Macherey-Nagel NucleoSpin Plasmid (NoLid), Mini kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
Moléculaire
Bioanalysis
User manual
Manuel
d’utilisation
Purification d’ADN plasmidique
n NucleoSpin® Plasmid
n NucleoSpin® Plasmid (NoLid)
Mars 2023 / Rev. 14
www.mn-net.com
www.mn-net.com
Purification d’ADN plasmidique
Résumé du protocole (Rev. 14)
NucleoSpin®
Plasmid
1
NucleoSpin®
Plasmid (NoLid)
Culture
et collecte des
bactéries
11,000 x g,
30 s
2
Lyse des cellules
250 μL Tampon A1
250 μL Tampon A2
TA, jusqu’à 5 min
300 μL Tampon A3
3
Clarification du
lysat
11,000 x g,
5–10 min
4
Fixation de l’ADN
Charger le surnageant
11,000 x g,
1 min
5
Lavage de la membrane de silice
(Optionnel:
500 μL Tampon AW:
TA ou 50 °C)
600 μL Tampon A4
11,000 x g,
1 min
6
Séchage de la
membrane de silice
11,000 x g,
2 min
7
Elution de l’ADN
50 μL Tampon AE
TA, 1 min
11,000 x g,
1 min
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.: +49 24 21 969-333 · support@mn-net.com · www.mn-net.com
Purification d’ADN plasmidique
Sommaire
1 Composition
4
1.1 Composants des kits
4
1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
6
1.3 À propos de ce manuel
6
2 Description
7
2.1 Principe général
7
2.2 Caractéristiques des kits
7
2.3 Croissance des cultures bactériennes
8
2.4 Neutralisation du lysat et LyseControl
10
2.5 Procédures d’élution
10
3 Conditions de stockage et préparation des solutions de travail
11
4 Instructions de sécurité
12
4.1 Élimination des déchets
®
5 Protocoles NucleoSpin Plasmid / ​Plasmid (NoLid)
12
13
5.1 Purification de l’ADN plasmidique high copy chez E. coli
13
5.2 Purification de plasmides low copy, de constructions P1 ou de cosmides
15
5.3 Purification de plasmides à partir de bactéries Gram positif
17
5.4 Clean-up d’ADN plasmidique
18
6 Annexes
19
6.1 Guide de résolution des problèmes
19
6.2 Informations de commande
22
6.3 Références
22
6.4 Restrictions de l’utilisation / ​garantie
23
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
3
Purification d’ADN plasmidique
1
Composition
1.1
Composants des kits
NucleoSpin® Plasmid
10 preps
740588.10
50 preps
740588.50
250 prep.
740588.250
Tampon de resuspension A1
5 mL
15 mL
75 mL
Tampon de lyse A2
5 mL
15 mL
100 mL
Tampon de neutralisation A3
5 mL
20 mL
100 mL
Tampon de lavage AW
6 mL
30 mL
2 × 75 mL
Tampon de lavage A4
(concentré)*
6 mL
12 mL
2 × 25 mL
Tampon d’élution AE**
13 mL
13 mL
60 mL
RNase A (lyophilisée)*
2,5 mg
6 mg
30 mg
Colonnes NucleoSpin
Plasmid (anneaux blancs)
10
50
250
Tubes collecteurs (2 mL)
10
50
250
Manuel d’utilisation
1
1
1
REF
®
* Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3.
** Composition du tampon d’élution AE : 5 mM Tris/HCl, pH 8,5
4
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
Purification d’ADN plasmidique
Composants des kits suite
NucleoSpin® Plasmid (NoLid)
10 preps
740499.10
50 preps
740499.50
250 prep.
740499.250
Tampon de resuspension A1
5 mL
15 mL
75 mL
Tampon de lyse A2
5 mL
15 mL
100 mL
Tampon de neutralisation A3
5 mL
20 mL
100 mL
Tampon de lavage AW
6 mL
30 mL
2 × 75 mL
Tampon de lavage A4 (concentré)*
6 mL
12 mL
2 × 25 mL
Tampon d’élution AE**
13 mL
13 mL
60 mL
RNase A (lyophilisée)*
2,5 mg
6 mg
30 mg
Colonnes NucleoSpin® Plasmid
(NoLid) (anneaux blancs)
10
50
250
Tubes collecteurs (2 mL)
10
50
250
Manuel d’utilisation
1
1
1
REF
* Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3.
