 × 96 preps
744310.4
NucleoMag® B-Beads
2 × 1,5 mL
12 mL
Tampon IML
60 mL
250 mL
Tampon de fixation IMB*
40 mL
2 × 75 mL
Tampon de lavage IMW
(Concentré)**
50 mL
200 mL
60
250 mL
Protéinase K liquide
1,25 mL
4,5 mL
RNase A liquide
0,3 mL
1,25 mL
Manuel d’utilisation
1
1
Tampon IME***
*Stocker le tampon de fixation IMB dès son arrivée à 4 °C.
**Pour la préparation des réactifs et le stockage, voir le chapitre 3.
***Composition du tampon IME : 5 mM Tris/HCl, pH 8.5
4
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
ADN de bactéries et de levures
1.2
Réactifs, consommables et équipements à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
80 % d’éthanol
•
96 – 100 % d’éthanol
Consommables
•
MN Bead Tubes Type A pour le broyage mécanique des culots de levure dans un format
tube.
•
MN Bead Tubes Type B pour le broyage mécanique des culots bactériens dans un format
tube.
•
MN 96 Bead Plate Type B pour le broyage mécanique des culots bactériens dans un
format pratique de 96 puits.
•
Récipient de réaction approprié pour la purification à base de billes magnétiques (p.e.
tubes de réaction de 1,5 mL ou plaque à 96 puits (voir le tableau de la page suivante).
Equipement
•
Centrifugeuse pour microtubes ou plaques en fonction des consommables utilisés pour le
broyage
•
Vortex
•
Équipements de protection individuelle (p.e., blouse, gants, lunettes)
Dispositif de broyage des échantillons :
•
Il est recommandé d’utiliser le MN Bead Tube Holder (voir le tableau de la page suivante)
avec le Vortex-Genie® 2 pour un broyage économique et pratique des échantillons en
combinaison avec les MN Bead Tubes.
•
Il est également possible d’utiliser un broyeur à oscillation ou un dispositif similaire en
tenant compte des précautions énoncées au chapitre 2.4.3 et de la compatibilité avec
les consommables de broyage (par exemple, le Mixer Mill MM200, MM300, MM400
(Retsch®).
AVERTISSEMENT : L’utilisation d’autres dispositifs de broyage tels que FastPrep® System (MP
Biomedicals), Precellys® (Bertin Technologies), MagNA™ Lyser (Roche), TissueLyser (QIAGEN),
Bullet Blender® (Next Advance), Mini-Beadbeater™ (Biospec Products), Speed Mill (Analytik
Jena) ou d’autres dispositifs similaires peut entraîner la destruction des tubes de billes ou des
plaques de billes. De tels dispositifs de broyage peuvent provoquer un stress mécanique élevé
sur les tubes de billes ou les plaques de billes. En fonction du type de tube de billes/plaque de
billes et de son contenu (billes comme les billes d’acier, volume de liquide, type d’échantillon),
une fréquence d’agitation particulièrement élevée et/ou une longue durée d’agitation peuvent
entraîner la destruction des tubes de billes ou des plaques de billes. En cas d’utilisation d’un
tel dispositif de broyage, il incombe à l’utilisateur d’effectuer des tests de stabilité préliminaires
pour garantir la stabilité des tubes ou des plaques de billes au cours de la configuration du
dispositif expérimental (p.e., intensité de l’agitation). Voir également le paragraphe 2.4.3 !
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
5
ADN de bactéries et de levures
Produit
Système de séparation magnétique
p.e., NucleoMag® SEP (adapté aux plaques 96 puits
(profonds))
p.e., NucleoMag® SEP Mini (adapté aux tubes de 1,5 à
2 mL)
p.e., NucleoMag® SEP Maxi (adapté aux tubes de
50 mL)
p.e., NucleoMag® SEP 24 (adapté aux plaques 24 puits
(profonds))
Plaque de séparation pour la séparation des billes
magnétiques
p.e., Square-well Block (bloc de 96 puits avec des puits
carrés de 2,1 mL)
REF
Conditionnement
744900
1
744901
1
744902
1
744903
1
740481
740481.24
4 sets
24 sets
Système d’homogénéisation des échantillons
740786.50
p.e., MN Bead Tubes Type A
Tubes de billes contenant des billes de céramique de
0,6 – 0,8 mm ; convient en conjonction avec le MN Bead
Tubes Holder ou un système de broyage.
50
740812.50
p.e., MN Bead Tubes Type B
Tubes de billes contenant des billes de verre de 40 à
400 µm ; utilisables avec le MN Bead Tube Holder ou un
dispositif de broyage.
50
p.e., MN 96 Bead Plate Type B
740851.4
740851.24
Un rack de barrettes de tubes préremplis (8 × 12)
contenant des billes de verre de 40 à 400 µm ; utilisation
avec un système de broyage
4
24
p.e., MN Bead Tube Holder
Support de tubes pour l’instrument Vortex-Genie® et
une plate-forme de 3 pouces afin de loger jusqu’à 12
tubes de billes.
740469
1
Enzymes supplémentaires (si nécessaire)
Protéinase K liquide
RNase A liquide
740396
740397
5 mL
2 × 1.25 mL
740477
740477.24
4 sets
24 sets
740486.24
24
Consommables pour une utilisation à haut débit
p.e., Rack de barrettes de tubes
1 set comprend 1 Rack, 12 barrettes de 8 bouchons
(puits de 1,2 mL) et 12 Cap Strips.
p.e., Plaque d’élution à fond en U
Plaque d’élution pour la collecte d’acides nucléiques
purifiés (microplaque de 96 puits de 0,3 mL avec des
puits à fond en U de 300 µL)
6
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
ADN de bactéries et de levures
Produit
Pour l’utilisation du kit sur les instruments
KingFisher
p.e., KingFisher® 96 / ​plateforme Flex :
KingFisher® 96 Accessory Kit A
(Square-well Blocks, Deep-well tip Combs, plaques
pour 4 × 96 NucleoMag®DNA Bacteria preps)
p.e., plate-forme KingFisher® DUO / ​DUO Prime :
KingFisher® DUO Accessory Kit
(Square-well Blocks, Deep-well tip Combs, plaques
pour 8 × 12 NucleoMag®DNA Bacteria preps).
1.3
REF
Conditionnement
744950
1 set
744952
1 set
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé aux personnes qui utilisent pour la première fois le kit NucleoMag®
DNA Bacteria de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce manuel d’utilisation. Les
utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du
protocole est conçu pour être utilisé comme un outil de référence rapide pendant l’exécution
de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible à l’adresse suivante : www.mn-net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes.
Der folgende Absatz muss hinzugefügt werden. :
1.4
Support pour l’automatisation
Les kits d’extraction MN sont conçus pour une automatisation offrant une compatibilité avec
une large gamme de systèmes robotiques ouverts. Que vous utilisiez des systèmes avec des
barreaux magnétiques ou des manipulateurs de liquides comme Hamilton, Tecan, Eppendorf
ou d’autres plateformes, nos kits garantissent des procédures d’extraction efficaces et fiables.
