Roche BenchMark XT/LT Manuel utilisateur

Guide d’interprétation du VENTANA
MMR RxDx Panel pour le carcinome de
l’endomètre (EC)
VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody
VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody
VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody
VENTANA anti-MSH6 (SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody
SOMMAIRE
Introduction1
Utilisation prévue 3
Utilisation prévue du produit
3
Objectif du guide d’interprétation
3
Évaluation clinique
4
Caractéristiques de coloration 4
Critères d’acceptabilité de la morphologie et de la coloration de fond
5
Critères de cas pour l’évaluation clinique
5
Algorithme de notation
6
Contrôles8
Contrôles positifs internes
8
Procédure de traitement des échantillons
10
Images de référence
12
Cas efficaces
12
Cas insuffisants 14
Cas difficiles 18
Impact des conditions préanalytiques sur le VENTANA MMR RxDx Panel
28
Conditions de fixation acceptables pour des résultats de coloration optimaux 28
Stabilité des lames
32
Épaisseur des tissus
32
Références33
Introduction
La réparation des mésappariements (mismatch repair, MMR)
Les protéines MMR (MLH1, PMS2, MSH2 et MSH6) sont
de l’ADN est un mécanisme moléculaire dont la fonction est de
exprimées de façon ubiquitaire dans les cellules normales et
corriger les substitutions de bases inappropriées qui se produisent
malignes proliférantes.⁹ Beaucoup de cancers courants présentent
spontanément pendant la réplication de l’ADN.1 Des méthodes
une déficience du MMR (dMMR) et une MSI.1⁰ De nombreuses
basées sur l’amplification en chaîne par polymérase (PCR) ont
études ont démontré que la déficience du MMR est corrélée à une
montré que les défaillances du MMR entraînent fréquemment
expression plus élevée des protéines PD-1 ou PD-L1.11-13 Ainsi,
une instabilité microsatellitaire (microsatellite instability, MSI),
les protéines MMR peuvent s’avérer utiles comme biomarqueurs
condition dans laquelle de courtes séquences de nucléotides
prédictifs en vue d’une thérapie ciblant PD-1. En particulier, une
répétées en tandem sont insérées dans l’ADN.2-⁴ Lorsque le
perte d’expression d’une ou plusieurs protéines MMR peut être
nombre de répétitions est supérieur ou égal à 30 % des loci
prédictive d’une plus grande probabilité de réponse à une telle
des microsatellites examinés, la MSI est nommée MSI-H (MSI-
thérapie.13-15 Les inhibiteurs de PD-1 peuvent s’avérer utiles dans
High). Les déficiences du système MMR ont été attribuées à des
certains cancers présentant une haute fréquence de déficience
mutations dans les protéines MMR, généralement MLH1, PMS2,
du MMR et/ou une MSI-H, indépendamment du tissu d’origine
MSH2, et MSH6.
des cancers.14,15 Par conséquent, les patients qui envisagent
une thérapie ciblant PD-1 bénéficieront d’un test diagnostique
Les protéines MLH1 et PMS2 agissent normalement ensemble
compagnon permettant d’identifier la population de patients
sous forme d’un complexe hétérodimérique, et il en va de même
présentant une déficience du MMR.
pour les protéines MSH2 et MSH6. Lorsque le MMR fonctionne
normalement, l’hétérodimère MSH6/MSH2 se lie à l’ADN
Le carcinome de l’endomètre (endometrial carcinoma, EC)
mésapparié. Cette liaison induit un changement de conformation
représente l’une des lésions malignes gynécologiques les plus
qui permet à l’hétérodimère MLH1/PMS2 de se fixer sur l’ADN
courantes.12 Il est fréquemment observé qu’il comporte de
lié au complexe MSH6/MSH2, entraînant une réparation par
nombreuses altérations génétiques, dont une MSI. 12 Il a été
excision de l’ADN affecté.⁴,⁵ Les mutations ou les déficiences
suggéré que le carcinome de l’endomètre MSI peut présenter une
dans ces protéines sont la cause de fréquentes mutations MSI
augmentation de l’expression de la protéine PD-L1 par rapport
et somatiques dues à une erreur de réplication. Les tests du
au carcinome de l’endomètre sans instabilité microsatellitaire
MMR par immunohistochimie (IHC) peuvent s’avérer utiles dans
(microsatellite stable, MSS).16 Tandis que le traitement de l’EC varie
l’identification des gènes MMR susceptibles de contenir des
en fonction du grade, de l’histologie et du stade de la maladie,17
altérations germinales ou somatiques.⁶
l’évaluation du statut MMR des tumeurs EC est utile pour le
pronostic et l’orientation du traitement.12 De ce fait, les patients
Historiquement, les régimes de traitement des patients cancéreux
qui envisagent une thérapie ciblant PD-1 bénéficieront d’un test
étaient dictés par la malignité spécifique. Toutefois, de nouvelles
diagnostique compagnon permettant d’identifier la population de
immunothérapies, notamment celles qui modifient les voies
patients présentant une déficience du MMR.