** Composition du tampon d’élution AE : 5 mM Tris/HCl, pH 8,5
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
5
Purification d’ADN plasmidique
1.2
Réactifs, consommables et équipements à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
96 – 100 % d’éthanol
Consommables
•
Microtubes de 1,5 mL pour la lyse des échantillons et l’élution de l’ADN
•
Cônes de pipette jetables
Equipement
•
Pipettes manuelles
•
Centrifugeuse pour microtubes
•
Vortex
•
Bloc chauffant (NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid) : pour les grandes constructions
ou pour le tampon de lavage AW en option)
•
Équipements de protection individuelle (blouse, gants, lunettes)
1.3
À propos de ce manuel
Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs de lire attentivement le manuel
d’utilisation NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid) avant d’utiliser les kits. Les utilisateurs
expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Ce dernier est conçu
uniquement pour un suivi rapide des différentes étapes de la procédure.
Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante :
www.mn-net.com. Veuillez consulter le site web de MACHEREY‑NAGEL pour vérifier que vous
utilisez la dernière version du manuel d’utilisation.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au manuel d'utilisation actuel par rapport aux révisions précédentes.
6
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
Purification d’ADN plasmidique
2
Description
2.1
Principe général
Avec le kit NucleoSpin® Plasmid, les culots de bactéries sont remis en suspension (tampon
A1) et l’ADN plasmidique est libéré des cellules E. coli par lyse SDS / ​alcaline (tampon A2). Le
tampon A3 neutralise le lysat obtenu et permet de créer les conditions appropriées pour la
fixation de l’ADN plasmidique à la membrane de silice de la colonne NucleoSpin® Plasmid / ​
Plasmid (NoLid). Les protéines précipitées, l’ADN génomique et les débris cellulaires sont
ensuite éliminés par centrifugation. Le surnageant est chargé sur une colonne NucleoSpin®
Plasmid / ​Plasmid (NoLid).
Avec le kit NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid), les contaminations telles que les sels, les
métabolites et les composants cellulaires macromoléculaires solubles sont éliminées par un
simple lavage avec le tampon éthanolique A4. L’ADN plasmidique pur est finalement élué dans
des conditions de faible force ionique avec le tampon AE légèrement alcalin (5 mM Tris HCl,
pH 8,5). En cas d’utilisation de souches hôtes à forte teneur en nucléases, il est recommandé
de procéder à une étape de lavage supplémentaire avec le tampon AW préchauffé. Un lavage
supplémentaire avec le tampon AW permet également d’augmenter la longueur de lecture des
réactions de séquençage automatisé par fluorescence.
2.2
Caractéristiques des kits
•
Le kit NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid) est conçu pour la préparation rapide et à
petite échelle d’ADN plasmidique très pur (mini preps).
•
Les colonnes NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid) offrent une capacité de fixation
d’ADN très élevée, allant jusqu’à 60 μg. Cela nécessite toutefois des lavages efficaces
dont le lavage avec le tampon AW qui est fortement recommandé pour les souches hôtes
présentant des niveaux élevés d’endonucléases comme ABLE, HB101 ou JM110.
•
L’ADN plasmidique préparé avec NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid) est adapté à
des applications telles que le séquençage automatisé de l’ADN par fluorescence, la PCR
ou tout type de réaction enzymatique.
•
De plus, les protocoles additionnels permettent la purification de plasmides low copy
à partir de volumes de culture plus importants, la purification de plasmides à partir de
bactéries Gram-positif et la purification de plasmides à partir de mélanges réactionnels.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
7
Purification d’ADN plasmidique
Tableau 1: Résumé des caractéristiques du kit
Paramètres
NucleoSpin® Plasmid/ ​Plasmid (NoLid)
Utilisation
Réservée à l’usage de la recherche
Volume de culture
1 – 5 mL (high copy)
6 – 10 mL (low copy)
Rendement typique
< 25 μg (1 – 5 mL de culture) < 45 μg (6 – 10 mL de culture)
Volume d’élution
50 μL
Capacité de fixation
60 μg
Vecteurs
< 25 kbp
Temps de préparation*
20 min / ​6 préparations
Format
Mini colonne à centrifuger
2.3
Croissance des cultures bactériennes
Le rendement et la qualité de l’ADN plasmidique dépendent fortement du type de milieu de
culture et des antibiotiques utilisés, de la souche bactérienne hôte, du type de plasmide, de sa
taille ou du nombre de copies.
Pour la culture de cellules bactériennes contenant des plasmides high copy, nous
recommandons le milieu LB (Luria Bertani). La culture cellulaire doit être incubée à 37 °C sous
agitation constante (200 – 250 rpm) de préférence 12 – 16 h pendant la nuit. En général, une
densité optique de 3 à 6 peut être obtenue. Il est également possible d’utiliser des milieux riches
tels que 2 x YT (Yeast / ​Tryptone), TB (Terrific Broth) ou CircleGrow. Dans ce cas, les bactéries
se développent plus rapidement, atteignent la phase stationnaire beaucoup plus tôt que dans
le milieu LB (≤ 12 h), et une masse cellulaire plus élevée peut être atteinte. Toutefois, cela ne
permet pas nécessairement d’obtenir plus d’ADN plasmidique. La croissance excessive d’une
culture peut entraîner un pourcentage plus élevé de mort cellulaire et l’ADN plasmidique obtenu
peut être partiellement dégradé ou contaminé par de l’ADN chromosomique. Pour trouver les
conditions de culture optimales, le milieu de culture et les durées d’incubation doivent être
optimisés pour chaque combinaison plasmide/souche hôte.
