illumina NextSeq 550 Manuel utilisateur

PDF

Document

Guide du système NextSeq

550

Destiné à la recherche uniquement.

Ne pas utiliser dans le cadre d’examens diagnostiques.

EXCLUSIF À ILLUMINA

Nº de référence SY-415-9002DOC

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Octobre 2015

Avec Custom Protocol Selector, élaborez un document de référence personnalisé, court et inclusif à partir de votre flux de travail support.illumina.com/custom-protocol-selector.html

Ce document et son contenu sont exclusifs à Illumina, Inc. et ses sociétés affiliées (« Illumina »), et sont exclusivement destinés

à l’usage contractuel de son client dans le cadre de l’utilisation du ou des produits décrits dans les présentes et à aucune autre fin. Ce document et son contenu ne seront utilisés ou distribués à aucune autre fin et/ou communiqués, divulgués ou reproduits d’aucune façon sans le consentement écrit préalable d’Illumina. Illumina ne cède aucune licence en vertu de son brevet, de sa marque de commerce, de son copyright, ou de ses droits traditionnels ni des droits similaires d’un tiers quelconque par ce document.

Les instructions contenues dans ce document doivent être suivies strictement et explicitement par un personnel qualifié et adéquatement formé de façon à assurer l’utilisation correcte et sûre du ou des produits décrits dans les présentes. Le contenu intégral de ce document doit être lu et compris avant d’utiliser ces produits.

LE MANQUEMENT À LIRE COMPLÈTEMENT ET À SUIVRE EXPLICITEMENT TOUTES LES INSTRUCTIONS

CONTENUES DANS LES PRÉSENTES POURRA CAUSER DES DOMMAGES AUX PRODUITS, DES BLESSURES AUX

PERSONNES, UTILISATEURS OU AUTRES, ET DES DOMMAGES AUX AUTRES BIENS.

ILLUMINA DÉCLINE TOUTE RESPONSABILITÉ DÉCOULANT D’UNE UTILISATION INAPPROPRIÉE DU OU DES

PRODUIT(S) DÉCRIT(S) DANS LA PRÉSENTE (Y COMPRIS LEURS COMPOSANTES ET LE LOGICIEL).

Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cBot, CSPro, CytoChip, DesignStudio,

Epicentre, ForenSeq, Genetic Energy, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iScan, iSelect,

MiSeq, MiSeqDx, MiSeq FGx, NeoPrep, NextBio, Nextera, NextSeq, Powered by Illumina, SureMDA, TruGenome,

TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, la couleur orange citrouille et la conception de bases en flux continu sont des marques de commerce d’Illumina, Inc. ou de ses sociétés affiliées aux États-Unis ou dans d’autres pays. Tous les autres noms, logos et marques de commerce sont la propriété de leurs détenteurs respectifs.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Historique des révisions

Document

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01

15069765 B

15069765 A

Date

Octobre 2015

Mai 2015

Description des modifications

Spécification : un équivalent du fournisseur de NaOCl recommandé est un équivalent de laboratoire.

Ajout d’une recommandation pour le service de maintenance préventive annuel.

Réorganisation des renseignements dans les chapitres

Présentation et Premiers pas. Ajout d’instructions de personnalisation des paramètres du système.

Retrait des instructions d’aide en direct du chapitre Dépannage.

Cette option a été supprimée du logiciel de commande.

Correction de la description des réservoirs réservés de la cartouche de réactifs.

Publication originale.

Guide du système NextSeq 550 iii

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Table des matières

Historique des révisions

Table des matières

Guide du système NextSeq 550

iii

Annexe B Real-Time Analysis

Présentation de Real-Time Analysis

Flux de travail de Real-Time Analysis

Annexe C Fichiers et dossiers de sortie

Fichiers de sortie de séquençage

Structure du dossier de sortie de séquençage

Fichiers de sortie du balayage

Structure du dossier de sortie de balayage

Index

Assistance technique

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Chapitre 1 Présentation

Présentation

Introduction

Ressources supplémentaires

Composants de l’instrument

Présentation des consommables de séquençage

Guide du système NextSeq 550

Introduction

Le système NextSeq MD 550 d’Illumina MD est une solution unique qui fournit une transition fluide entre le séquençage à débit élevé et le balayage de puce à ADN.