cellulaires impliquant les protéines PD-1 (programmed death 1) ou
PD-L1 (programmed death ligand 1), redéfinissent les stratégies
Une perte d’expression de l’une des protéines MMR essentielles,
thérapeutiques des cliniciens. PD-1 est un récepteur inhibiteur
dont MLH1, PMS2, MSH2 ou MSH6, entraîne la déficience du
exprimé sur les lymphocytes T après leur activation, qui se
MMR. La présence de coloration pour l’ensemble de ces quatre
prolonge durablement dans les états de stimulation chronique
protéines MMR marqueurs dans la tumeur indique que le cas
tels que l’infection chronique ou le cancer.⁷ L’expression de
est efficace quant au statut VENTANA MMR IHC. L’absence de
PD-L1 a été observée dans les cellules immunitaires et les cellules
coloration pour l’une des protéines MMR marqueurs du VENTANA
malignes, et il a été rapporté que l’expression aberrante de PD-L1
MMR RxDx Panel indique que le cas est insuffisant quant au statut
sur les cellules tumorales (tumor cells, TC) entrave l’immunité
VENTANA MMR IHC.
antitumorale, entraînant l’évasion immunitaire.⁷,⁸ L’interruption de
la voie PD-L1/PD-1 représente donc une stratégie intéressante
pour réactiver l’immunité des lymphocytes T spécifique à la tumeur.
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
1
2
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Utilisation prévue
Utilisation prévue du produit
Consulter la notice du VENTANA MMR RxDx Panel pour une
description détaillée de l’utilisation prévue de ce produit, y
compris des indications associées.
Objectif du guide d’interprétation
Le présent guide est destiné aux fins suivantes :
• Fournir aux anatomopathologistes un outil facilitant
l’évaluation clinique de coupes de tumeurs fixées au formol
et incluses en paraffine (FFPE) colorées à l’aide du VENTANA
MMR RxDx Panel conformément à l’étiquetage proposé du
produit.
• Fournir des clichés photographiques qui illustrent les profils
de coloration pouvant résulter de la coloration des tissus
tumoraux avec le VENTANA MMR RxDx Panel.
• Fournir des exemples d’images illustrant les cas difficiles afin
de faciliter leur évaluation.
• Offrir des conseils pour l’utilisation d’éléments tissulaires
normaux positifs pour les protéines MMR, qui servent de
contrôle interne positif lorsqu’ils sont colorés à l’aide du
VENTANA MMR RxDx Panel.
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
3
Évaluation clinique
Caractéristiques de coloration
Les cellules marquées avec chaque test dans le VENTANA MMR
Le signal peut se distribuer de façon homogène, avec un niveau
RxDx Panel sont évaluées quant à la présence ou à l’absence du
d’intensité uniforme dans les régions néoplasiques de la tumeur,
signal de la diaminobenzidine (DAB). La coloration du VENTANA
ou de façon hétérogène, avec plus d’un niveau d’intensité. Il doit
MMR RxDx Panel dans les protéines MMR s’effectue suivant un
être facilement détectable avec les faibles grossissements tels
profil nucléaire. La perte de l’une des protéines MMR détectées
que 2x ou 4x. Une représentation graphique du ou des type(s)
par le VENTANA MMR RxDx Panel est observée dans les noyaux
de cellules néoplasiques/éléments de coloration marqués par le
des cellules tumorales. Le statut MMR est classé comme « Intact »
VENTANA MMR RxDx Panel est fournie dans la section Images
ou « Perte » en fonction uniquement d’une coloration nucléaire
de référence de ce guide d’interprétation. Un réactif de contrôle
sans équivoque.
négatif (negative reagent control, NRC) correspondant à l’espèce
• Statut Intact : Il se caractérise par des cellules tumorales
est utilisé pour évaluer la présence d'une coloration de fond dans
présentant une coloration sans équivoque d’une intensité
les échantillons testés et pour établir une intensité de coloration
supérieure ou égale aux contrôles internes au-dessus de la
de référence. Les critères d’acceptabilité de la morphologie et de
coloration de fond.
la coloration fond sont indiqués dans le tableau 1. Les critères de
• Statut Perte : Il se caractérise par l’absence de tout signal
détectable. Les cas avec un statut Perte peuvent tout de même
présenter une pâle décoloration nucléaire grise.
Coloration nucléaire sans équivoque
dans les cellules tumorales
MSH6 10x
cas pour l’évaluation du statut MMR du tissu néoplasique avec
n’importe lequel des quatre tests du VENTANA MMR RxDx Panel
sont indiqués dans le tableau 2.
Absence de coloration nucléaire
dans les cellules tumorales
MSH6 10x
Forte coloration nucléaire dans
les lymphocytes
Statut Perte de coloration et Intact du MMR : Dans ces cas de carcinome de l’endomètre, les noyaux présentent une coloration
sans équivoque, correspondant au profil de coloration prédominant observé dans la majorité des tissus tumoraux dans le statut Intact
pour MSH6 (image de gauche). L’absence de coloration nucléaire dans les tissus tumoraux représente le statut Perte pour MSH6
(image de droite). Une coloration nucléaire sans équivoque dans les cellules de contrôle interne (c.-à-d. les lymphocytes) à proximité
des tumeurs viables constitue un contrôle positif interne acceptable.