Les cultures cellulaires doivent toujours être soumises à une sélection antibiotique afin d’assurer
la propagation des plasmides. Sans cette pression sélective, les cellules ont tendance à perdre
le plasmide lors de la division cellulaire. Comme les bactéries se développent beaucoup
plus rapidement sans plasmide high copy, celles-ci envahissent rapidement la culture et le
rendement en plasmides diminue, quelle que soit la masse cellulaire. Le Tableau 2 donne des
informations sur les concentrations des antibiotiques couramment utilisés.
* Temps d’intervention
8
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
Purification d’ADN plasmidique
Tableau 2: Informations sur les antibiotiques selon Maniatis*
Antibiotique
Solution mère
(concentration)
Stockage
Concentration de
travail
Ampicilline
50 mg/mL dans H2O
-20 °C
20 – 50 μg/mL
Carbénicilline
50 mg/mL dans H2O
-20 °C
20 – 60 μg/mL
Chloramphénicol
34 mg/mL dans
EtOH
-20 °C
25 – 170 μg/mL
Kanamycine
10 mg/mL dans H2O
-20 °C
10 – 50 μg/mL
Streptomycine
10 mg/mL dans H2O
-20 °C
10 – 50 μg/mL
Tétracycline
5 mg/mL dans EtOH
-20 °C
10 – 50 μg/mL
En règle générale, utiliser 5 mL d’une culture pour les colonnes NucleoSpin® Plasmid / ​
Plasmid (NoLid) comme indiqué dans les caractéristiques du kit.
Toutefois, le volume de culture peut être augmenté si la croissance cellulaire est vraiment faible
ou doit être réduit si, par exemple, des milieux de culture très riches ont été utilisés. Se référer
au Tableau 3 pour déterminer le volume de culture optimal en fonction de la densité optique
à D0₆₀₀.
Tableau 3: Volumes de culture recommandés pour NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid
(NoLid)
DO600
1
2
3
4
5
6
Volume de culture (high copy)
15 mL
8 mL
5 mL
4 mL
3 mL
2 mL
Volume de culture (low copy)**
-
-
10 mL
8 mL
6 mL
4 mL
Note : si une trop grande quantité de matériel bactérien est utilisée, les étapes de lyse et de
précipitation deviennent inefficaces, ce qui entraîne une diminution du rendement et de la qualité
du plasmide ! Si la quantité de cellules à traiter est supérieure à la quantité recommandée, se
référer au protocole pour la purification des low copy (paragraphe 5.2).
* Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J : Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring,
New York 1982.
** Suivre la procédure pour les plasmides low copy, voir paragraphe 5.2.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
9
Purification d’ADN plasmidique
2.4
Neutralisation du lysat et LyseControl
Le mélange du lysat avec le tampon de neutralisation A3 est très important pour une précipitation
complète du SDS, des protéines et de l’ADN génomique. Une neutralisation incomplète entraîne
une diminution du rendement. Cependant, l’ADN plasmidique libéré est très vulnérable à ce
stade et une agitation trop importante ou trop forte peut endommage l’ADN.
Par conséquent, ne pas agiter ni vortexer, mais simplement mélanger par inversion et très
doucement jusqu’à ce qu’un précipité cotonneux blanchâtre se soit formé et que le LyseControl
bleu du tampon A2 soit devenu incolore dans tout le lysat sans aucune trace de coloration
bleue.
2.5
Procédures d’élution
Le volume du tampon d’élution et la méthode peuvent être adaptés afin d’obtenir un rendement
et/ou une concentration plus élevés que la méthode standard (taux de récupération d’environ
70 – 90 %) :
•
Rendement plus élevé en général, en particulier pour les grandes constructions :
Chauffer le tampon d’élution à 70 °C, ajouter 50 – 100 μL à la colonne NucleoSpin®
Plasmid / ​Plasmid (NoLid) et incuber à 70 °C pendant 2 min.
•
Rendement élevé : Effectuer deux étapes d’élution avec le volume indiqué dans le
protocole individuel. Environ 90 à 100 % des acides nucléiques liés peuvent être élués.
•
Concentration élevée : Effectuer une étape d’élution avec 60 % du volume indiqué dans
le protocole individuel. La concentration d’ADN sera plus élevée qu’avec l’élution standard
(environ 130 %). Le rendement maximal des acides nucléiques liés est d’environ 80 %.
•
Rendement et concentration élevés : Appliquer la moitié du volume de tampon
d’élution indiqué dans le protocole standard, incuber pendant 3 minutes et centrifuger.
