NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ BHV Type 4 Kit
PCR temps réel TaqMan® pour la détection du BHV4 (Bovine Herpes Virus type 4)
Référence Catalogue BHV450
Partie Nº 100020312 Pub. Nº MAN0008666 Rév. B.0
Technique
Espèce(s)
Acides nucléiques isolés à partir des matrices
Test
Bovins
Ecouvillon (cervical ou naso-pharyngé)
Mucus vaginal
Organe (avorton ou poumon)
Sperme
Aspiration Trans-Trachéale (ATT)
Individuel
PCR temps réel (ADN)
– Duplex
– IPC endogène
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes
de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques
du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Informations sur le produit
Description du produit
Applied Biosystems™ VetMAX™ BHV Type 4 Kit est un outil de diagnostic moléculaire permettant la détection par PCR temps réel
du BHV4 (Bovine Herpes Virus type 4), un gammaherpesvirus ubiquiste des bovins. Certaines souches de BHV4 ont été impliquées
dans des affections oculaires et respiratoires (conjonctivites, rhinites, trachéites, pneumonies). D’autres ont été isolées lors d’affections
génitales (orchites, épididymites, vaginites, avortement, métrites, mammites) ainsi que dans des troubles associés au tractus digestif
(glossites, entérites, tumeurs du rumen).
Chaque échantillon d’ADN obtenu après extraction est analysé en monocupule : la même cupule est utilisée pour la détection
spécifique de l’ADN viral du BHV4 et pour la détection d’un IPC (Internal Positive Control). La positivité de l’IPC traduit à la fois
l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.
Il est utilisable sur ADN viraux extraits à partir d’écouvillon (cervical ou naso-pharyngé), mucus vaginal, d’organes (avorton ou
poumon), de sperme et d’aspiration trans-trachéale (ATT).
Les protocoles complets d’extractions des ADN viraux à partir de ces matrices sont disponibles sur demande au Support Technique.
Réactifs du kit et conservation
VetMAX™ BHV Type 4 Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant les différents réactifs pour la détection en duplex du BHV4
et d’un contrôle interne IPC. A réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre −30°C et −10°C. Après première utilisation d’un
composant, le conserver selon les recommandations suivantes :
Article
Description
3 - Mix BHV4
(Tube vert)
Mix pour PCR TaqMan®. Contient :
• Le système de détection pour la cible BHV4, comprenant une
sonde TaqMan® marquée
FAM™ – NFQ (Non-Fluorescent Quencher).
• Le système de détection pour l’IPC, comprenant une sonde
TaqMan® marquée VIC™ – NFQ (Non-Fluorescent Quencher).
• Le tampon et l’enzyme de PCR temps réel.
4a - EPC BHV4
(Tube marron)
External Positive Control :
Contrôle positif en BHV4. Il s’agit d’acides nucléiques déjà extraits
à amplifier lors de la PCR temps réel.
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Conservation
Volume
(50 réactions)
A réception
Après première
utilisation
2 × 500 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
90 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
Témoins d’extraction et d’amplification
Le VetMAX™ BHV Type 4 Kit contient 1 témoin permettant la validation de l’amplification des ADN viraux :
4a - EPC BHV4 : contrôle positif en BHV4
Contrôle positif déjà extrait à amplifier lors de la PCR temps réel.
Un résultat positif compris dans l’intervalle accepté de Ct permet de valider l’amplification de la cible BHV4 par PCR temps réel.
La validation de l’extraction des acides nucléiques pour chaque échantillon s’effectue grâce à la détection d’un IPC endogène (Internal
Positive Control), présent dans chaque échantillon.
Un résultat IPC positif avec une valeur conforme dans un échantillon permet de valider l’extraction de cet échantillon qu’il soit positif
ou négatif pour le pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des inhibiteurs.
Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :
NCS : contrôle négatif d’extraction
C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (le volume d’échantillon peut être remplacé
par le tampon utilisé lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les
échantillons : extraction des acides nucléiques puis PCR temps réel.
Un résultat négatif en BHV4 et en IPC endogène permet de valider l’absence de contamination au cours de l’extraction et de la PCR
temps réel.
NC : contrôle négatif d’amplification
Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau
DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL.
Un résultat négatif pour BHV4 et IPC permet de valider l’absence de contamination au cours de la préparation des réactions pour la
PCR temps réel.
Matériel et réactifs requis pour la PCR temps réel non fournis dans le kit
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre
• Eau DNase/RNase-free
• Tampon TE 1X
• Tampon PBS 1X
• Un thermocycleur de PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :
- FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)
- VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm)
• Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé : Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits),
microtubes ou capillaires; films ou bouchons adaptés à la fermeture
Procédure d’analyse
Le volume réactionnel de la PCR temps réel est de 25 µL :
• 3 - Mix BHV4 : 20 µL par analyse
•
ADN extrait : 5 µL par analyse
Extraction des ADN viraux
Il est nécessaire d’isoler les ADN à partir des échantillons pour l’analyse par PCR temps réel.