4
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Critères d’acceptabilité de la morphologie et de la coloration de fond
Pour chaque cas coloré à l’aide du VENTANA MMR RxDx Panel, l’acceptabilité de la morphologie du tissu et de la coloration de fond doit
être évaluée en fonction des critères décrits dans le tableau 1.
Tableau 1 : Critères d’acceptabilité de la morphologie et de la coloration de fond
Critères
Acceptable
Inacceptable
Morphologie
Les éléments cellulaires d’intérêt sont
Les éléments cellulaires d’intérêt ne sont pas
visualisés, permettant l’interprétation clinique
visualisés, compromettant l’interprétation clinique de
de la coloration spécifique
la coloration spécifique
La coloration de fond n’interfère pas avec
La coloration de fond interfère avec la capacité à
l’interprétation clinique de la coloration
interpréter la coloration spécifique
Coloration de fond
spécifique
Critères de cas pour l’évaluation clinique
Dans le tableau 2 sont résumés les critères pour une lame de tissu néoplasique à évaluer quant au statut MMR avec n’importe lequel des
tests du VENTANA MMR RxDx Panel.
Tableau 2 : Critères rendant une lame évaluable ou non évaluable
Interprétation clinique
Évaluable (doit remplir tous les critères)
Critères de profil de coloration
1.
H&E a ≥ 50 cellules tumorales viables
2.
La lame du réactif du Negative Reagent Control est acceptable
3.
La morphologie est acceptable
4.
La coloration de fond est acceptable
5.
Les contrôles positifs internes présentent une coloration nucléaire sans
équivoque
Non évaluable (si l’un des critères de cette
section est rempli, la coloration de la lame
doit être répétée ou le cas rejeté, s’il y a lieu)
1.
H&E a < 50 cellules tumorales viables
2.
La lame du réactif du Negative Reagent Control est inacceptable
3.
La morphologie est inacceptable
4.
La coloration de fond est inacceptable
5.
Les contrôles positifs internes ne présentent pas de coloration nucléaire
sans équivoque
6.
L’interprétation n’est pas possible en raison d’une perte de tissu, de
l’absence de tumeur, d’artéfacts et/ou d’artéfacts de bord
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
5
Algorithme de notation
Évaluation du VENTANA MMR RxDx Panel :
Le VENTANA MMR RxDx Panel est constitué de quatre tests :
La répétition de la coloration d’un échantillon pour un test MMR
VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary
RxDx particulier du panel (p. ex. VENTANA anti-MLH1 (M1)
Antibody, VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal
Mouse Monoclonal Primary Antibody) doit être effectuée sur
Primary Antibody, VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse
des lames non colorées si (1) la lame du cas colorée avec le NRC
Monoclonal Primary Antibody et VENTANA anti-MSH6
approprié pour ce test ne présente pas de coloration acceptable
(SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody. Il est nécessaire
ou (2) si la lame du cas colorée avec ce test MMR RxDx particulier
d’effectuer une coupe sériée du tissu de l’échantillon à tester
(p. ex. VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary
pour la coloration avec chacun de ces anticorps. Des coupes
Antibody) n’est pas évaluable. Si l’une des lames n’est pas
sériées de tissu supplémentaires sont nécessaires pour la
interprétable à cause d’un manque de coloration dans les cellules
coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E) et avec l’anticorps NRC
du contrôle positif interne, de la présence d’artéfacts, d’effets
correspondant à l’espèce de l’anticorps approprié du VENTANA
de bord, d’une nécrose, d’un manque de tissu ou de toute autre
MMR RxDx Panel (Negative Control (Monoclonal) (mNRC) ou
raison, la lame ne peut être évaluée. Si la coloration des contrôles
Rabbit Monoclonal Negative Control Ig (rNRC)).
est acceptable et que les lames colorées à l’aide du VENTANA
MMR RxDx Panel sont évaluables, elles peuvent être évaluées par
Les cellules néoplasiques colorées à l’aide du VENTANA MMR
un anatomopathologiste qualifié comme décrit dans la section
RxDx Panel sont évaluées quant à la présence ou à l’absence
Algorithme de notation.
du signal DAB. La lame correspondante colorée avec le NRC
est utilisée pour évaluer la coloration de fond non spécifique
REMARQUE : L’OptiView DAB IHC Detection Kit et l’OptiView
et le niveau de coloration de fond due aux éléments tissulaires
Amplification Kit sont les seuls réactifs de détection recommandés
spécifiques (consulter les images de cas efficaces et insuffisants).
pour une utilisation avec le VENTANA MMR RxDx Panel.
Si l’évaluation H&E indique que l’échantillon patient est inadéquat
Les tableaux 3 et 4 présentent les interprétations pour l’expression
(par exemple, si moins de 50 cellules tumorales viables sont
des protéines et le statut MMR avec le VENTANA MMR
présentes), alors il faut obtenir un nouvel échantillon.