Appliquer une deuxième aliquote de tampon d’élution. Incuber et centrifuger à nouveau.
Ainsi, environ 85 à 100 % des acides nucléiques liés sont élués dans le volume d’élution
standard avec une concentration élevée.
Le tampon d’élution AE (Tris/HCl 5 mM, pH 8,5) peut être remplacé par du tampon TE ou de
l’eau. Toutefois, nous recommandons d’utiliser un tampon faiblement tamponné, légèrement
alcalin et ne contenant pas d’EDTA, en particulier si l’ADN plasmidique est destiné à des
réactions de séquençage. Si de l’eau est utilisée, le pH doit être vérifié et ajusté à 8,0 – 8,5
car l’eau désionisée présente généralement un pH inférieur à 7. De plus, l’absorption de CO₂
entraîne une diminution du pH des solutions non tamponnées.
10
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
Purification d’ADN plasmidique
3
Conditions de stockage et préparation des
solutions de travail
Attention : Les tampons A3 et AW contiennent du chlorhydrate de guanidine ! Porter des gants
et des lunettes de protection !
ATTENTION : Les tampons A3 et AW contiennent du chlorhydrate de guanidine qui peut
former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite
de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de
préparation d’échantillons.
•
Tous les composants du kit peuvent être conservés entre 15 et 25 °C et sont stables
jusqu’à : voir l’étiquette de l’emballage.
•
Les flacons de tampons doivent toujours être bien fermés, surtout si les tampons sont
préchauffés pendant la préparation.
•
Le dodécylsulfate de sodium (SDS) contenu dans le tampon A2 peut précipiter s’il est
conservé à des températures inférieures à 20 °C. Si un précipité est observé dans le
tampon A2, incuber le flacon à 30 – 40 °C pendant plusieurs minutes et bien mélanger.
Avant de commencer le protocole NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid), préparer les
éléments suivants :
•
Ajouter 1 mL de tampon A1 au flacon de RNase A et mélanger au vortex. Transférer la
solution dans le flacon de tampon A1 et mélanger soigneusement. Indiquer la date d’ajout
de la RNase A sur le flacon. Conserver le tampon A1 contenant la RNase A à 4 °C. La
solution sera stable à cette température pendant au moins six mois.
•
Ajouter le volume indiqué d’éthanol à 96 – 100 % au tampon A4.
NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid)
REF
10 preps
740588.10 / ​
740499.10
50 preps
740588.50 / ​
740499.50
250 preps
740588.250 / ​
740499.250
Tampon de
lavage A4
(concentré)
6 mL
Ajouter 24 mL
d’éthanol
12 mL
Ajouter 48 mL
d’éthanol
2 × 25 mL
Ajouter 100 mL
d’éthanol dans
chaque flacon
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
11
Purification d’ADN plasmidique
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® Plasmid/Plasmid (NoLid), portez des
vêtements de protection appropriés (par exemple, une blouse de laboratoire, des gants jetables
et des lunettes de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de
sécurité appropriées (les FDS sont disponibles en ligne à l’adresse www.mn-net.com/msds).
ATTENTION : Le chlorhydrate de guanidine dans les tampons A3 et AW peut former des
composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, ne pas
ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets liquides issus de la
procédure.
Les déchets générés par le kit NucleoSpin® Plasmid/Plasmid (NoLid) n’ont pas été testés
pour la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du
matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du traitement par du tampon
de lyse fortement dénaturant, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les
déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés
conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Élimination des déchets
Éliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sûre et conforme aux dispositions réglementaires locales.
12
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
NucleoSpin® Plasmid / Plasmid (NoLid)
5
Protocoles NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid
(NoLid)
5.1
Purification de l’ADN plasmidique high copy chez E. coli
Avant de commencer la préparation :
•
1
Vérifier que le tampon de lavage A4 a été préparé conformément au chapitre 3.
Récolte des cellules bactériennes cultivées
Utiliser 1 à 5 mL d’une culture LB saturée d’E. coli, récolter
les cellules dans une centrifugeuse de paillasse standard
pendant 30 s à 11 000 x g. Jeter le surnageant et éliminer
autant de liquide que possible.
Note : Pour la purification des plasmides low copy, se référer
au paragraphe 5.2.
2
11 000 x g,
30 s
Lyse des cellules
Ajouter 250 μL de tampon A1. Remettre complètement
en suspension le culot cellulaire au vortex ou par pipetages
successifs. S’assurer qu’il ne reste pas d’amas de cellules
avant d’ajouter le tampon A2 !
Attention : Vérifier que le tampon A2 ne contient pas de SDS
précipité avant de l’utiliser. Si un précipité blanc est visible,
chauffer le tampon pendant plusieurs minutes à 30 – 40 °C
jusqu’à ce que le précipité soit complètement dissous.