NOTE : Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ BHV Type 4 Kit, merci de contacter le
Support Technique.
Préparation de la PCR temps réel
1. Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible le contrôle positif (EPC) des autres
2.
3.
4.
5.
échantillons.
Décongeler le tube 3 - Mix BHV4 entre 2°C et 8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.
Homogénéiser le tube 3 - Mix BHV4 par agitation douce, puis centrifuger brièvement.
Distribuer 20 µL de 3 - Mix BHV4 par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.
Ajouter les ADN des échantillons et contrôles au mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :
Composant
Volume d’échantillon
ADN extraits de l’échantillon
5 µL
4a - EPC BHV4
5 µL
Contrôle négatif d’extraction (NCS)
NCS extrait
5 µL
Contrôle négatif d’amplification (NC)
Eau DNase/RNase-free
5 µL
Type d’analyse
Echantillon pour analyse
Contrôle positif d’amplification
6. Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.
2
VetMAX™ BHV Type 4 Kit Notice d’utilisation
Amplification par PCR en temps réel
1. Créer les détecteurs suivants sur le thermocycleur :
Reporter
Quencher
BHV4
FAM™
NFQ (Non-Fluorescent Quencher)
IPC BHV4
VIC™
NFQ (Non-Fluorescent Quencher)
Référence passive : ROX™(1)
(1)
Le fluorophore ROX™ est à renseigner obligatoirement pour l’analyse par PCR temps réel si le thermocycleur est capable de le détecter. Pour les autres
thermocycleurs, l’absence de détection de ce fluorophore ne remet pas en cause l’analyse par PCR temps réel.
2. Attribuer pour chaque échantillon le détecteur BHV4 et le détecteur IPC BHV4 dans le puits utilisé pour l’analyse.
3. Créer le programme de PCR temps réel suivant pour l’analyse :
Répétitions de l’étape
Température
Durée
Etape 1
×1
50°C
2 minutes
Etape 2
×1
×45
Etape 3
(1)
95°C
10 minutes
95°C
15 secondes
60°C(1)
1 minute
Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 1 minute.
4. Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la PCR temps réel.
Analyse des résultats
Analyse des données brutes
Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.
1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la PCR temps réel.
2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons pour chaque détecteur selon les
recommandations ci-après.
Validation du test
La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants :
Détecteur BHV4
Détecteur IPC BHV4
Validation
Ct = Ct QC BHV4 de 4a - EPC BHV4 ± 3Ct(1)
Ct < 45 ou Ct > 45(2)
PCR validée
NCS
Ct > 45
Ct > 45
Extraction validée
NC
Ct > 45
Ct > 45
Réactifs PCR validés
EPC BHV4
Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.1 « EPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.
(2) Ne pas prendre en compte la valeur d’IPC dans l’EPC pour la validation du test.
(1)
Interprétation des résultats
Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous :
(1)
Détecteur BHV4
Détecteur IPC BHV4
Interprétation
Ct < 45
Ct < 45 ou Ct > 45
BHV4 détecté
Ct > 45
Ct < 45
BHV4non détecté
Ct > 45
Ct > 45
Non validé(1)
L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la négativité de l’IPC.
Conduite à tenir pour les échantillons non validés
1. Diluer l’ADN de l’échantillon non validé au 1:10 en tampon TE 1X.
2. Faire une nouvelle analyse PCR sur 5 µL de cette dilution.
3. Si l’ADN dilué est positif en BHV4 ou négatif en BHV4 avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est alors validé.
4. Si l’ADN dilué est négatif en BHV4 avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non validé. Dans ce cas,
renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:10 dans du tampon PBS 1X avant extraction.
5. Si le résultat est toujours non validé, répéter l’analyse sur un nouveau prélèvement.
VetMAX™ BHV Type 4 Kit Notice d’utilisation
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Documentation et support
Service clientèle et assistance technique
Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion
Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique,
notamment :
• Numéros de téléphone partout dans le monde
• Commande et Support web
• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques))
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant.
Garantie produit limitée
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles
sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact
avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008666 (français)
Révision
Date
B.0
3 mai 2017
A.0
25 novembre 2013
Description
Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.
Base de référence pour l’historique de révision
Licence à usage limité n° 460 : diagnostic vétérinaire PCR. Avis aux acheteurs : destiné à des services de diagnostic vétérinaire, notamment l’établissement de rapports de
diagnostic payants et pour les besoins de la recherche uniquement. Le diagnostic chez l’homme nécessite une licence séparée de Roche.
©2017 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire.
TaqMan est une marque déposée de Roche, utilisée sous autorisation et licence.
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3 mai 2017
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