Fonctionnalités de séquençage

}

Séquençage à débit élevé : le système NextSeq 550 permet de réaliser un séquençage des exomes, du génome entier et du transcriptome, et prend en charge les librairies TruSeq MD et Nextera MD .

} Types de Flow Cell : les Flow Cells sont disponibles dans des configurations pour débit moyen et débit élevé. Chaque type de Flow Cell est doté d’une cartouche de réactif compatible pré-remplie.

}

Real-Time Analysis (RTA) : ce logiciel d’analyse intégré exécute l’analyse des données sur instrument, ce qui comprend l’analyse d’images et la définition des bases. Le système NextSeq utilise une version de RTA appelée RTA v2, qui comporte d’importants changements en matière d’architecture et de fonctionnalités. Pour plus de renseignements, consultez la section

Real-Time Analysis à la page 73

}

Intégration de BaseSpace MD

: le flux de travail de séquençage est intégré à BaseSpace, l’environnement informatique consacré à la génomique d’Illumina pour l’analyse des données, leur stockage et leur partage. Pour les instruments configurés pour BaseSpace, les renseignements sur les librairies et les paramètres d’analyse sont précisés dans l’onglet Prep (Préparation) de BaseSpace. Les analyses configurées dans BaseSpace s’affichent dans l’interface de l’instrument pendant la configuration de l’analyse. Au cours de l’analyse, les fichiers de sortie sont transférés en temps réel vers BaseSpace ou

BaseSpace Onsite.

Fonctionnalités du balayage de la puce à ADN

}

Balayage de puce à ADN intégré au logiciel de commande : le NextSeq 550 vous permet de basculer entre le balayage de la puce à ADN et le séquençage à débit élevé sur le même instrument en utilisant le même logiciel de commande.

} Capacités d’imagerie étendues : le système d’imagerie du NextSeq 550 comprend des modifications du logiciel et de la platine qui permettent d’imager une plus grande surface afin de s’adapter au balayage de puces BeadChip.

}

Types de puce BeadChip : parmi les types de puce BeadChip compatibles figurent

CytoSNP-12, CytoSNP-850K, et Karyomap-12.

}

Adaptateur de puce BeadChip : un adaptateur de puce BeadChip réutilisable permet de charger facilement une puce BeadChip sur l’instrument.

} Analyse des données : utilisez le logiciel BlueFuse

Multi pour analyser les données des puces à ADN.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Ressources supplémentaires

Les documents suivants sont disponibles en téléchargement sur le site Web d’Illumina.

Ressource

Guide de préparation du site du système NextSeq (document nº 15045113)

Guide de sécurité et de conformité du système NextSeq (document nº 15046564)

Guide de l’utilisateur du lecteur RFID – modèle TR-001-44

(document nº 15041950)

Dénaturation et dilution de librairies pour le système NextSeq

(document nº 15048776)

Guide des primers personnalisés

NextSeq (document nº 15057456)

Aide BaseSpace

(help.basespace.illumina.com)

Description

Fournit les spécifications relatives à l’espace de laboratoire, les exigences électriques et les considérations environnementales.

Fournit des renseignements concernant les questions de sécurité, les déclarations de conformité et l’étiquetage de l’instrument.

Fournit des renseignements sur le lecteur RFID de l’instrument, les certificats de conformité et les questions de sécurité.

Fournit des instructions concernant la dénaturation et la dilution des librairies préparées pour une analyse de séquençage et des instructions au sujet de la préparation d’une librairie de contrôle PhiX facultative. Cette étape s’applique à la plupart des types de librairies.

Fournit des renseignements concernant l’utilisation de primers de séquençage personnalisés à la place de primers de séquençage d’Illumina.

Fournit des renseignements concernant l’utilisation de

BaseSpace MD et des options d’analyse disponibles.