Contactez-nous pour obtenir une assistance complète et des solutions d’automatisation sur
mesure, afin de rendre votre expérience d’extraction transparente et sans effort.
Vous avez des questions sur l’assistance de MACHEREY‑NAGEL en matière de programmes
ou sur le service d’automatisation ?
Veuillez nous contacter pour une assistance personnalisée :
Téléphone : +49 2421 969 333 + 49 2421 969 333
Courriel : support@mn-net.com
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
7
ADN de bactéries et de levures
2
Description du produit
2.1
Principe général
Le kit NucleoMag® DNA Bacteria est conçu pour l’extraction d’ADN à partir de microorganismes, tels que les bactéries Gram-positives ou Gram-négatives et les levures. Pour une
utilisation optimale du kit NucleoMag® DNA Bacteria pour les échantillons de levures ou de
mycéliums fongiques, des tubes de billes spécifiques peuvent être nécessaires (voir paragraphe
2.4.2).
Le kit NucleoMag® DNA Bacteria utilise une chimie de tampon unique (brevet en instance), qui
ne nécessite pas de sels chaotropiques nocifs et corrosifs ni de fortes concentrations d’alcools
pendant l’étape de fixation.
Les échantillons microbiens tels que les bactéries Gram-positives, les levures et les spores
peuvent être difficiles à lyser en raison de la structure complexe de leurs parois cellulaires. Les
kits NucleoMag® DNA Bacteria combinent la lyse enzymatique et le broyage mécanique des
échantillons avec les tubes de billes MN ou les plaques 96 de billes MN.
La procédure est basée sur l’adsorption réversible des acides nucléiques sur des billes
paramagnétiques dans des conditions de tampons appropriées. Après la lyse de l’échantillon
(traitement enzymatique combiné à un broyage mécanique de l’échantillon à l’aide de tubes
de billes MN ou de plaques 96 de billes MN), les mélanges de lyse peuvent être clarifiés par
centrifugation et les conditions de fixation sont ajustées par l’ajout du tampon IML. Pour la
fixation des acides nucléiques aux billes paramagnétiques, le tampon de fixation IMB et les
NucleoMag® B-Beads sont ajoutés au lysat transféré. Après la séparation magnétique, les billes
paramagnétiques sont lavées pour éliminer les contaminants à l’aide de tampons de lavage
IMW et d’éthanol à 80 %. L’éthanol résiduel des étapes de lavage précédentes est éliminé par
séchage à l’air. Ensuite, l’ADN hautement purifié est élué avec le tampon IME et peut être utilisé
directement pour des applications en aval. Le kit NucleoMag®DNA Bacteria peut être utilisé
soit manuellement, soit de manière automatisée sur des robots pipeteurs standards et des
séparateurs magnétiques automatisés.
Nous pouvons fournir une assistance personnalisée, des informations sur les protocoles ou
des programmes vérifiés pour de nombreuses plateformes. Pour plus d’informations, veuillez
contacter notre support technique ou visiter le site www.mn-net.com/automation.
2.2
Caractéristiques du kit
•
NucleoMag® DNA Bacteria est recommandé pour l’extraction rapide, manuelle et
automatisée, de l’ADN total de micro-organismes. L’ADN des bactéries ou des levures est
extrait simultanément à l’aide d’une technologie basée sur des billes magnétiques et peut
être directement soumis à des applications en aval telles que la PCR en temps réel, le
séquençage de nouvelle génération, etc.
•
Le kit NucleoMag®DNA Bacteria permet une automatisation facile sur les instruments
courants de manipulation des liquides ou les séparateurs magnétiques automatisés.
Le temps de préparation réel dépend de la configuration de l’instrument et du système
de séparation magnétique utilisé. Typiquement, 96 échantillons peuvent être purifiés
en moins de 120 minutes en utilisant le NucleoMag® SEP sur une plateforme de
manipulation de liquide commune ou en moins de 30 minutes en utilisant un système
à barreaux magnétiques (hors lyse des échantillons). Pour plus d’informations sur le
processus d’automatisation et la disponibilité de programmes prêts à l’emploi pour
certaines plateformes, veuillez contacter votre distributeur local ou MN directement.
8
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
ADN de bactéries et de levures
Résumé des caractéristiques du kit
Paramètres
NucleoMag® DNA Bacteria
Technologie
Technologie des billes magnétiques
Format
Billes superparamagnétiques hautement réactives
Matériau de l’échantillon
Culots de culture de bactéries Gram-positives et Gramnégatives et de levures
Quantité d’échantillon
Jusqu’à environ 40 mg de poids humide
Rendement typique
Varie selon l’échantillon et le dispositif de broyage.
Volume d’élution
50 – 200 µL
Utilisation
Réserver à l’usage de la recherche
2.3
Manipulation, préparation et stockage des échantillons
Les cellules en culture microbienne doivent être récoltées à partir de cultures microbiennes
fraîches par sédimentation via la centrifugation. Le surnageant doit être soigneusement éliminé
par aspiration. Les culots de cellules microbiennes peuvent être utilisés frais ou congelés
(-20 °C à -80 °C) avant de débuter la procédure.
2.4
Lyse et broyage des échantillons
Afin d’obtenir des rendements optimaux d’ADN à partir d’échantillon, un broyage complet de
l’échantillon est nécessaire. L’efficacité du broyage de l’échantillon dépend des paramètres
suivants et peut être obtenue en suivant les suggestions présentées dans les paragraphes
suivants.
2.4.1 Dispositif de broyage
Les dispositifs suivants sont compatibles avec les MN Bead Tubes ou les MN 96 Bead Plates
Veuillez vérifier si les MN Bead Tubes ou les MN 96 Bead Plates peuvent s’adapter aux
adaptateurs de tubes disponibles avant de commencer la procédure.
Support MN Bead Tube Holder (pour les tubes de billes MN) en combinaison avec le VortexGenie® 2 (recommandé).
Système de broyage MM200, MM300, MM400 (Retsch® ) (adapté aux MN Bead Tubes ou
aux MN 96 Bead Plates ; veuillez vérifier la compatibilité des adaptateurs disponibles avant de
commencer la procédure).
S’il est prévu d’utiliser d’autres dispositifs de broyage (paragraphe 1.2), il convient de tenir
compte du paragraphe 2.4.3 et de lire attentivement la note d’AVERTISSEMENT.
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
9
ADN de bactéries et de levures
2.4.2 Type de tubes ou de plaques de billes
•
Le type de billes, le temps de broyage et la fréquence/vitesse doivent être optimisés pour
un échantillon donné afin d’obtenir un rendement et une qualité d’ADN optimum.