RxDx Panel. La section Images de référence traite de cas
représentatifs.
Tableau 3 : Interprétation du VENTANA MMR RxDx Panel quant à l’expression des protéines
Expression intacte des protéines
Perte d’expression des protéines
Coloration nucléaire sans équivoque dans les cellules
Perte sans équivoque de coloration nucléaire ou faible coloration
tumorales viables en présence de contrôles positifs
nucléaire focale équivoque dans les cellules tumorales viables
internes acceptables (p. ex. coloration nucléaire dans
en présence de contrôles positifs internes acceptables. Une
les lymphocytes, les fibroblastes ou l’épithélium normal
coloration nucléaire ponctuée est considérée comme négative
à proximité de la tumeur)
Tableau 4 : Interprétation du VENTANA MMR RxDx Panel quant au statut MMR
6
Efficace
Insuffisant
Les quatre protéines (MLH1, PMS2, MSH2 et MSH6) du
Au moins une protéine (MLH1, PMS2, MSH2 ou MSH6) du panel
panel présentent une expression intacte
présente une perte d’expression
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Carcinome de l’endomètre – Diagnostic clinique insuffisant
MLH1 20x
MSH6 20x
MSH2 20x
Statut Perte pour MLH1 : absence
Statut Perte pour MSH6 : absence
Statut Perte pour MSH2 : absence
de coloration nucléaire en présence de
de coloration nucléaire en présence de
de coloration nucléaire en présence de
contrôles positifs internes acceptables
contrôles positifs internes acceptables
contrôles positifs internes acceptables
Carcinome de l’endomètre – Diagnostic clinique efficace
PMS2 20x
MSH2 20x
Noyaux
positifs
pour MSH2
Noyaux
positifs
pour PMS2
MLH1 20x
Noyaux
positifs
pour MLH1
Statut Intact pour MSH2 : forte
Statut Intact pour PMS2 : forte coloration
Statut Intact pour MLH1 : forte coloration
coloration nucléaire en présence de
nucléaire en présence de contrôles positifs
nucléaire en présence de contrôles positifs
contrôles positifs internes acceptables
internes acceptables
internes acceptables
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
7
Contrôles
Lorsqu’ils sont colorés avec le VENTANA MMR RxDx Panel,
les éléments tissulaires normaux tels que les lymphocytes, les
fibroblastes ou l’épithélium normal à proximité de la tumeur
présentent une coloration nucléaire pour les protéines MMR.
Ces éléments tissulaires font office de contrôles positifs internes
et doivent être acceptables pour évaluer la lame colorée pour
chaque test du panel. Les contrôles internes doivent être évalués
pour chaque test et doivent satisfaire aux critères de coloration
pour l’interprétation du panel quant au statut MMR. En l’absence
de coloration nucléaire sans équivoque dans les lymphocytes, les
fibroblastes ou l’épithélium normal à proximité de la tumeur, la
lame colorée du test doit être considérée comme « non évaluable ».
Le tableau 5 décrit les critères pour une coloration acceptable
des contrôles internes.
Tableau 5 : Critères de coloration des contrôles internes
Évaluable
Non évaluable
Présence d’une coloration nucléaire sans équivoque dans
Absence de coloration nucléaire sans équivoque dans les
les éléments tissulaires normaux (p. ex. lymphocytes,
éléments tissulaires normaux (p. ex. lymphocytes, fibroblastes
fibroblastes ou épithélium normal) à proximité de la tumeur
ou épithélium normal) à proximité de la tumeur
Contrôles positifs internes
Les images ci-dessous sont représentatives du contrôle interne pour le VENTANA MMR RxDx Panel.
H&E 40x
mNRC 40x
MLH1 40x
Cas 1 de contrôle positif interne : Le carcinome de l’endomètre ne présente aucune coloration du contrôle interne à proximité des
cellules tumorales, et le carcinome ne peut donc être évalué. Le Negative Reagent Control acceptable illustré est le NRC de souris
(mouse NRC, mNRC).
8
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
H&E 20x
Coloration des cellules du contrôle interne
MLH1 20x
mNRC 20x
Coloration des cellules du contrôle interne
MSH2 20x
Cas 2 de contrôle positif interne : Une forte coloration des cellules du contrôle interne est présente à proximité de la tumeur d’un cas
de carcinome de l’endomètre avec un statut Perte pour MLH1 et d’un cas avec un statut Intact pour MSH2. Le Negative Reagent
Control acceptable est le NRC de souris (mNRC).
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
9
Procédure de traitement des échantillons
Les tests effectués à l’aide du VENTANA MMR RxDx Panel
nécessitent plusieurs coupes sériées du tissu de chaque
échantillon à tester. Une coupe est nécessaire pour la coloration
avec chacun des 4 tests : VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse
Monoclonal Primary Antibody, VENTANA anti-PMS2 (A16-4)
Mouse Monoclonal Primary Antibody, VENTANA anti-MSH2
(G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody et VENTANA
anti-MSH6 (SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody. De plus,
des coupes de chaque échantillon à tester sont nécessaires pour
la coloration H&E et la coloration avec l’anticorps NRC approprié
pour l’espèce de l’anticorps correspondant du VENTANA MMR
RxDx Panel (mNRC ou rNRC).
