Thermo Fisher Scientific PrioCHECK Paratuberculosis Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
PrioCHECK™ Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit
ELISA pour la détection des anticorps contre Mycobacterium avium ssp.
paratuberculosis dans le sérum, le plasma et le lait des ruminants
Références catalogue A65415 et A65416
Pub. nº MAN0029778 Rév. A
Technique
Espèces
Matrice d’échantillons
Type de test
Protocole
ELISA monocupule indirect – Plaques sécables
Bovin
Ovin
Caprin
Sérum
Plasma hépariné
Lait (bovin)
Individuel (sérum, plasma hépariné et lait)
Lait de grand mélange
Incubation courte
Incubation longue
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de
protection, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse suivante :
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité concernant les risques biologiques
sur la page du produit à l’adresse thermofisher.com. Porter des gants, des vêtements et des lunettes de protection appropriés.
Description du produit
™
™
L’Applied Biosystems PrioCHECK Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit (réf. A65415 et A65416) est un test ELISA facile d'utilisation. Ce
test permet la détection d’anticorps contre Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis dans des échantillons (sérum, plasma hépariné ou
lait) de ruminants. La paratuberculose, également connue sous le nom de maladie de Johne, résulte d’une infection par Mycobacterium
avium ssp. paratuberculosis (MAP), un bacille à Gram positif. Cette infection touche principalement les ganglions mésentériques et l’intestin
grêle, entraînant une infection intestinale chronique. Les symptômes cliniques sont des diarrhées, une perte de poids et des œdèmes. Ces
symptômes ne deviennent perceptibles qu’à un stade avancé de la maladie. Le contrôle de la maladie repose sur l’identification des animaux
infectés et la mise en place de procédures d’abattage. Les principaux outils de diagnostic sont la bactérioscopie, la culture bactérienne, la
PCR et les tests ELISA.
Pour éviter les réactions croisées avec les anticorps d’autres mycobactéries, les échantillons sont préincubés avec des protéines de
Mycobacterium phlei.
Principe du test
Le test est basé sur le principe d’un test ELISA indirect.
1. Les échantillons et les contrôles sont préparés dans une plaque de prédilution et incubés avec des protéines de Mycobacterium phlei (M.
phlei). Les protéines se fixent sur tout anticorps susceptible d’interférer avec le test.
2. Les échantillons et les contrôles préincubés sont ensuite transférés sur la plaque de test sensibilisée avec l'antigène de MAP. Les
anticorps anti-MAP présents dans l’échantillon ou le contrôle se fixent à l’antigène.
3. Après une étape de lavage, la protéine G conjuguée est ajoutée et se lie aux anticorps fixés sur la plaque.
4. Le conjugué non lié est éliminé par lavage, puis un substrat chromogène est ajouté. L’oxydation du substrat par le conjugué donne une
couleur bleue.
5. La réaction est arrêtée et la couleur tourne au jaune. Les résultats peuvent être lus à l'aide d'un lecteur de plaque ELISA.
L’intensité de la couleur jaune dans les échantillons positifs est proportionnelle à la quantité d’anticorps anti-MAP présents au sein de
l’échantillon.
Contenu et conservation
Tableau 1 PrioCHECK™ Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit (réf. A65415 et A65416)
Elément
Description
1 : Plaque de test
12 barrettes de 8 puits
2 : Contrôle négatif sérum
Solution beige dans un flacon translucide
3 : Contrôle positif sérum
Solution beige dans un flacon translucide
4 : Contrôle négatif lait
Solution blanche dans un flacon translucide
5 : Diluant échantillon[2]
Solution jaune dans un flacon translucide
6 : Conjugué (30X/150X)[3]
Solution rouge dans un flacon ambré
7 : Diluant conjugué
Solution transparente dans un flacon translucide
8 : Solution de lavage (40X)
Solution transparente dans un flacon translucide
9 : Substrat chromogène (TMB)
Solution transparente dans un flacon ambré
Réf. A65415 Réf. A65416
(460 tests) (2 760 tests)
5 plaques
700 μl
700 μl
9 ml
90 ml
2,1 ml
60 ml
60 ml
60 ml
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
30 plaques
2,5 ml
2,5 ml
30 ml
500 ml
15 ml
450 ml
500 ml
500 ml
Conservation [1]
2-8°C
2-8°C
2-8°C
2-8°C
2-8°C
2-8°C
2-8°C
2-8°C
2-8°C
Elément
10 : Solution d’arrêt
Films adhésifs pour plaques
Réf. A65415 Réf. A65416
(460 tests) (2 760 tests)
Description
Solution transparente dans un flacon translucide
60 ml
10
500 ml
—
Conservation [1]
2-8°C
Conserver à température ambiante (18-24°C).