Type de tube de billes
Recommandé pour
REF
MN Bead Tubes Type A
(billes de céramique de
0,6 – 0,8 mm)
Sol et sédiments, cellules de levure
740786.50
MN Bead Tubes Type B
(40 – 400 μm billes de verre)
Bactéries Gram-positives et
négatives
740812.50
MN Bead Tubes Type D
(billes d’acier de 3 mm)
Échantillons d’insectes
740814.50
MN 96 Bead Plate Type B
(40 – 400 μm billes de verre)
Bactéries Gram-positives et
négatives
740851.4
740851.24
MN 96 Bead Plate Type D
(billes d’acier de 3 mm)
Échantillons d’insectes
740853.4
740853.24
MN Bead Tubes Type E
(combinaison de billes d’acier
de 3 mm et de billes de verre de
40 – 400 μm)
Tissu difficile à lyser contenant des
bactéries Gram-positives
740815.50
MN Bead Tubes Type G
(billes d’acier de 5 mm)
Matériel végétal
740817.50
Autres types de billes disponibles
pour diverses applications
2.4.3 Durée et fréquence du broyage
MN Bead Tubes
Les recommandations suivantes ont été établies pour le MN Bead Tube Holder en combinaison
avec un Vortex-Genie® 2 ou un Retsch® Mixer Mill MM300 fonctionnant à la fréquence la plus
élevée (30 Hertz). Pour l’utilisation d’autres dispositifs de broyage et d’autres matériaux
d’échantillonnage, le temps et la fréquence doivent être optimisés.
En règle générale, les échantillons microbiens sont broyés pendant 20 min à l’aide du MN Bead
Tube Holder sur un Vortex-Genie® 2.
10
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
ADN de bactéries et de levures
Durée et fréquence du broyage à l’aide du MN Bead Tube Holder sur un Vortex-Genie® 2
Echantillon
Tube de billes MN
Temps / ​vitesse
de broyage
Bactéries Gram-positives
p.e., Escherichia coli, Vibrio
fischeri
MN Bead Tubes Type B
(Alternative : Type A)
Environ 12 min, à
pleine vitesse
Bactéries Gram-positives
p.e., Bacillus subtilis,
Corynebacterium glutamicum
MN Bead Tubes Type B
(Alternative : Type A)
Environ 14 min, à
pleine vitesse
Levures
MN Bead Tubes Type A
p.e., Saccharomyces cerevisiae
Environ 15 min, à
pleine vitesse
Champignons filamenteux
p.e., Aspergillus nidulans ;
Moisissure du melon ;
Moisissure des agrumes ;
Moisissure de la pomme de
terre
MN Bead Tubes Type D
Environ 15 min, à
pleine vitesse
Echantillon d’insectes
p.e., frais, congelé, séché ou
conservé à l’éthanol
MN Bead Tubes Type D
(Alternative : Type G)
Environ
12 – 20 min, à
pleine vitesse
Tissus riches en lipides
p.e., cerveau, tissu adipeux ou
tissu de poisson gras
MN Bead Tubes Type D
Environ 20 min, à
pleine vitesse
Bactéries provenant
d’échantillons d’insectes
MN Bead Tubes Type E
Environ 20 min, à
pleine vitesse
Durée et fréquence du broyage à l’aide d’un broyeur Retsch MM300
Echantillon
Tube de billes MN
Durée / ​
fréquence du
broyage
Bactéries Gram-négatives
p.e., Escherichia coli, Vibrio
fischeri
MN Bead Tubes Type B
(Alternative : Type A,)
Environ 6 min
30Hz
Bactéries Gram-positives
p.e., Bacillus subtilis,
Corynebacterium glutamicum
MN Bead Tubes Type B
(Alternative : Type A)
Environ 6 min
30Hz
Levures
MN Bead Tubes Type A
p.e., Saccharomyces cerevisiae
Environ 7 min
30 Hz
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
11
ADN de bactéries et de levures
Durée / ​
fréquence du
broyage
Echantillon
Tube de billes MN
Champignons filamenteux
p.e., Aspergillus nidulans ;
Moisissure du melon ;
Moisissure des agrumes ;
Moisissure de la pomme de
terre
MN Bead Tubes Type D
Environ 1 – 2 min
25 Hz
Echantillon d’insectes
p.e., frais, congelé, séché ou
conservé à l’éthanol
MN Bead Tubes Type D
(Alternative : Type G)
Environ 40 s,
20 Hz
Tissus riches en lipides
p.e., cerveau, tissu adipeux ou
tissu de poisson gras
MN Bead Tubes Type D
Environ 1 min
10 Hz suivi
d’environ 10 s,
20 Hz.
Note : Les tests de performance et de stabilité ont été effectués sur les MN Bead Tubes
Type A, B, C et D sur un Retsch® Mixer Mill MM300 à la fréquence la plus élevée (30 Hertz)
jusqu’à 15 minutes (Type A, B et C) ou jusqu’à 30 min (Type D). Pour un broyage optimal de
l’échantillon, éviter la fragmentation de l’ADN et obtenir le rendement d’ADN le plus élevé, voir
le tableau de recommandations ci-dessus pour les conditions de broyage adéquates. D’autres
dispositifs de broyage (voir par exemple le paragraphe 2.4.1) nécessiteront des paramètres
différents en ce qui concerne la fréquence et la durée pour une performance optimale avec le
matériel d’échantillonnage sélectionné. Veuillez noter que la position du tube dans la machine
(Retsch® Mixer Mill) est importante pour une performance optimale ! Veuillez consulter le manuel
d’instructions de l’appareil concerné.
AVERTISSEMENT : De nombreux dispositifs de broyage modernes peuvent provoquer un
apport d’énergie très élevé dans les tubes de billes. En fonction du type de tube de billes
et de son contenu (billes, volume de liquide, type d’échantillon), une fréquence d’agitation
particulièrement élevée et/ou une longue durée d’agitation peuvent entraîner la rupture des
tubes de billes ! Il incombe à l’utilisateur d’effectuer un test de stabilité initial pour les
tubes de billes utilisés dans les conditions d’utilisation !
Effectuer le test initial avec de l’eau au lieu du tampon de lyse et un paramètre modéré de
la machine (basse fréquence, courte durée) afin d’éviter le déversement du tampon de lyse
chaotropique en cas de rupture du tube. L’intégrité et l’étanchéité du tube doivent être
contrôlées après chaque essai.
AVERTISSEMENT : Au paragraphe 5 – 8, il est recommandé d’utiliser un certain volume de
liquide pendant le broyage. La réduction du liquide augmentera fortement l’impact mécanique
de la matrice de broyage et peut entraîner des dommages à l’ADN et au tube (en particulier si
les MN Bead Tubes Type D et E sont utilisés).
12
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
ADN de bactéries et de levures
MN 96 Bead Plate
Les recommandations suivantes ont été établies pour le Retsch® Mixer Mill MM300 fonctionnant
à la fréquence la plus élevée (30 Hertz). Pour l’utilisation d’autres dispositifs de broyage, et
d’autres matériaux d’échantillonnage, le temps et la fréquence doivent être optimisés.