Si l’évaluation H&E indique que l’échantillon patient est inadéquat
(par exemple, si moins de 50 cellules tumorales viables sont
présentes), alors il faut obtenir un nouvel échantillon. La
répétition de la coloration d’un échantillon pour un test MMR
RxDx particulier du panel (p. ex. VENTANA anti-MLH1 (M1)
Mouse Monoclonal Primary Antibody) doit être effectuée sur des
lames non colorées si (1) la lame du cas colorée avec le réactif
de contrôle négatif approprié ne présente pas de coloration
acceptable ou (2) si la lame du cas colorée avec ce test MMR
RxDx particulier (p. ex. VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse
Monoclonal Primary Antibody) n’est pas évaluable. Si l’une des
lames n’est pas interprétable à cause de l’absence de coloration
dans les cellules du contrôle positif interne, d’artéfacts, d’effets
de bord, d’une nécrose, d’un manque de tissu ou de toute
autre raison, la lame ne peut être évaluée. Si les contrôles sont
acceptables et que les lames colorées à l’aide du VENTANA
MMR RxDx Panel sont évaluables, elles peuvent être évaluées par
un anatomopathologiste qualifié comme décrit dans la section
Algorithme de notation.
REMARQUE : L’OptiView DAB IHC Detection Kit et l’OptiView
Amplification Kit sont les seuls réactifs de détection recommandés
pour une utilisation avec le VENTANA MMR RxDx Panel.
10
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Déroulement du traitement des échantillons
L’échantillon de tissu tumoral
est fixé dans du formol neutre
tamponné à 10 % pendant
6-72 heures.
Des coupes de 4 μm d’épaisseur sont
montées sur des lames chargées
positivement (6 ou 7 coupes sériées
sont nécessaires).
La lame H&E estelle acceptable
(≥ 50 cellules viables) ?
Tumeur H&E
Non
Une coupe est colorée par H&E.
Oui
Répéter la coloration sur un
nouvel échantillon patient*
Une coupe est colorée avec chaque test du VENTANA MMR RxDx Panel. De plus,
chaque condition de test est colorée avec un réactif de contrôle négatif approprié,
Negative Control (Monoclonal) (mNRC) ou Rabbit Monoclonal Negative Control
Ig (rNRC), selon le cas, lors du même cycle d’appareil.
Non
Répéter le cycle de coloration
La lame
d’échantillon
colorée par le
réactif de contrôle
négatif est-elle
acceptable ?
Tumeur NRC
Oui
Non
Répéter la coloration du cas*
Chaque lame
d’échantillon
colorée présentet-elle des
contrôles internes
acceptables ?
Contrôle interne
Oui
Non
Répéter la coloration du cas*
Les lames
d’échantillon
colorées à l’aide du
VENTANA MMR
RxDx Panel sontelles acceptables ?
*La répétition peut s’effectuer sur le même bloc patient ou
un autre bloc de tissu du même patient, selon le cas.
(Toutes les images de tumeurs sont agrandies 20x)
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Tumeur IHC
Oui
Le résultat MMR (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6) est déterminé
par un anatomopathologiste qualifié conformément à
l’algorithme de notation du VENTANA MMR RxDx Panel.
11
Images de référence
Cas efficaces
H&E 20x
mNRC 20x
rNRC 20x
MLH1 20x
PMS2 20x
MSH2 20x
MSH6 20x
Cas efficace 1 : Statut Intact pour MLH1, PMS2, MSH2 et MSH6 dans un carcinome de l’endomètre présentant une forte
coloration nucléaire dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. Les Negative Reagent
Controls acceptables illustrés sont le NRC de souris (mouse NRC, mNRC) et le NRC de lapin (rabbit NRC, rNRC).
12
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
H&E 20x
mNRC 20x
rNRC 20x
MLH1 20x
PMS2 20x
MSH2 20x
MSH6 20x
Cas efficace 2 : Statut Intact pour MLH1, PMS2, MSH2 et MSH6 dans un carcinome de l’endomètre présentant une forte
coloration nucléaire dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. Les Negative Reagent
Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC).
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
13
Cas insuffisants
H&E 20x
mNRC 20x
rNRC 20x
MLH1 20x
PMS2 20x
MSH2 20x
MSH6 20x
Cas insuffisant 1 : Statut Perte pour MLH1 et PMS2 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire
dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. MSH2 et MSH6 ont un statut Intact. La
coloration cytoplasmique n’est pas prise en compte pour l’interprétation du statut. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le
NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC).
14
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
H&E 20x
mNRC 20x
rNRC 20x
MLH1 20x
PMS2 20x
MSH2 20x
MSH6 20x
Cas insuffisant 2 : Statut Perte pour MLH1 et PMS2 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire
dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. MSH2 et MSH6 ont un statut Intact. La
coloration cytoplasmique n’est pas prise en compte pour l’interprétation du statut. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le
NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC).