[1] Voir la date de péremption sur l’étiquette.
[2] Le Diluant échantillon contient des protéines de Mycobacterium phlei.
[3] Le conjugué est concentré 30X (pour le protocole d’incubation court) / 150X (pour le protocole d’incubation long). À diluer avant utilisation, voir “Préparation des réactifs” en
page 2.
Matériel requis non fourni
Préparer les échantillons de lait
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur
thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible
sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur
de laboratoire. Les références catalogue qui s’affichent sous forme
de liens ouvrent les pages Web de ces produits.
Élément
Dégraisser les échantillons de lait.
1. Centrifuger les échantillons de lait à 1 000 × g pendant
15 minutes.
Les échantillons peuvent également être conservés au
réfrigérateur pendant au moins 16 heures.
2. À l’aide d’une pipette, prélever l'échantillon sous la couche
lipidique.
Les échantillons et les contrôles de lait sont testés à une dilution de
1:2 dans le Diluant échantillon réalisée en une étape (voir “Incuber
les échantillons et les contrôles” en page 2).
Source
Multiskan™ FC Microplate Photometer ou
équivalent[1]
Pipette monocanal (de 2 à 200 µl)
Pipette multi-canaux (de 20 à 500 µl)
Embouts de pipettes (conformes aux
recommandations du fabricant)
Plaque de prédilution
Eau déionisée ou distillée
Réservoirs à réactifs
Microtubes
51119000
PFL
PFL
thermofisher.com/
pipettetips
PFL
PFL
PFL
PFL
Préparation des réactifs
•
•
•
[1] Le lecteur de plaques doit pouvoir lire à 450 nm.
Instructions générales
• Ne pas mélanger des réactifs provenant de lots de kits
différents. Le mélange de réactifs provenant de lots différents
peut entraîner des données inexactes.
• Les barrettes non utilisées peuvent être conservées dans un
sachet hermétiquement fermé avec un sachet déssicant à 2-8°C
jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’emballage du kit.
Ne pas utiliser les barrettes après la date de péremption. Des
barrettes conservées de manière inappropriée ou des barrettes
périmées peuvent donner des résultats erronés.
• Dans cette notice, la température ambiante est définie comme
une température comprise entre 18 et 24°C.
• La tolérance pour les temps d’incubation est de ±10 %.
•
Porter les réactifs à température ambiante avant d’effectuer le
test.
Utiliser des réservoirs à usage unique pour distribuer les
réactifs
Préparer le Contrôle positif lait en diluant le réactif 3 : Contrôle
positif sérum au 1 : 17 avec le réactif 4 : Contrôle négatif lait.
Exemple : Pour une plaque, mélanger 10 µl de
réactif 3 : Contrôle positif sérum avec 160 µl de
réactif 4 : Contrôle négatif lait.
Diluer le réactif 8 : Solution de lavage (40X) au 1 : 40 avec de
l’eau distillée ou déionisée
Exemple : Pour une barrette, ajouter 500 µl de réactif
8 : Solution de lavage (40X) à 19,5 ml d’eau, puis mélanger.
La solution de lavage diluée peut être conservée jusqu'à 1 mois
à 2-8°C.
•
Avant de commencer
Préparer des échantillons de sérum et de plasma
Un échantillon frais, réfrigéré (8 jours à 2-8°C) ou congelé (1 an à
< −16°C) peut être utilisé. Il n’est pas recommandé de tester des
échantillons fortement hémolysés, qui peuvent donner un résultat
erroné. L’intradermotuberculination pourrait interférer avec le test et
entraîner des résultats faux positifs.