Consultez la page d’aide du système NextSeq 550 dans le site Web d’Illumina pour accéder

à la documentation, aux téléchargements de logiciels, à la formation en ligne et aux foires aux questions.

Guide du système NextSeq 550

Composants de l’instrument

Le système NextSeq 550 comprend un moniteur tactile, une barre d’état et trois compartiments.

Figure 1 Composants de l’instrument

A Compartiment d’imagerie : contient la Flow Cell pour un séquençage ou l’adaptateur de puce BeadChip pour un balayage.

B Moniteur tactile : active la configuration sur instrument et la configuration à l’aide de l’interface du logiciel de commande.

C Barre d’état : indique si l’instrument est en cours de traitement (bleu), nécessite une attention particulière (orange) ou est prêt pour le séquençage (vert) ou lorsqu’un lavage doit être effectué dans les prochaines 24 heures (jaune).

D Compartiment du tampon : contient la cartouche de tampon et le réservoir de réactifs usagés.

E Compartiment de réactifs : contient la cartouche de réactifs.

Compartiment d’imagerie

Le compartiment d’imagerie contient la platine, qui comprend trois broches d’alignement pour le placement de la Flow Cell pour un séquençage ou de l’adaptateur de puce

BeadChip pour un balayage. Après le chargement de la Flow Cell ou de l’adaptateur de puce BeadChip, la porte du compartiment d’imagerie se ferme automatiquement et place les composants correctement.

Compartiments des réactifs et du tampon

Pour paramétrer une analyse de séquençage sur le NextSeq 550, vous devez accéder au compartiment des réactifs et au compartiment du tampon pour charger les consommables de l’analyse et vider le réservoir à réactifs usagés.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Figure 2 Compartiments des réactifs et du tampon

Porte du compartiment des réactifs : elle ferme le compartiment des réactifs à l’aide d’un verrou qui se trouve sous le coin inférieur droit de la porte. Le compartiment des réactifs contient la cartouche de réactifs. Les réactifs sont pompés par les dispositifs d’aspiration, le système fluidique et la Flow Cell.

Cartouche de réactifs : la cartouche de réactifs est un consommable à usage unique prérempli.

Cartouche du tampon : la cartouche du tampon est un consommable à usage unique prérempli.

Réservoir à réactifs usagés : les réactifs usagés sont recueillis pour leur mise au rebut après chaque analyse.

Porte du compartiment du tampon : elle ferme le compartiment du tampon à l’aide d’un verrou qui se trouve sous le coin inférieur gauche de la porte.

NextSeq Logiciel

Le logiciel de l’instrument comprend des applications intégrées qui réalisent des analyses de séquençage ou des balayages de puce à ADN.

} NextSeq Control Software (NCS) : l’interface du logiciel de commande vous guide tout au long des étapes de configuration d’une analyse de séquençage ou d’un balayage de puce à ADN.

}

Logiciel Real-Time Analysis (RTA) : pour les analyses de séquençage, RTA effectue l’analyse des images et la définition des bases lors de l’analyse. Le NextSeq 550 utilise

RTA v2, qui comprends d’importants changements d’architecture et de fonctionnalités par rapport aux versions plus anciennes. Pour plus de renseignements, consultez la section

Real-Time Analysis à la page 73 .

Icônes d’état

Une icône d’état située dans le coin supérieur droit de l’interface du logiciel de commande signale toute modification des conditions pendant la configuration de l’analyse ou pendant l’analyse.

Icône d’état Nom de l’état

État correct

Description

Le système est normal.

Traitement Le système est en cours de traitement.

Guide du système NextSeq 550

Icône d’état Nom de l’état

Avertissement

Erreur

Description

Un avertissement a eu lieu.

Les avertissements n’interrompent pas une analyse et ne nécessitent pas d’intervention pour la poursuite de l’analyse.

Une erreur a eu lieu.

Les erreurs nécessitent une intervention avant la poursuite de l’analyse.

Lorsqu’un changement de situation se produit, l’icône clignote afin de vous alerter.