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
15
H&E 20x
mNRC 20x
rNRC 20x
MLH1 20x
PMS2 20x
MSH2 20x
MSH6 20x
Cas insuffisant 3 : Statut Perte pour MSH2 et MSH6 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire
dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. MLH1 et PMS2 ont un statut Intact. La
coloration cytoplasmique n’est pas prise en compte pour l’interprétation du statut. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le
NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC).
16
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
H&E 20x
mNRC 20x
rNRC 20x
MLH1 20x
PMS2 20x
MSH2 20x
MSH6 20x
Cas insuffisant 4 : Statut Perte pour MSH6 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire dans les
cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. MLH1, PMS2 et MSH2 ont un statut Intact. PMS2
présente une coloration hétérogène. La coloration cytoplasmique n’est pas prise en compte pour l’interprétation du statut. Les Negative
Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC).
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
17
Cas difficiles
Bien que la vaste majorité des cas colorés à l’aide du VENTANA
• Coloration ponctuée : Certains échantillons peuvent présenter
MMR RxDx Panel soient clairement efficaces ou insuffisants, il a
une coloration ponctuée discontinue au sein de quelques
été observé quelques cas difficiles à interpréter.
noyaux de la tumeur ; l’intensité de la coloration peut varier
entre faible et forte. Ce profil de coloration doit être ignoré, et
Index des cas difficiles :
• Cas difficile 1 : Coloration de fond non spécifique – Piégeage
de la DAB
• Cas difficile 2 : Coloration de fond non spécifique – Coloration
cytoplasmique
• Cas difficile 3 : Coloration focale
• Cas difficile 4 : Coloration ponctuée
• Cas difficile 5 : Mouchetage
• Cas difficile 6 : Artéfact de gradient de fixation
• Cas difficile 7 : Coloration hétérogène
• Cas difficile 8 : Dépôts de pigment
• Cas difficile 9 : Coloration membranaire
si un cas ne présente que ce type de profil de coloration, il doit
se voir attribuer un statut clinique Perte.
• Mouchetage : Par rapport à la coloration ponctuée, le
mouchetage possède un aspect plus fin, plus granulaire, et
peut être focal ou se retrouver dans de nombreuses cellules
tumorales. Ce profil de coloration, s’il est observé dans les
noyaux des cellules tumorales, doit être ignoré et la lame doit
se voir attribuer un statut Perte.
• Artéfact du tissu ou de la coloration : Les artéfacts
histologiques provenant du traitement des échantillons et des
processus de microtomie peuvent également compliquer la
Certains cas peuvent être particulièrement difficiles à évaluer en
détermination du statut clinique du MMR RxDx. Ces artéfacts
raison des problèmes suivants :
peuvent notamment comprendre les artéfacts de cautérisation
du tissu, les gradients de fixation et les effets de bord, le
• Coloration de fond non spécifique : Certains échantillons
piégeage de la DAB, les dépôts de pigment d’hémosidérine,
peuvent présenter une coloration de fond non spécifique dont
les bulles nucléaires, le manque de coloration dans certaines
l’origine n’est pas bien comprise. Pour cette raison, l’évaluation
régions du tissu (coloration hétérogène), la coloration
d’une lame MMR RxDx doit comprendre une comparaison
membranaire et/ou cytoplasmique, le déchirement ou le
de la lame avec la lame du réactif de contrôle négatif afin de
repliement du tissu et la perte de coupe de tissu. Dans certains
déterminer le niveau de la coloration de fond non spécifique.
cas, il faut répéter la coloration avec de nouvelles coupes ou
La coloration cytoplasmique, si elle est présente, ne doit pas
prélever un nouvel échantillon.
être prise en compte dans l’interprétation du MMR RxDx.
Des exemples de cas difficiles sont illustrés dans les pages
• Coloration focale : Certains échantillons peuvent présenter
suivantes.
une coloration focale dans les cellules tumorales et l’intensité
de la coloration peut varier entre faible et forte. D’après
l’algorithme de notation du MMR RxDx, une faible coloration
nucléaire focale équivoque dans les cellules tumorales viables
en présence de contrôles positifs internes doit se voir attribuer
un statut clinique Perte. À l’inverse, une forte coloration
nucléaire focale sans équivoque dans les cellules tumorales
viables en présence de contrôles positifs internes doit se voir
attribuer un statut clinique Intact.
18
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Coloration de fond non spécifique – Piégeage de la DAB
H&E 4x
mNRC 4x
rNRC 4x
MLH1 4x
PMS2 4x
MSH2 4x
MSH6 4x
Cas difficile 1 : Statut Perte pour MLH1 et PMS2 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire en présence
de contrôles internes colorés de façon appropriée avec coloration de fond non spécifique en lien avec un piégeage focal de la DAB dans le stroma
(flèches bleues). Le statut Intact pour MSH2 et MSH6 présente une forte coloration nucléaire et une coloration de fond non spécifique en présence
de contrôles internes colorés de façon appropriée. La coloration de fond cytoplasmique observée dans les cellules tumorales ne doit pas être prise en
compte pour l’interprétation du statut. Un piégeage focal de la DAB est aussi observé sur la lame MSH2 (flèche bleue). Les Negative Reagent Controls
acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC).