Les échantillons de sérum et de plasma sont testés à une dilution
de 1 : 30 dans le Diluant échantillon réalisée en 2 étapes (voir
“Incuber les échantillons et les contrôles” en page 2).
Remarque : En raison de la forte concentration en sels, le
réactif 8 : Solution de lavage (40X) peut contenir des cristaux.
Avant dilution, agiter le flacon pour dissoudre les cristaux.
Diluer le réactif 6 : Conjugué (30X/150X) avant utilisation.
– Pour un protocole avec incubation courte : diluer le réactif
6 : Conjugué (30X/150X) au 1 : 30 avec le réactif 7 : Diluant
conjugué. Exemple : Pour une plaque, diluer 400 µl de
réactif 6 : Conjugué (30X/150X) dans 11,6 ml de réactif
7 : Diluant conjugué.
– Pour un protocole avec incubation longue : diluer le
réactif 6 : Conjugué (30X/150X) au 1 : 150 avec le réactif
7 : Diluant conjugué. Exemple : Pour une plaque, diluer 80 µl
de réactif 6 : Conjugué (30X/150X) dans 11,92 ml de réactif
7 : Diluant conjugué.
Mise en œuvre du test ELISA
1
Incuber les échantillons
et les contrôles
1. Diluer les échantillons et les contrôles avec le Diluant échantillon dans la Plaque de prédilution,
selon le tableau suivant.
Quantité
Position du puits[1]
Diluant échantillon
Contrôle négatif sérum (NC)
Contrôle positif sérum (PC)
80 μl
10 μl
10 μl
Échantillon de sérum ou de plasma
10 μl
Tous les puits
A1 et B1
C1 et D1
Un puits (test en simplicat) ou deux puits adjacents (test en
duplicat)
Elément
Test sur le sérum ou le plasma
2
™
Notice d’utilisation du PrioCHECK Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit
1
(suite)
Elément
Test sur le lait
Quantité
Position du puits[1]
Diluant échantillon
Contrôle négatif lait (NC)
Contrôle positif lait (PC)
Échantillon de lait
60 μl
60 μl
60 μl
60 μl
Tous les puits
A1 et B1
C1 et D1
Un puits (test en simplicat) ou deux puits adjacents (test en
duplicat)
[1] Position suggérée dans la Plaque de prédilution.
2. Agiter doucement la plaque, puis incuber la Plaque de prédilution pendant 15 minutes à 24 heures
à température ambiante.
3. Transférer chaque échantillon et contrôle dilué de la Plaque de prédilution dans les puits
correspondants de la Plaque de test.
Elément
Test sur le sérum ou le plasma
Diluant échantillon
Dilution d'échantillon ou de contrôle de la Plaque
de prédilution
Test sur le lait
Dilution d'échantillon ou de contrôle de la Plaque
de prédilution
Quantité
Position du puits[1]
70 μl
Tous les puits
30 μl
Puit(s) correspondant(s) dans la Plaque de test
100 μl
Puit(s) correspondant(s) dans la Plaque de test
[1] Position suggérée dans la Plaque de test.
4. Couvrir la Plaque de test avec film adhésif, puis l'agiter doucement.
5. Incuber la plaque.
• Incubation courte : incuber la plaque pendant 45 minutes à température ambiante.
• Incubation longue : incuber la plaque pendant 16 à 20 heures à 2-8°C.
2
1. Vider la Plaque de test, puis laver les puits 3 fois avec 350 μl de solution de lavage diluée par puits
selon votre méthode de lavage.
Ajouter le Conjugué
dilué
IMPORTANT ! Ne pas laisser la plaque sécher.
• Lavage manuel : répéter le remplissage puis le vidage des puits par aspiration ou inversion.
Après le dernier cycle de lavage, tapoter la plaque sur un papier absorbant pour éliminer autant
de liquide que possible des puits.
• Utilisation d’un laveur de plaques automatisé : laver les puits en suivant les instructions de
l'instrument.