Durée et fréquence du broyage à l’aide d’un broyeur Retsch® MM300
Durée / ​fréquence
du broyage
Echantillon
Plaque de 96 billes MN
Bactéries Gram-négatives
p.e., Escherichia coli, Vibrio
fischeri
MN 96 Bead Plate Type B
Environ 2 × 4 min*,
30 Hz
Bactéries Gram-positives
p.e., Bacillus subtilis,
Corynebacterium glutamicum
MN 96 Bead Plate Type B
Environ 2 × 4 min*,
30 Hz
Levures
MN 96 Bead Plate Type B
Environ 2 × 4 min*,
30 Hz
Echantillon d’insectes
p.e., frais, congele, seche ou
conserve a l’ethanol
MN 96 Bead Plate Type D
Environ 2 × 20 s*,
20 Hz
Champignons filamenteux
p.e., Aspergillus nidulans ;
Moisissure du melon ;
Moisissure des agrumes ;
Moisissure de la pomme de
terre
MN 96 Bead Plate Type D
Environ 2 × 1 min*,
20 Hz
Note : Les tests de performance et de stabilité ont été effectués sur la MN 96 Bead Plate
Types B et D sur un broyeur Retsch® MM300 à la fréquence la plus élevée (30 Hertz) pendant
une durée maximale de 15 minutes (types B et D). Pour un broyage optimal de l’échantillon,
éviter la fragmentation de l’ADN et obtenir le rendement d’ADN le plus élevé, voir le tableau de
recommandations ci-dessus pour des conditions de broyage adéquates. D’autres dispositifs
de broyage (voir paragraphe 2.4.1) nécessiteront des paramètres différents en ce qui concerne
la fréquence et la durée pour une performance optimale avec le matériel d’échantillonnage
sélectionné. Note : la position du tube dans la machine (Retsch® Mixer Mill) est importante pour
une performance optimale ! Veuillez consulter le manuel d’instructions de l’appareil concerné.
AVERTISSEMENT : De nombreux dispositifs de broyage modernes peuvent provoquer un
apport d’énergie très élevé sur la MN Bead 96 Plates. En fonction du type de plaque et de son
contenu (billes, volume de liquide, type d’échantillon), une fréquence d’agitation élevée et/ou
une longue durée d’agitation peuvent entraîner la rupture de tubes ou de plaques individuels !
Ne jamais utiliser la MN 96 Bead Plate avec moins de 12 barrettes de tubes. Il incombe
à l’utilisateur d’effectuer un test de stabilité initial pour les MN 96 Bead Plates utilisées
dans les conditions d’utilisation !
* Réorienter les plaques de 96 billes MN verticalement de 180° après le premier broyage. S’assurer que tous les puits
sont correctement scellés avant et après chaque broyage. Les échantillons qui étaient les plus proches du corps
de la machine doivent maintenant être les plus éloignés les uns des autres.
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
13
ADN de bactéries et de levures
Effectuer le test initial avec de l’eau au lieu du tampon de lyse et un paramètre modéré
de la machine (basse fréquence, courte durée) afin d’éviter le déversement du tampon
de lyse chaotropique en cas de rupture des tubes. L’intégrité et l’étanchéité du tube
doivent être contrôlées après chaque essai.
AVERTISSEMENT : Au paragraphe 5 – 8, il est recommandé d’utiliser un certain volume de
liquide pendant le broyage. La réduction du liquide augmentera fortement l’impact mécanique
de la matrice de broyage et peut entraîner des dommages à l’ADN et au tube (en particulier si
les MN Bead Tubes Type D et E sont utilisés).
2.5
Systèmes de séparation magnétique
Pour l’utilisation du NucleoMag® DNA Bacteria, il est recommandé d’utiliser le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. La séparation est effectuée dans un Square-well Blocks (voir
les informations de commande). Le kit peut également être utilisé avec d’autres séparateurs
courants.
Séparateur magnétique
Plaque ou tube de séparation
NucleoMag® SEP (MN REF 744900)
Square-well Block (MN REF 740481)
NucleoMag® SEP Mini (MN REF 744901)
Tubes de réaction de 1,5 mL ou 2 mL
(Sarstedt)
NucleoMag® SEP Maxi (MN REF 744902)
Tubes de 50 mL (Falcon)
NucleoMag® SEP 24 (MN REF 744903)
24 Square-well Blocks U-bottom (MN
REF 740448.4/.24)
Tecan Te-MagS™
Tubes de 1,5 mL sans couvercle (Sarstedt)
Séparation à aimants statiques
Les séparateurs avec aimants statiques, par exemple le NucleoMag® SEP ou d’autres
séparateurs magnétiques courants, conviennent à une utilisation manuelle et sur les stations de
travail de manipulation des liquides : Ce type de séparateur est recommandé en combinaison
avec un agitateur de microplaques approprié pour une remise en suspension optimale des
billes pendant les étapes de lavage et d’élution. Alternativement, les billes peuvent être remises
en suspension dans le tampon par pipetages successifs. Pour une utilisation entièrement
automatisée sur les stations de travail de manipulation des liquides, un bras manipulateur est
nécessaire ; la plaque est transférée vers le séparateur magnétique pour la séparation des billes
et transférée vers le module agitateur pour la remise en suspension des billes.
Systèmes magnétiques mobiles
Séparateurs à aimants mobiles : Les aimants / ​tiges magnétiques sont déplacés d’un côté à
l’autre du puits et vice versa. Les billes suivent ce mouvement et sont ainsi entraînées à travers
le tampon pendant les étapes de lavage et d’élution. La séparation a lieu lorsque le système
s’arrête.
Séparateurs automatisés
Séparateurs à aimants mobiles : Les billes magnétiques sont transférées dans des plaques ou
des tubes appropriés. Les billes sont remises en suspension à partir des aimants recouverts de
14
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
ADN de bactéries et de levures
protection. Après la fixation, le lavage ou l’élution, les billes sont à nouveau recueillies avec les
aimants recouverts de protection et transférées dans la plaque ou le tube suivant.
2.6
Réglage des paramètres d’agitation
Lors de l’utilisation d’un agitateur de plaques pour les étapes de lavage et d’élution, les
paramètres d’agitation doivent être réglés avec soin pour chaque plaque de séparation et
chaque agitateur afin d’éviter toute contamination croisée d’un puits à l’autre. Procéder comme
suit :
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour les étapes de fixation et de lavage :
•
Verser 1000 µL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque
sur l’agitateur et commencer à agiter avec un paramètre de vitesse modérée pendant 30
secondes. Éteindre l’agitateur et vérifier la présence de petites gouttelettes d’eau colorée
à la surface de la plaque.
•
Augmenter le paramètre de vitesse, agiter pendant 30 sets supplémentaires et vérifier à
nouveau la présence de gouttelettes à la surface de la plaque.
•
Continuez à augmenter la vitesse jusqu’à ce que vous observiez des gouttelettes sur le
dessus de la plaque de séparation. Réduisez le paramètre de vitesse, vérifiez à nouveau
et utilisez ce réglage pour l’étape de lavage.
Réglage de la vitesse de l’agitateur pour l’étape d’élution :
•
Charger 100 – 200 µL d’eau colorée dans les puits de la plaque de collecte et procéder
comme décrit ci-dessus.