Mélanger soigneusement et laisser refroidir le tampon jusqu’à
température ambiante (18 – 25 °C).
Ajouter 250 μL de tampon A2. Mélanger doucement en
inversant le tube 6 à 8 fois. Ne pas mélanger au vortex
pour éviter le cisaillement de l’ADN génomique. Incuber à
température ambiante jusqu’à 5 min ou jusqu’à ce que le
lysat soit clair.
+ 250 μL A1
Resuspendre
+ 250 μL A2
Mélanger
TA, 5 min
+ 300 μL A3
Mélanger
Ajouter 300 μL de tampon A3. Mélanger soigneusement
en inversant le tube 6 à 8 fois jusqu’à ce que le lysat bleu
devienne complètement incolore ! Ne pas mélanger au vortex
pour éviter de cisailler l’ADN génomique !
S’assurer de neutraliser complètement le mélange afin de
précipiter toutes les protéines et l’ADN chromosomique. Le
LyseControl doit devenir complètement incolore sans aucune
trace de bleu.
3
Clarification du lysat
Centrifuger pendant 5 min à 11 000 x g à température
ambiante.
Répéter cette étape si le surnageant n’est pas clair !
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
11 000 x g,
5 – 10 min
13
NucleoSpin® Plasmid / Plasmid (NoLid)
4
Fixation de l’ADN
Placer une colonne NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid)
dans un tube collecteur (2 mL) et charger maximum 700 μL
de surnageant de l’étape 3 sur la colonne. Centrifuger
pendant 1 min à 11 000 x g. Jeter le filtrat et replacer la
colonne NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid) dans le tube
collecteur.
Répéter cette étape pour charger le lysat restant.
5
11 000 x g,
1 min
Lavage de la membrane de silice
Note : Si l’ADN plasmidique est préparé à partir de souches
riches en nucléases (par exemple, HB101 ou des souches de
la série JM), il est fortement recommandé d’effectuer une
étape de lavage supplémentaire avec 500 μL de tampon
AW, éventuellement préchauffé à 50 °C, et de centrifuger
pendant 1 min à 11 000 x g avant de procéder avec le tampon
A4. Un lavage supplémentaire avec le tampon AW augmente
la longueur de lecture des réactions de séquençage de l’ADN
et améliore les performances des réactions enzymatiques
critiques.
Ajouter 600 μL de tampon A4 (complété par de l’éthanol,
voir chapitre 3). Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
Jeter le filtrat et replacer la colonne NucleoSpin® Plasmid / ​
Plasmid (NoLid) dans le tube collecteur vide.
6
Charger le
surnageant
En option :
+ 500 μL AW
11 000 x g,
1 min
+ 600 μL A4
11 000 x g,
1 min
Séchage de la membrane de silice
Centrifuger pendant 2 min à 11 000 x g et jeter le tube
collecteur.
Note : les résidus de tampon de lavage éthanolique résiduel
peuvent inhiber les réactions enzymatiques ultérieures.
7
Elution de l’ADN
Placer la colonne NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid)
dans un microtube de 1,5 mL (non fourni) et ajouter 50 μL
de tampon AE. Incuber pendant 1 min à température
ambiante. Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
Note : pour des procédures d’élution plus efficaces et des
tampons d’élution alternatifs (par exemple, tampon TE ou
eau), voir le paragraphe 2.5.
14
11 000 x g,
2 min
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
+ 50 μL AE
TA, 1 min
11 000 x g,
1 min
NucleoSpin® Plasmid / Plasmid (NoLid)
5.2
Purification de plasmides low copy, de constructions P1
ou de cosmides
Le traitement de volumes de culture plus importants nécessite une augmentation des volumes
de tampon de lyse. Les volumes de tampon fournis avec le kit sont calculés uniquement pour
la purification de plasmides high copy. Par conséquent, si le protocole low copy doit être
utilisé fréquemment, un set de tampons (NucleoSpin® Buffer Set) supplémentaire peut être
commandé séparément (voir les informations de commande, paragraphe 6.2).
Avant de commencer la préparation :
•
1
Vérifier que le tampon de lavage A4 a été préparé conformément au chapitre 3.
Récolte des cellules bactériennes cultivées
Utiliser 5 à 10 mL d’une culture E. coli LB saturée, puis
récolter les cellules dans une microcentrifugeuse de paillasse
standard pendant 30 s à 11 000 x g. Jeter le surnageant et
éliminer autant de liquide que possible.
2
11 000 x g,
30 s
Lyse cellulaire
Ajouter 500 μL de tampon A1. Remettre complètement
en suspension le culot cellulaire au vortex ou par pipetages
successifs. S’assurer qu’il ne reste pas d’amas de cellules
avant d’ajouter le tampon A2 !