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
19
Coloration de fond non spécifique – Coloration cytoplasmique
H&E 40x
mNRC 40x
rNRC 40x
MLH1 40x
PMS2 40x
MSH2 40x
MSH6 40x
Cas difficile 2 : Statut Intact pour MSH2 et MSH6 dans un carcinome de l’endomètre présentant une forte coloration nucléaire dans
les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. MSH2 présente une coloration cytoplasmique et un
mouchetage cytoplasmique focal dans les cellules tumorales (flèches bleues), qui ne doivent pas être pris en compte pour l’interprétation
du statut. Statut Perte pour MLH1 et PMS2 sans coloration nucléaire en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée.
PMS2 présente une coloration de contrôle interne faible et focale, mais interprétable. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le
NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC).
20
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Coloration focale
H&E 20x
mNRC 20x
rNRC 20x
MLH1 20x
PMS2 20x
MSH2 20x
MSH6 20x
Absence de
coloration dans
les cellules
tumorales
Coloration focale
dans les cellules
tumorales
Cas difficile 3 : Statut Intact pour MLH1, PMS2, MSH2 et MSH6 dans un carcinome de l’endomètre. MSH6 présente une coloration
nucléaire focale sans équivoque dans les cellules tumorales en présence de cellules de contrôle positif interne acceptables et est donc
interprété comme Intact. PMS2 présente une intensité de coloration nucléaire hétérogène en présence de cellules de contrôle interne
colorées de façon appropriée. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC).
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
21
Coloration ponctuée
H&E 20x
MLH1 20x
mNRC 20x
Coloration ponctuée
MLH1 40x
Cas difficile 4 : Statut Perte pour MLH1 dans un carcinome de l’endomètre présentant une forte coloration ponctuée dans les
noyaux de quelques cellules tumorales. Cependant, aucune cellule dans la tumeur ne présente de coloration nucléaire sans équivoque
en présence de contrôles positifs internes colorés de façon appropriée. Le Negative Reagent Control acceptable est le NRC de souris
(mNRC).
22
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Mouchetage
H&E 40x
mNRC 40x
rNRC 40x
MLH1 40x
PMS2 40x
Mouchetage
cytoplasmique
MSH2 40x
MSH6 40x
Cas difficile 5 : Statut Perte pour MLH1 et PMS2 dans un carcinome de l’endomètre ne présentant aucune coloration nucléaire dans
les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. PMS2 présente un mouchetage cytoplasmique.
PMS2 et MSH2 présentent une faible coloration cytoplasmique. La coloration et le mouchetage cytoplasmiques ne sont pas pris en
compte pour l’interprétation du statut. Le statut Intact pour MSH2 et MSH6 présente une coloration nucléaire sans équivoque en
présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. Les Negative Reagent Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC)
et le NRC de lapin (rNRC).
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
23
Artéfact du gradient de fixation
H&E 4x
mNRC 4x
rNRC 4x
MLH1 4x
PMS2 4x
MSH2 4x
MSH6 4x
Cas difficile 6 : Un artéfact de gradient de fixation dans les cellules tumorales et les cellules de contrôle positif interne peut être observé
dans ce carcinome de l’endomètre présentant un statut Intact pour MLH1 et PMS2 et un statut Perte pour MSH2 et MSH6.
L’interprétation des marqueurs ne doit être effectuée qu’en présence de contrôles positifs internes acceptables. Les Negative Reagent
Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC).
24
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Coloration hétérogène
H&E 10x
mNRC 10x
rNRC 10x
MLH1 10x
PMS2 10x
MSH2 10x
MSH6 10x
Cas difficile 7 : Statut Intact pour MLH1, PMS2 et MSH2 dans un carcinome de l’endomètre présentant une intensité de coloration
nucléaire hétérogène dans les cellules tumorales en présence de contrôles internes colorés de façon appropriée. Le statut Perte pour
MSH6 ne révèle aucune coloration nucléaire à proximité des contrôles internes colorés de façon appropriée. Les Negative Reagent
Controls acceptables sont le NRC de souris (mNRC) et le NRC de lapin (rNRC).
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
25
Dépôts de pigment
H&E 20x
rNRC 20x
MSH6 20x
MSH6 40x
Cas difficile 8 : Statut Intact pour MSH6 dans un carcinome de l’endomètre présentant une forte coloration nucléaire dans la
tumeur en présence de contrôles positifs internes colorés de façon faible, mais appropriée. Des dépôts de pigment d’hémosidérine sont
observés à côté des cellules tumorales et des contrôles internes, et ils ne doivent pas être pris en compte pour l’interprétation du statut
(flèches bleues). Le Negative Reagent Control acceptable est le NRC de lapin (rNRC).