2. Ajouter 100 µl de Conjugué dilué à la Plaque de test.
3. Couvrir la Plaque de test avec un nouveau film adhésif.
4. Incuber la Plaque de test pendant 30 minutes à température ambiante.
3
1. Vider la Plaque de test, puis laver les puits 3 fois avec 350 μl de solution de lavage diluée par puits
selon votre méthode de lavage.
• Lavage manuel : répéter le remplissage puis le vidage des puits par aspiration ou inversion.
Après le dernier cycle de lavage, tapoter la plaque sur un papier absorbant pour éliminer autant
de liquide que possible des puits.
• Utilisation d’un laveur de plaques automatisé : laver les puits en suivant les instructions de
l'instrument.
2. Ajouter 100 µl de Substrat chromogène (TMB) à la Plaque de test.
3. Incuber la Plaque de test pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
4. Ajouter 100 μl de Solution d’arrêt à la Plaque de test dans le même ordre que le Substrat
chromogène (TMB).
5. Agiter doucement la Plaque de test.
6. Mesurer la densité optique (DO) des puits à l’aide d’un lecteur de plaques à 450 nm dans les
10 minutes suivant l’arrêt de la réaction.
Réaliser l’étape de
révélation puis lire la
plaque
Analyser les résultats
Critères de validation
Calculer les résultats
Le test est validé si les critères suivants sont respectés.
Calculer la DO (densité optique) moyenne du PC (DOm PC), et celle
du NC (DOm NC).
Pour chaque échantillon, calculer le pourcentage de positivité
(PP %) :
PP % = (DOéchantillon – DOm NC) / (DOm PC – DOm NC) × 100
Pour les échantillons négatifs, le PP % peut donner une valeur
< 0 %.
Tableau 2 Critères de validation par matrice d’échantillon
Matrice d’échantillon
Sérum
Plasma
Lait
Résultats
Incubation courte
Incubation longue
DOm NC ≤ 0,300
DOm NC ≤ 0,350
DOm PC > 0,800
DOm PC > 0,800
DOm NC ≤ 0,300
DOm PC > 0,800
Si les critères ci-dessus ne sont pas remplis, lire les instructions
de nouveau, puis refaire le test. Si les résultats sont toujours non
valides, veuillez contacter le support technique.
™
Notice d’utilisation du PrioCHECK Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit
3
Tableau 5 Sérums et plasmas ovins
Interprétation des résultats
Interpréter les résultats conformément aux tableaux suivants.
Tableau 3 Sérums, plasmas et échantillons de lait bovins
Résultats
Sérum et plasma
Interprétation
PP% ≥ 50
Positif
PP% ≤ 40
Négatif
40 < PP% < 50
Douteux
Lait (échantillons individuels et de grand mélange)
PP% ≥ 40
PP% ≤ 30
30 < PP% < 40
Positif
Négatif
Douteux
Tableau 4 Sérums et plasmas caprins
Résultats
Interprétation
PP% ≥ 60
PP% ≤ 50
50 < PP% < 60
Positif
Négatif
Douteux
Résultats
Interprétation
PP% ≥ 80
PP% ≤ 70
70 < PP% < 80
Positif
Négatif
Douteux
Obtenir le certificat d’analyse
1. Rendez-vous sur thermofisher.com.
2. Dans la barre de recherche, saisir le numéro de lot du certificat,
le numéro de lot est celui de votre kit.
Garantie limitée du produit
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent
leurs produits selon les termes et conditions générales de
vente disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/
home/global/terms-and-conditions.html. Pour toute question,
prendre contact avec Life Technologies à l’adresse
www.thermofisher.com/support.
Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands
Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition.
Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0029777 C.
Historique des révisions : Pub. nº MAN0029777 C
Révision
Date
Description
C
21 mai 2024
• Le type d’échantillon lait de grand mélange a été ajouté.
• Le nombre de tests fournis dans le tableau Contenu et conservation a été mis à jour (voir “Contenu et conservation”
en page 1).
• Des modifications mineures ont été apportées suite à la demande des autorités réglementaires.
B.0
18 janvier 2024
Le tableau Contenu et conservation a été mis à jour pour inclure le kit de 30 plaques (réf. A65416).
A.0
8 décembre 2023
Nouveau document pour PrioCHECK Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit.
™
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE
TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À
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17 septembre 2024
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