Note : Vérifier que le tampon A2 ne contient pas de SDS
précipité avant de l’utiliser. Si un précipité blanc est visible,
chauffer le tampon pendant plusieurs minutes à 30 – 40 °C
jusqu’à ce que le précipité soit complètement dissous.
Mélanger soigneusement et laisser refroidir le tampon jusqu’à
température ambiante (18 – 25 °C).
Ajouter 500 μL de tampon A2. Mélanger doucement en
inversant le tube 6 à 8 fois. Ne pas mélanger au vortex
pour éviter le cisaillement de l’ADN génomique. Incuber à
température ambiante jusqu’à 5 min ou jusqu’à ce que le
lysat soit clair.
+ 500 μL A1
Resuspendre
+ 500 μL A2
Mélanger
TA, 5 min
+ 600 μL A3
Mélanger
Ajouter 600 μL de tampon A3. Mélanger soigneusement
en inversant le tube 6 à 8 fois jusqu’à ce que le lysat bleu
devienne complètement incolore ! Ne pas mélanger au vortex
pour éviter de cisailler l’ADN génomique !
Veiller à neutraliser complètement pour précipiter toutes les
protéines et l’ADN chromosomique. Le LyseControl doit
devenir complètement incolore sans aucune trace de bleu.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
15
NucleoSpin® Plasmid / Plasmid (NoLid)
3
Clarification du lysat
Centrifuger pendant 10 min à 11 000 x g à température
ambiante
> 11 000 x g,
5 – 10 min
4
Fixation de l’ADN
Placer une colonne NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid)
dans un tube collecteur (2 mL) et charger maximum 700 μL
de surnageant de l’étape 3 sur la colonne. Centrifuger
pendant 1 min à 11 000 x g. Jeter le lysat et replacer la
colonne NucleoSpin® Plasmid dans le tube collecteur.
Charger le
surnageant
11 000 x g,
1 min
Répéter cette étape pour charger le lysat restant.
5
Lavage de la membrane de silice
Note: Ajouter 500 μL de tampon AW, éventuellement
préchauffé à 50 °C, et centrifuger pendant 1 min à 11 000 x
g. Jeter le lysat et replacer la colonne NucleoSpin® Plasmid / ​
Plasmid (NoLid) dans le tube collecteur.
Ajouter 600 μL de tampon A4 (complété par de l’éthanol,
voir chapitre 3). Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
Jeter le filtrat et replacer la colonne NucleoSpin® Plasmid / ​
Plasmid (NoLid) dans le tube collecteur vide.
En option :
+ 500 μL AW
11 000 x g,
1 min
+ 600 μL A4
11 000 x g,
1 min
6
Séchage de la membrane de silice
Centrifuger pendant 2 min à 11 000 x g et jeter le tube
collecteur.
Note : les résidus de tampon de lavage éthanolique peuvent
inhiber les réactions enzymatiques ultérieures.
7
Elution de l’ADN
Placer la colonne NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid)
dans un microtube de 1,5 mL (non fourni) et ajouter 50 μL de
tampon AE préchauffé à 70 °C. Incuber pendant 2 min à
70 °C. Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
Note : pour des procédures d’élution plus efficaces et des
tampons d’élution alternatifs (par exemple, tampon TE ou
eau), voir le paragraphe 2.5.
16
11 000 x g,
2 min
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
+ 50 μL AE
TA, 1 min
11 000 x g,
1 min
NucleoSpin® Plasmid / Plasmid (NoLid)
5.3
Purification de plasmides à partir de bactéries Gram
positif
Pour la purification des plasmides à partir de bactéries dont la paroi cellulaire est plus résistante
(par exemple, Bacillus, Staphylococcus), il est nécessaire de commencer la procédure de lyse
par un traitement enzymatique (par exemple, Lysozyme, Lysostaphine, Mutanolysine) afin de
briser les couches de peptidoglycane.
Pour certaines bactéries à Gram positif (par exemple, Bifidobactéria, Corynébactéria), même
une préincubation avec du lysozyme peut s’avérer insuffisante et des méthodes de broyage
mécanique doivent être utilisées (par exemple, RiboLyser).
Avant de commencer la préparation :
•
1
Vérifier que le tampon de lavage A4 a été préparé conformément au chapitre 3.
Récolte des cellules bactériennes cultivées
Utiliser jusqu’à 5 mL (NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid))
d’une culture d’E. coli en LB saturée, récolter les cellules
dans une centrifugeuse de paillasse pendant 30 s à 11 000
x g. Jeter le surnageant et éliminer autant de liquide que
possible.
2
11 000 x g,
30 s
Lyse des cellules
Ajouter 250 μL de tampon A1 contenant 10 mg/mL de
lysozyme (non fourni avec le kit). Remettre complètement
en suspension le culot cellulaire par vortex ou par pipetages
successifs. Veiller à ce qu’aucun amas de cellules ne subsiste
dans la suspension !