2.7
Manipulation des billes magnétiques
Distribution des billes magnétiques
Une distribution homogène des billes magnétiques NucleoMag® B-Beads dans les différents
puits de la plaque de séparation est essentielle pour assurer une répétabilité d’un puits à
l’autre. Par conséquent, avant de distribuer les billes magnétiques, s’assurer qu’elles sont
complètement remises en suspension. Bien agiter le flacon de stockage ou le placer brièvement
sur un vortex. Lors de l’automatisation, une étape de mélange au préalable avant d’aspirer les
billes magnétiques est recommandée pour les garder remises en suspension.
Durée de séparation magnétique
L’attraction des billes magnétiques sur les aimants dépend de la force magnétique des aimants,
de la plaque de séparation choisie, de la distance entre la plaque de séparation et les aimants
et du volume à traiter. Les temps aimantation des billes magnétiques sur les aimants doivent
être vérifiés et ajustés sur chaque système. Il est recommandé d’utiliser les plaques ou tubes
de séparation spécifiés par le fournisseur du séparateur magnétique.
Lavage des billes magnétiques
Le lavage des billes magnétiques peut être réalisé par agitation ou par pipetage. Contrairement
au mélange par pipetages successifs, le mélange par agitateur ou magnétique permet de
mélanger simultanément tous les échantillons. Cela permet de réduire le temps et le nombre
de cônes nécessaires à la préparation. La remise en suspension par pipetages successifs est
cependant plus efficace que le mélange par agitation ou par mélange magnétique.
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
15
ADN de bactéries et de levures
Efficacité de
la remise en
suspension
Vitesse
Possibilité d’un
faible volume
d’élution
Nombre
de cônes
nécessaires
Mélange
magnétique
+
++
+
Faible
Agitateur
++
++
+++
Faible
Pipetage
+++
+*
++
Haut
Méthode
+ : acceptable, ++ : bon, +++ : excellent, * Dispositif de pipetage à 8 canaux
2.8
Procédures d’élution
L’ADN purifié peut être élué directement avec le tampon IME fourni. L’élution peut être effectuée
dans un volume ≥ 50 µL. Il est essentiel de recouvrir complètement les NucleoMag® B-Beads
de tampon IME pendant l’étape d’élution. Le volume de tampon IME distribué dépend du
système de séparation magnétique (p.e., la position du culot à l’intérieur de la plaque de
séparation). Pour une élution efficace, le culot de billes magnétiques doit être entièrement remis
en suspension dans le tampon IME. Pour certains séparateurs, des volumes d’élution plus
importants peuvent être nécessaires pour recouvrir la totalité du culot.
16
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
ADN de bactéries et de levures
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
•
Stocker le tampon IMB dès son arrivée à 4 °C.
•
La protéinase K liquide est prête à l’emploi. Après la première utilisation, conserver la
protéinase K liquide à 4 °C ou -20 °C.
•
La RNase A liquide est prête à l’emploi. Après la première utilisation, conserver la RNase
A liquide à 4 °C ou -20 °C.
•
Le stockage du tampon IML à une température inférieure à 20 °C peut entraîner la
précipitation des composants. Si une précipitation est observée, incuber le tampon à
30 – 40 °C pendant plusieurs minutes et bien mélanger jusqu’à dissolution complète du
précipité. Refroidir à température ambiante avant utilisation.
•
Tous les autres composants du kit doivent être conservés à température ambiante
(15 – 25 °C) et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le stockage à des
températures inférieures peut entraîner la précipitation de sels.
Avant de débuter une procédure NucleoMag®DNA Bacteria, préparer les éléments
suivants :
•
Tampon de lavage IMW : ajouter le volume indiqué d’éthanol (96 – 100 %) au tampon de
lavage IMW concentré. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que de l’éthanol a été
ajouté. Le tampon de lavage IMW peut être conservé à température ambiante pendant au
moins un an.
NucleoMag® DNA Bacteria
REF
Tampon de lavage
IMW (concentré)
1 × 96 preps
744310.1
4 × 96 preps
744310.4
50 mL
Ajouter 25 mL d’éthanol
200 mL
Ajouter 95 mL d’éthanol
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
17
ADN de bactéries et de levures
4
Instructions de sécurité
Il est toujours recommandé de suivre les règles de bonnes pratiques de laboratoire.
Portez des gants et des lunettes et suivez les instructions de sécurité du laboratoire.
AVERTISSEMENT : L’utilisation d’autres dispositifs de broyage tels que FastPrep® System
(MPBiomedicals), Precellys® (Bertin Technologies), MagNA™ Lyser (Roche), TissueLyser
(QIAGEN), Bullet Blender® (Next Advance), Mini-Beadbeater™ (Biospec Products), Speed Mill
(Analytik Jena), ou d’autres dispositifs similaires peut entraîner la destruction des tubes ou des
plaques de billes. De tels dispositifs de broyage peuvent provoquer un stress mécanique élevé
sur les tubes de billes ou les plaques de billes. En fonction du type de tube à billes/plaque à
billes et de son contenu (billes comme les billes d’acier, volume de liquide, type d’échantillon),
une fréquence d’agitation particulièrement élevée et/ou une longue durée d’agitation peuvent
entraîner la destruction des tubes de billes ou des plaques de billes. En cas d’utilisation d’un
tel dispositif de broyage, il incombe à l’utilisateur d’effectuer des tests de stabilité initiaux
pour garantir la stabilité des tubes ou des plaques de billes au cours de la configuration
du dispositif expérimental (p.e., intensité de l’agitation). Voir également le paragraphen
2.4.3 !
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® DNA Bacteria, portez des vêtements de
protection appropriés (p.e., blouse de laboratoire, gants jetables et lunettes de protection). Pour
plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles
en ligne sur www.mn-net.com/msds).
Les déchets générés par le kit NucleoMag®DNA Bacteria n’ont pas été testés pour détecter
la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du
matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement
dénaturant et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement exclue. Par
conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être
manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
18
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
NucleoMag® DNA Bacteria
5
Protocole d’extraction d’ADN à partir
d’échantillons de bactéries et de levures
5.1
Résumé du protocole utilisant les MN Bead Tubes Type B
Pour les exigences supplémentaires en matière d’équipement et de matériel, voir les paragraphes
1.2, 2.4.1 et 2.4.2 respectivement.
MN Bead Tubes Type A est recommandé pour un broyage optimal des culots de levure. MN
Bead Tubes Type D est recommandé pour un broyage optimal des champignons filamenteux.
Voir le paragraphe 2.4.3 pour de plus amples informations sur le broyage des échantillons.
Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir le paragraphe 5.2.
1
Préparer l’échantillon
< 40 mg de culot microbien (poids humide)
140 µL IME
2
Lyse de l’échantillon
Transférer l’échantillon dans un MN Bead Tubes
Type B
10 µL de protéinase K liquide
2,5 µL de RNase A liquide
Agiter sur un broyeur rotatif ou un dispositif
similaire 0,5 – 15 min
11.000 × g, 30 s
3
Ajuster les conditions
de fixation
460 µL IML
Vortex 3 s,
11.000 × g, 30 s
4
Fixation de l’ADN aux
NucleoMag® B-Beads
Jusqu’à 500 µL de lysat
24 µL NucleoMag® B-Beads
320 µL IMB
Mélanger en agitant pendant 5 min à TA.