26
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Coloration membranaire
H&E 20x
mNRC 20x
MSH2 20x
MSH2 40x
Cas difficile 9 : MSH2 non évaluable dans un carcinome de l’endomètre présentant uniquement une coloration membranaire (flèches
bleues) sans contrôles internes colorés de façon appropriée. Le Negative Reagent Control acceptable est le NRC de souris (mNRC).
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
27
Impact des conditions préanalytiques sur le VENTANA MMR RxDx Panel
Conditions de fixation acceptables pour des résultats de coloration optimaux
Ventana recommande :
• De traiter le tissu immédiatement après l’excision (temps d’ischémie ≤ 6 heures)
• De fixer dans du formol neutre tamponné (neutral buffered formalin, NBF) à 10 % pendant 6-72 heures. Voir les fixateurs et les temps de
fixation acceptables dans les encadrés bleus (tableaux 5-8).
Tableau 5 : Coloration d’un tissu bénin d’amygdale humaine à l’aide du VENTANA anti-MLH1(M1) Mouse Monoclonal
Primary Antibody et de différents fixateurs et temps de fixation
Fixateur
Temps
(heures)
NBF à 10 %
Formol zinc**
Z-5**
PREFER**
AFA**
Alcool à 95 %**
1*
6
12
24
72
(toutes les images sont agrandies 20x)
REMARQUES
Les fixateurs et les temps de fixation suivants ne sont pas recommandés :
* La fixation pendant moins de 6 heures n’est pas recommandée.
** Les échantillons fixés avec des fixateurs tels que le formol zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA et l’alcool à 95 % présentent une
coloration faible ou variable. La fixation avec le formol zinc, Z-5, PREFER, AFA et l’alcool à 95 % n’est pas recommandée.
28
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Tableau 6 : Coloration d’un tissu bénin d’amygdale humaine à l’aide du VENTANA anti-PMS2(A16-4) Mouse
Monoclonal Primary Antibody et de différents fixateurs et temps de fixation
Fixateur
Temps
(heures)
NBF à 10 %
Formol zinc**
Z-5**
PREFER**
AFA**
Alcool à 95 %**
1*
6
12
24
72
(toutes les images sont agrandies 20x)
REMARQUES
Les fixateurs et les temps de fixation suivants ne sont pas recommandés :
* La fixation pendant moins de 6 heures n’est pas recommandée.
** Les échantillons fixés avec des fixateurs tels que le formol zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA et l’alcool à 95 % présentent une
coloration faible ou variable. La fixation avec le formol zinc, Z-5, PREFER, AFA et l’alcool à 95 % n’est pas recommandée.
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
29
Tableau 7 : Coloration d’un tissu bénin d’amygdale humaine à l’aide du VENTANA anti-MSH2(G219-1129) Mouse
Monoclonal Primary Antibody et de différents fixateurs et temps de fixation
Fixateur
Temps
(heures)
NBF à 10 %
Formol zinc**
Z-5**
PREFER**
AFA**
Alcool à 95 %**
1*
6
12
24
72
(toutes les images sont agrandies 20x)
REMARQUES
Les fixateurs et les temps de fixation suivants ne sont pas recommandés :
* La fixation pendant moins de 6 heures n’est pas recommandée.
** Les échantillons fixés avec des fixateurs tels que le formol zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA et l’alcool à 95 % présentent une
coloration faible ou variable. La fixation avec le formol zinc, Z-5, PREFER, AFA et l’alcool à 95 % n’est pas recommandée.
30
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
Tableau 8 : Coloration d’un tissu bénin d’amygdale humaine à l’aide du VENTANA anti-MSH6(SP93) Rabbit Monoclonal
Primary Antibody et de différents fixateurs et temps de fixation
Fixateur
Temps
(heures)
NBF à 10 %
Formol zinc**
Z-5**
PREFER**
AFA**
Alcool à 95 %**
1*
6
12
24
72
(toutes les images sont agrandies 20x)
REMARQUES
Les fixateurs et les temps de fixation suivants ne sont pas recommandés :
* La fixation pendant moins de 6 heures n’est pas recommandée.
** Les échantillons fixés avec des fixateurs tels que le formol zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA et l’alcool à 95 % présentent une
coloration faible ou variable. La fixation avec le formol zinc, Z-5, PREFER, AFA et l’alcool à 95 % n’est pas recommandée.
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
31
Stabilité des lames
Ventana a établi que le VENTANA MMR RxDx Panel ne doit pas
être utilisé avec des lames conservées pendant plus de 45 jours.
Les lames doivent être colorées immédiatement, car l’antigénicité
des coupes de tissus peut diminuer au cours du temps et être
compromise 45 jours après la coupe du bloc de tissu FFPE.
Épaisseur des tissus
Les coupes doivent posséder une épaisseur de 4 µm et être
montées sur des lames de verre chargées positivement. Aucune
autre épaisseur n’a été validée.
32
VENTANA MMR RxDx Panel pour le carcinome de l’endomètre
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Pour les coordonnées du fabricant, consulter les notices
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1020315FR Rev A
2021-02-15
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