+ 250 μL A1
+ Lysozyme
Resuspendre
Incuber à 37 °C pendant 10 à 30 min.
Procéder à l’ajout du tampon A2 à l’étape 2 du protocole
de purification des plasmides high copy d’E. coli avec
NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid) (paragraphe 5.1).
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
37 °C,
10 – 30 min
17
NucleoSpin® Plasmid / Plasmid (NoLid)
5.4
Clean-up d’ADN plasmidique
Les préparations de plasmides ou de fragments d’ADN provenant d’autres origines que les
cellules bactériennes, par exemple de réactions enzymatiques, peuvent être purifiées à l’aide de
NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid) en omettant l’étape de lyse cellulaire.
Avant de commencer la préparation :
•
1
Vérifier que le tampon de lavage A4 a été préparé conformément au chapitre 3.
Ajustement des conditions de fixation
Ajouter 2 volumes de tampon A3 à 1 volume de solution
d’ADN et bien mélanger au vortex.
+ 2 vol A3
Mélanger
(Par exemple, ajouter 200 μL de tampon A3 à 100 μL de
mélange de réaction enzymatique).
2
Fixation de l’ADN
Placer une colonne NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid (NoLid)
dans un tube collecteur (2 mL) et charger le mélange sur la
colonne. Centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g. Jeter le
filtrat et remettre la colonne NucleoSpin® Plasmid / ​Plasmid
(NoLid) dans le tube collecteur.
Note : la capacité de chargement maximale de la colonne
Plasmid (NoLid) est de 700 μL.
NucleoSpin® Plasmid / ​
Répéter la procédure si des volumes plus importants doivent
être traités.
Procéder à l’étape de lavage 5 du protocole de purification
des plasmides high copy d’E. coli avec NucleoSpin® Plasmid / ​
Plasmid (NoLid) (paragraphe 5.1).
18
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
Charger le
mélange
11 000 x g,
1 min
Purification d’ADN plasmidique
6
Annexes
6.1
Guide de résolution des problèmes
Problèmes
Causes possibles et suggestions
Resuspension incomplète du culot cellulaire
•
Il est essentiel que le culot cellulaire soit complètement remis en
suspension avant la lyse. Aucun amas de cellules ne doit être visible
avant l’ajout du tampon A2.
Précipitation du SDS dans le tampon A2
Lyse incomplète •
des cellules
bactériennes
Le SDS dans le tampon A2 peut précipiter lors du stockage. Si
un précipité se forme, incuber le tampon A2 à 30 – 40 °C pendant
5 minutes et bien mélanger.
Trop de cellules bactériennes utilisées
•
Nous recommandons le milieu LB comme milieu de croissance
optimal. Lors de l’utilisation de milieux très riches comme le TB
(terrific broth), la densité cellulaire des cultures peut devenir trop
élevée.
Lyse incomplète des cellules bactériennes
•
Voir «Causes possibles et suggestions» ci-dessus.
Précipitation insuffisante du SDS et des débris cellulaires
•
La précipitation du SDS et des débris cellulaires sera légèrement
plus efficace si la centrifugation est effectuée à 4 °C plutôt qu’à
température ambiante.
Pas d’antibiotiques ou des quantités insuffisantes d’antibiotiques utilisés
pendant la culture
•
Faible
rendement en
plasmides
Les cellules portant le plasmide d’intérêt peuvent être envahies
par des cellules non transformées si une quantité inappropriée
d’antibiotique est utilisée. Ajouter des quantités appropriées de
solutions mères fraîchement préparées à tous les milieux, qu’ils soient
solides ou liquides.
Culture bactérienne trop ancienne
•
Ne pas incuber les cultures pendant plus de 16 heures à 37 °C
sous agitation. Nous recommandons le milieu LB comme milieu de
croissance optimal ; lors de l’utilisation de milieux très riches comme
le TB (terrific broth), le temps de culture doit être réduit à < 12 h.
Conditions d’élution suboptimales
•
Si possible, utiliser un tampon d’élution légèrement alcalin comme le
tampon AE (5 M Tris / ​HCl, pH 8,5). Si de l’eau exempte de nucléase
est utilisée, vérifier le pH de l’eau. L’efficacité de l’élution diminue
considérablement avec les tampons dont le pH est inférieur à 7.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
19
Purification d’ADN plasmidique
Problèmes
Causes possibles et suggestions
Faible
rendement
en plasmides
(suite)
Le plasmide utilisé n’est pas un high copy
•
Si l’on utilise des plasmides low copy (par exemple, des plasmides
portant l’ori P15A, des cosmides ou des constructions P1), les
volumes de culture doivent être portés à au moins 5 mL.
Mauvaise préparation des réactifs
•
Ajouter le volume indiqué d’éthanol à 96 – 100 % au tampon A4
concentré et mélanger soigneusement (voir chapitre 3).