(Optionnel : mélanger par pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 5 min de séparation.
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
19
NucleoMag® DNA Bacteria
5
Lavage avec le
tampon IMW
Retirer le Square-well Blocks du
NucleoMag® SEP
600 µL IMW
Remettre en suspension : Agiter 2 min à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages successifs)
Retirer le surnageant après 2 min de
séparation.
6
Lavage avec l’éthanol
à 80 %.
Retirer le Square-well Blocks du
NucleoMag® SEP
600 µL d’éthanol à 80 %.
Remettre en suspension : Agiter 2 min à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation
7
Lavage avec le
tampon à 80 %
d’éthanol
Retirer le Square-well Blocks sur le
NucleoMag® SEP
600 µL d’éthanol à 80 %.
Remettre en suspension : Agiter 2 min à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages successifs)
Retirer le surnageant
après 2 min de séparation.
8
20
Sécher les billes
10 min à TA
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
NucleoMag® DNA Bacteria
9
Eluer l’ADN
Retirer le Square-well Blocks du
NucleoMag® SEP
50‑200 µL IME
(Optionnel : élution à 56 °C)
Agiter 5 min à TA
(Optionnel : mélanger par pipetages successifs)
Séparer 2 min et transférer l’ADN dans une
plaque d’élution.
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
21
NucleoMag® DNA Bacteria
5.2
Protocole détaillé d’utilisation des MN Bead Tubes Type B
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple,
NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.5). Il est recommandé
d’utiliser un Square-well Block pour la séparation (voir paragraphe 2.5). ). L’extraction de l’ADN
peut également être réalisée dans des tubes de réaction avec des séparateurs magnétiques
appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de guide pour l’adaptation
du kit aux instruments robotisés.
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon IMW a été préparé conformément au paragraphe 3.
•
Les MN Bead Tubes Type A sont recommandés pour un broyage optimal des culots de
levure. Les MN Bead Tubes Type D sont recommandés pour un broyage optimal des
champignons filamenteux.
•
Voir le paragraphe 2.4.3 pour des informations supplémentaires concernant la durée et la
fréquence du broyage pour la lyse des échantillons.
1
Préparer l’échantillon
Récolter les cellules en culture par centrifugation. Jeter le surnageant.
Jusqu’à environ 40 mg de poids humide de culot de culture de cellules microbiennes
peuvent être utilisés comme échantillon.
Ajouter 140 µL de tampon IME et remettre le culot en suspension.
2
Lyse de l’échantillon
Transférer la suspension cellulaire dans un MN Bead Tubes Type B ou dans un autre
tube de billes ou plaque adapté au broyage des micro-organismes.
Ajouter 10 µL de protéinase K liquide, 2,5 µL de RNase A liquide et fermer le tube.
Agiter le MN Bead Tube Type B sur le MN Bead Tube Holder avec le Vortex-Genie®, le
broyeur rotatif ou un appareil similaire pendant 0,5 – 15 min (par exemple, 4 min pour le
MN Bead Tubes Holder).
Note : Veuillez vous référer au paragraphe 5.3 pour le broyage d’échantillons dans un
format de 96 puits.
Note : La durée, la vitesse et la fréquence optimales de l’agitation dépendent de
l’appareil utilisé. Pour le MN Bead Tube Holder, elle est d’environ 12 – 14 min ; dans
un broyeur mélangeur MM200, MM300, MM400 (Retsch®), p.e., 6 min à la fréquence
maximale (30 Hertz) conviennent (voir paragraphe 2.4.3). Sur un broyeur à balancier, la
position du tube dans le broyeur peut considérablement influencer le résultat. Veuillez
vous référer au manuel d’instructions de l’appareil utilisé. Respectez les avertissements
du paragraphe 1.2 et 2.4.3 si d’autres appareils sont destinés à être utilisés !
Centrifuger le MN Bead Tubes Type B pendant 30 s à 11 000 × g pour nettoyer le
couvercle.
Attention : Ne pas centrifuger à une force g supérieure, ni pendant plus de 30 s, car cela
pourrait endommager le tube de billes MN
22
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
NucleoMag® DNA Bacteria
3
Ajuster les conditions de fixation
Ajouter 460 µL de tampon IML et mélanger (p.e., vortexer pendant 3 s).
Note : Les billes de verre doivent être remises en suspension ; un culot résiduel (débris
cellulaires) peut rester au fond du tube.
Centrifuger pendant 30 s à 11.000 × g.
Note : Cette étape de centrifugation est effectuée afin de nettoyer le couvercle et de
sédimenter les billes de verre et les débris cellulaires.
4
Fixation de l’ADN aux NucleoMag® B-Beads
Transférer jusqu’à 500 µL de lysat dans un Square-well Block. Ajouter 24 µL de
NucleoMag® B-Beads et 320 µL de tampon de fixation IMB. Mélanger par pipetages
successifs 6 fois et agiter pendant 5 min à température ambiante. Alternativement,
lors de la procédure sans agitateur, pipeter de haut en bas 10 fois et incuber pendant
5 min à température ambiante.
Pipeter doucement afin d’éviter la formation de mousse. En cas d’utilisation de pipettes
électroniques, n’utiliser que 40 % du volume total comme volume de mélange.
Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer du flacon
de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une suspension
homogène se forme.
Séparer les billes magnétiques contre la paroi des puits en plaçant le Square-well Block
sur le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 5 min jusqu’à ce que
toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant à l’aide
d’une pipette.
Note : Ne pas perturber les culots de billes attirés lors de l’aspiration du surnageant.
Le culot de billes peut ne pas être visible lors de cette étape. Prélever le surnageant de
l’autre côté du puits.
5
Lavage avec le tampon
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 µL de tampon IMW dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension
(1 – 3 min). Il est également possible de remettre les billes en suspension en les pipetant
successifs de haut en bas.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 – 5 min jusqu’à ce que toutes les
billes aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
23
NucleoMag® DNA Bacteria
6
Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 µL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension
(1 – 3 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par
pipetages successifs.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
7
Lavage avec le tampon à 80 % d’éthanol
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Ajouter 600 µL d’éthanol à 80 % dans chaque puits et remettre les billes en suspension
en agitant jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension
(1 – 3 min). Alternativement, remettre les billes en suspension complètement par
pipetages successifs.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
aient été attirées par l’aimant. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
8
Sécher les billes magnétiques à l’air libre
Retirer le Square-well Block du séparateur magnétique NucleoMag® SEP.
Sécher à l’air les billes magnétiques pendant 10 à 15 min à température ambiante.
9
Eluer l’ADN
Ajouter le volume désiré de tampon IME (50 – 200 µL) à chaque puits du Square-well
Block et remettre les billes en suspension en agitant pendant 5 min à température
ambiante. Il est également possible de remettre les billes en suspension par pipetages
successifs et de les incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante ou à 56 °C.