Utilisation de souches riches en nucléases
Aucun
rendement en
plasmide
•
En particulier lorsque vous travaillez avec des souches riches en
nucléases, conserver les préparations de plasmides sur de la glace
ou congelées afin d’éviter la dégradation de l’ADN.
•
Si l’on utilise des souches riches en nucléases comme E. coli HB101
ou des souches de la série JM, veiller à effectuer l’étape facultative
de lavage AW (étape 5 ; paragraphe 5.1). L’élimination optimale des
endonucléases peut être obtenue en incubant la membrane avec du
tampon AW préchauffé (50 °C) pendant 2 min avant la centrifugation.
Stockage inapproprié de l’ADN plasmidique
•
Quantifier l’ADN directement après la préparation, par exemple par
électrophorèse sur gel d’agarose. Conserver l’ADN plasmidique
dissous dans l’eau à < -18 °C ou à < +5 °C lorsqu’il est dissous dans
le tampon AE ou le tampon TE.
ADN plasmidique dégradé
•
La suspension cellulaire a été incubée avec le tampon de lyse alcaline
A2 pendant plus de 5 min.
Contamination de l’ADN génomique
•
Faible
qualité des
plasmides
20
Le lysat cellulaire a été vortexé ou mélangé trop vigoureusement
après l’ajout du tampon A2. L’ADN génomique a été cisaillé et donc
libéré.
Formation d’un smear de plasmides sur un gel d’agarose
•
En particulier lorsque vous travaillez avec des souches riches en
nucléases, conserver les préparations de plasmides sur de la glace
ou congelées afin d’éviter la dégradation de l’ADN.
•
Si l’on utilise des souches riches en nucléases comme E. coli HB101
ou des souches de la série JM, veiller à effectuer l’étape facultative
de lavage AW (étape 5 ; paragraphe 5.1). L’élimination optimale des
endonucléases peut être obtenue en incubant la membrane avec du
tampon AW préchauffé (50 °C) pendant 2 min avant la centrifugation.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
Purification d’ADN plasmidique
Problèmes
Causes possibles et suggestions
Contamination par l’éthanol
•
Veiller à centrifuger ≥ 1 min à 11 000 x g à l’étape 6 afin d’obtenir
une élimination complète du tampon éthanolique A4.
Elution de l’ADN plasmidique avec le tampon TE
•
Performance
suboptimale
de l’ADN
plasmidique
dans les
réactions
enzymatiques
L’EDTA peut inhiber les réactions de séquençage. Repurifier l’ADN
plasmidique et l’éluer avec du tampon AE ou de l’eau. L’ADN
plasmidique élué peut également être précipité avec de l’éthanol et
redissous dans le tampon AE ou dans l’eau.
Pas de lavage additionnel avec le tampon AW
•
Un lavage additionnel avec 500 μL de tampon AW avant le lavage
avec le tampon éthanolique A4 augmente la longueur de lecture des
réactions de séquençage.
Pas assez d’ADN utilisé pour la réaction de séquençage
•
Quantifier l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose avant de mettre
en place les réactions de séquençage.
ADN plasmidique préparé à partir de trop de cellules
•
Ne pas utiliser plus de 3 mL d’une culture d’E. coli saturée si l’on
prépare de l’ADN plasmidique pour un séquençage automatisé par
fluorescence.
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
21
Purification d’ADN plasmidique
6.2
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoSpin Plasmid
740588.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250 preps
NucleoSpin® Plasmid (NoLid)
740499.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250 preps
NucleoSpin® Plasmid EasyPure
740727.10 / ​.50 / ​.250
10 / ​50 / ​250 preps
NucleoSpin Buffer Set
(pour la purification de plasmides low copy)
740953
1
Tampon A1 (sans RNase A)
740911.1
1L
Tampon A2 (sans LyseControl)
740912.1
1L
Tampon A3
740913.1
1L
Tampon A4 (concentré)
740914
25 mL
Tampon A4 (concentré)
740914.1
200 mL
Tampon AW
740916.1
1L
Tampon AE
740917.1
1L
RNase A (lyophilisée)
740505
740505.50
100 mg
50 mg
Tubes collecteurs (2 mL)
740600
1000
®
®
(pour 125 mL de tampon A4)
(pour 1 L de Buffer A4)
6.3
Références
Birnboim, H.C., et J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening of
recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 : 1513 – 1523.
Vogelstein B. et D. Gillespie. 1979. Purification preparative et analytique de l’ADN à partir de
l’agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 615 – 619.
22
MACHEREY-NAGEL – 03/2023, Rev. 14
Purification d’ADN plasmidique
6.4
Restrictions de l’utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont
destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage
prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de
sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et
d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux
spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des
données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de
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font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
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23
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