Séparer les billes magnétiques en plaçant le Square-well Block sur le séparateur
magnétique NucleoMag® SEP. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes
soient attirées par les aimants. Transférer le surnageant contenant l’ADN purifié sur une
plaque d’élution appropriée.
24
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
NucleoMag® DNA Bacteria
5.3
Protocole détaillé d’utilisation de la MN 96 Bead Plate
Types B
Ce protocole est conçu pour les séparateurs magnétiques à aimants statiques (par exemple,
NucleoMag® SEP) et les agitateurs de plaques adaptés (voir paragraphe 2.5). Il est recommandé
d’utiliser un Square-well Block pour la séparation (voir paragraphe 2.5). L’extraction de l’ADN
peut également être réalisée dans des tubes de réaction avec des séparateurs magnétiques
appropriés. Ce protocole est destiné à une utilisation manuelle et sert de guide pour l’adaptation
du kit aux instruments robotisés.
•
1
Pour les exigences concernant les besoins en matériel, voir les paragraphes 2.4.1 et
2.4.2.
Préparer l’échantillon
Placer des échantillons individuels d’insectes dans chaque puits de la MN 96 Bead Plate
Type B.
Centrifuger la MN 96 Bead Plate B brièvement pendant 1 seconde afin de concentrer
les billes au fond.
Il est possible de traiter jusqu’à environ 40 mg de poids humide. Retirer l’excès de
liquide (p.e., milieu de croissance) de l’échantillon.
Ajouter 140 µL de tampon IME à chaque échantillon.
2
Lyse de l’échantillon
Ajouter 10 µL de protéinase K liquide, 2,5 µL de RNase A liquide et fermer
hermétiquement les barrettes de tubes avec les barrettes de bouchons.
Agiter la MN 96 Bead Plate Types B sur un broyeur rotatif ou un dispositif similaire
pendant 2 × 0,5 – 5 min à 30 Hertz.
Note : Réorienter les MN 96 Bead Plates verticalement de 180° après le premier
broyage. Les échantillons qui étaient les plus proches du point central de la machine
doivent maintenant être les plus éloignés les uns des autres. S’assurer que chaque puits
est correctement scellé avant et après chaque broyage.
Note : La durée, la vitesse et la fréquence optimales de l’agitation dépendent de l’appareil
utilisé. Pour le broyeur-mélangeur MM300 (Retsch®), p.e., 2 × 4 min à la fréquence
maximale (30 Hertz) conviennent (voir paragraphe 2.4.3). Sur un broyeur à balancier, la
position du tube dans le broyeur peut considérablement influencer le résultat. Veuillez
vous référer au manuel d’instructions de l’appareil utilisé. Respectez les avertissements
du paragraphe 1.2 et 2.4.3 si d’autres appareils sont destinés à être utilisés !
Centrifuger la MN 96 Bead Plate B pendant 5 min à 2.000 × g pour nettoyer le couvercle.
Attention : Ne pas centrifuger à une force g supérieure, ni pendant plus de 30 s, car cela
pourrait endommager la MN 96 Bead Plate.
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
25
NucleoMag® DNA Bacteria
3
Ajuster les conditions de fixation
Ajouter 460 µL de tampon IML, sceller les barrettes de 8 bouchons et mélanger (p.e.
vortexer pendant 10 s ou par inversion).
Note : Les billes d’acier doivent être agitées dans le tube ; quelques culots résiduels
(débris cellulaires) peuvent rester au fond du tube.
Centrifuger pendant 5 min à 2.000 × g.
Note : Cette étape de centrifugation est effectuée afin de nettoyer le couvercle et de
sédimenter les billes d’acier et les débris cellulaires.
Attention : Ne pas centrifuger à une force g supérieure, ni pendant plus de 30 s, car cela
pourrait endommager la MN 96 Bead Plate.
4
Fixation de l’ADN aux NucleoMag® B-Beads
Transférer jusqu’à 500 µL de lysat dans un Square-well Block. Éviter d’aspirer les
débris cellulaires.
Note : Les barrettes de tubes individuelles peuvent être retirées du rack de barrettes de
tubes, ce qui facilite l’accès pour l’aspiration du surnageant.
Ajouter 24 µL de NucleoMag® B-Beads et 320 µL de tampon de fixation IMB.
Mélanger en pipetant de haut en bas 6 fois et agiter pendant 5 min à température
ambiante. Alternativement, lors de la procédure du kit sans agitateur, pipeter de haut en
bas 10 fois et incuber pendant 5 min à température ambiante.
Pipeter doucement afin d’éviter la formation de mousse. En cas d’utilisation de pipettes
électroniques, n’utiliser que 40 % du volume total comme volume de mélange.
Veiller à remettre en suspension les NucleoMag® B-Beads avant de les retirer du flacon
de stockage. Vortexer brièvement le flacon de stockage jusqu’à ce qu’une suspension
homogène se forme.
5
26
Passer à l’étape 5 du protocole détaillé pour l’extraction de l’ADN des micro-organismes
(voir paragraphe 5.2).
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
ADN de bactéries et de levures
6
Annexes
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possibles et suggestions
Broyage mécanique insuffisant de l’échantillon
•
Pour la plupart des sources d’échantillons, nous
recommandons un broyage mécanique avec les
tubes de billes MN spécialisés sur le support MN
Bead Tubes Holder ou avec d’autres broyeurs du
commerce. Voir les paragraphes 2.4.1 et 2.4.2 pour
d’autres recommandations.
Extraction insuffisante des acides nucléiques lors de la lyse
•
Pour obtenir des rendements plus élevés d’acides
nucléiques, une incubation supplémentaire de 10 min
à 56 °C peut être effectuée avant le traitement
mécanique.
L’échantillon contient trop d’ARN
•
Faible rendement en ADN
Ajouter 2,5 µL de RNase A liquide après la lyse
mécanique. En cas d’échec, ajouter l’enzyme au
lysat clarifié et incuber pendant 10 min à température
ambiante.
Volume de tampon d’élution insuffisant
•
Le culot de billes doit être entièrement recouvert de
tampon IME.
Performance insuffisante du tampon d’élution pendant
l’étape d’élution
•
Éliminer complètement les tampons résiduels lors
des étapes de séparation. Les tampons résiduels
diminuent l’efficacité des étapes de lavage et d’élution
suivantes.
Aspiration d’une partie des billes présents sur l’aimant
•
Ne pas perturber les billes sur l’aimant lors de
l’aspiration du surnageant, en particulier lorsque le
culot magnétique n’est pas visible dans le lysat.
Aspiration et perte de billes
•
Durée de séparation magnétique trop courte ou
vitesse d’aspiration trop élevée.
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
27
ADN de bactéries et de levures
Problème
Causes possibles et suggestions
Procédure de lavage insuffisante
Pureté insuffisante / ​Faible
sensibilité
•
Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de
séparateur et de plaque, par exemple, Square-well
Blocks en combinaison avec NucleoMag® SEP.
•
S’assurer que les billes sont remises en suspension
complètement pendant la procédure de lavage. Si
l’agitation n’est pas suffisante pour remettre les billes
en suspension complètement, mélanger en effectuant
des pipetages successifs.
•
Répéter l’étape de lavage avec le tampon de lavage
IMW
Procédure de lavage insuffisante
Mauvaise performance de
l’ADN lors des applications
avales
•
Utiliser uniquement les combinaisons appropriées de
séparateur et de plaque, par exemple, Square-well
Blocks en combinaison avec NucleoMag® SEP.
•
S’assurer que les billes sont remises en suspension
complètement pendant la procédure de lavage. Si
l’agitation n’est pas suffisante pour remettre les billes
en suspension complètement, mélanger en effectuant
des pipetages successifs.
•
Répéter l’étape de lavage avec le tampon de lavage
IMW.
Élimination de l’éthanol des tampons de lavage
•
Veillez à éliminer toute la solution de lavage
éthanolique, car l’éthanol résiduel interfère avec les
applications en aval.
Évaporation de l’éthanol des tampons de lavage
•
Fermer hermétiquement les flacons de tampons, éviter
l’évaporation de l’éthanol des flacons de tampons ainsi
que des tampons remplis dans les réservoirs. Ne pas
réutiliser les tampons des réservoirs de tampons.
Durée de séparation magnétique trop courte
•
Perte des billes
Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution)
•
28
Augmenter la durée de séparation pour permettre aux
billes d’être complètement attirées par les aimants
avant d’aspirer tout liquide du puits.
Une vitesse d’aspiration élevée pendant l’étape
d’élution peut entraîner une perte des billes. Réduire la
vitesse d’aspiration pour l’étape d’élution.
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
ADN de bactéries et de levures
Problème
Causes possibles et suggestions
Contaminations des parties supérieures des puits
•
Contamination croisée
6.2
Ne pas souiller les bords du Square-well Blocks
lors du transfert du lysat. Si le bord des puits est
contaminé, sceller le Square-well Block avec une
feuille PE auto-adhésive (voir les informations de
commande) avant de démarrer l’agitateur.
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoMag® DNA Bacteria
744310.1
744310.4
1 × 96 preps
4 × 96 preps
MN Bead Tube Type A
(billes en céramique de 0,6 – 0,8 mm,
recommandées pour la levure, le sol et les
sédiments)
740786.50
50
MN Bead Tube Type B
(billes de verre de 40 à 400 µm, recommandées
pour les bactéries)
740812.50
50
MN Bead Tube Type D
(billes d’acier de 3 mm, recommandées pour les
insectes)
740814.50
50
MN Bead Tube Type E
(billes de verre de 40 à 400 µm et billes d’acier de
3 mm, recommandées pour les bactéries difficiles
à lyser dans les échantillons d’insectes)
740815.50
50
MN Bead Tube Type G
billes d’acier de 5 mm, recommandées pour le
matériel végétal)
740817.50
50
MN Bead Tube Holder
740469
(Support de tubes pour l’instrument Vortex-Genie®
et une plateforme de 3 pouces afin de loger
jusqu’à 12 tubes de billes MN)
MN 96 Bead Plate Type A
(Rack de barrettes de tubes préremplis
(8 × 12) contenant des billes de céramique de
0,6 – 0,8 mm ; utilisation avec un système de
broyage)
740853.4
740853.24
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
1
4
24
29
ADN de bactéries et de levures
Produit
REF
Conditionnement
MN 96 Bead Plate Type B
(Rack de barrettes de tubes préremplis (8 × 12)
contenant des billes de verre de 40 – 400 µm ;
utilisation avec un système de broyage)
740851.4
740851.24
4
24
MN 96 Bead Plate Type D
(Rack de barrettes de tubes préremplis (8 × 12)
contenant des billes d’acier de 3 mm ; utilisation
avec un système de broyage)
740853.4
740853.24
4
24
Protéinase K liquide
740396
5 mL
®
744900
1
®
NucleoMag SEP Mini
744901
1
NucleoMag® SEP Maxi
744902
1
®
NucleoMag SEP 24
744903
1
Square-well Blocks
740481
740481.24
4
24
Film PE auto-adhésif
740676
50 feuilles
Plaque d’élution à fond en U (microplaque de
96 puits de 0,3 mL avec des puits à fond en U de
300 µL)
740486.24
24
KingFisher® 96/Flex Accessory Kit A
(set composé de 16 Square-well Blocks, 4
Deep-well tip combs, 4 Elution Plates ; pour 4 ×
96 NucleoMag® DNA Bacteria preps utilisant la
plateforme KingFisher® 96/Flex)
744950
1 set
Kit d’accessoires KingFisher® DUO (8 Squarewell Blocks, 8 Tip Combs, 8 Barrettes d’élution ;
pour 8 × 12 NucleoMag®DNA Bacteria preps
en utilisant la plateforme KingFisher® DUO/DUO
Prime.
744952
1 set
96 Deep-well plates pour systèmes de barreaux
magnétiques
744955
25
8-well Tip Combs pour système de barreaux
magnétiques
744960
50
8-well Accessory Kit pour systèmes de barreaux
magnétiques
744961
1 set
NucleoMag SEP
Visitez le site www.mn-net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le produit.
30
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
ADN de bactéries et de levures
6.3
Restriction d’utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils
ne sont pas destinés à être utilisés à d’autres fins. La description de l’utilisation prévue des
produits se trouve dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser
nos produits, veuillez respecter les instructions d’utilisation et les consignes de sécurité de la
fiche de données de sécurité respective du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL est accompagné d’une documentation indiquant les
spécifications et autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit qu’il répond aux
spécifications indiquées. La garantie fournie est limitée aux spécifications des données et aux
descriptions figurant dans la documentation originale de MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre
déclaration ou représentation, écrite ou orale, par les employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL, à l’exception des déclarations écrites signées par un responsable dûment
autorisé de MACHEREY‑NAGEL, n’est autorisée. Le consommateur ne doit pas s’y fier et elles
ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenus en rapport avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de
MACHEREY‑NAGEL dans leur dernière édition, qui peuvent être consultées sur le site Web de
l’entreprise. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leurs applications sont susceptibles d’être modifiés. Par conséquent, veuillez
contacter notre équipe de service technique pour obtenir les dernières informations sur les
produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre distributeur local pour
obtenir des informations scientifiques générales. Les descriptions figurant dans la documentation
de MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement.
Dernière mise à jour : 08/2022, Rév. 04
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Te-MagS™ est une marque déposée de Tecan Group Ltd., Switzerland
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Precellys® est une marque déposée de Bertin Technologies
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Bullet Blender® est une marque déposée de Next Advance
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Tous les noms et dénotations utilisés peuvent être des marques, des marques commerciales ou des marques
déposées de leur propriétaire respectif. En ce qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons donner
aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur fonctionnement.
MACHEREY-NAGEL – 05/2024, Rev. 03
31
Plasmid DNA
Clean up
RNA
DNA
Viral RNA and DNA
Protein
High throughput
Accessories
Auxiliary tools
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