Sélectionnez l’icône pour afficher une description du problème. Sélectionnez Acknowledge

(Accusé de réception) pour accepter le message et Close (Fermer) pour fermer la boîte de dialogue.

Bouton d’alimentation

Le bouton d’alimentation situé sur la partie avant du NextSeq met sous tension l’instrument et l’ordinateur de l’instrument. Il réalise les actions suivantes en fonction de l’état de l’alimentation de l’instrument.

État de l’alimentation

Instrument hors tension

Instrument sous tension

Action

Appuyez brièvement sur le bouton pour le mettre sous tension.

Appuyez brièvement sur le bouton pour le mettre hors tension.

Une boîte de dialogue s’affiche à l’écran pour confirmer que l’instrument s’est arrêté normalement.

Appuyez et maintenez le bouton d’alimentation pendant

10 secondes pour provoquer un arrêt forcé de l’instrument et de l’ordinateur de l’instrument.

Utilisez cette méthode pour mettre l’instrument hors tension uniquement si l’instrument ne répond pas.

REMARQUE

Mettre l’instrument hors tension au cours d’une analyse de séquençage arrête immédiatement celle-ci. L’arrêt d’une analyse est définitif. Les consommables de l’analyse ne peuvent pas être réutilisés et les données de séquençage de l’analyse ne sont pas enregistrées.

Présentation de l’adaptateur de puce BeadChip réutilisable

L’adaptateur de puce BeadChip contient la puce BeadChip pendant le balayage. La puce

BeadChip est fixée dans l’étagère encastrée de l’adaptateur grâce à la pince de maintien.

L’adaptateur de puce BeadChip est ensuite chargé sur la platine dans le compartiment d’imagerie.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Figure 3 Adaptateur de puce BeadChip réutilisable

A Adaptateur de puce BeadChip

B Pince de maintien

Guide du système NextSeq 550

Présentation des consommables de séquençage

Pour effectuer une analyse de séquençage sur le NextSeq 550, une trousse Trousse

NextSeq 500/550 à usage unique est nécessaire. Chaque trousse comprend une Flow Cell et les réactifs nécessaires à la réalisation d’une analyse de séquençage.

La Flow Cell, la cartouche de réactifs et la cartouche de tampon utilisent une identification par radiofréquence (RFID) pour un suivi précis des consommables et pour des questions de compatibilité.

Étiquetage de compatibilité de la trousse

Des codes de couleurs figurent sur les composants de la trousse, afin d’indiquer la compatibilité des Flow Cell avec les cartouches de réactifs. Utilisez toujours une cartouche de réactifs et une Flow Cell compatibles. La cartouche de tampon est universelle.

Toutes les Flow Cell et toutes les cartouches de réactifs sont étiquetées High (Élevé) ou Mid

(Moyen). Vérifiez toujours l’étiquette lorsque vous préparez les consommables pour une analyse.

Type de trousse Marquage sur l’étiquette

Composants de la trousse de débit élevé

Composants de la trousse de débit moyen

Présentation de la Flow Cell

Figure 4 Cartouche de Flow Cell

A Paire de lignes A : lignes 1 et 3

B Paire de lignes B : lignes 2 et 4

C Châssis de la cartouche de Flow Cell

La Flow Cell est un substrat de verre qui sert de support à la génération des amplifiats et à la réaction de séquençage. La Flow Cell est enchâssée dans une cartouche de Flow Cell.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

La Flow Cell contient quatre lignes qui sont imagées par paires.

}

Les lignes 1 et 3 (paire de lignes A) sont imagées simultanément.

}

Les lignes 2 et 4 (paire de lignes B) sont imagées lorsque l’imagerie de la paire de lignes A est terminée.

Bien que la Flow Cell contienne quatre lignes, une seule librairie ou un seul ensemble de librairies uniquement est séquencé sur la Flow Cell. Les librairies sont chargées sur la cartouche de réactifs dans un réservoir unique et transférées automatiquement sur les quatre lignes de la Flow Cell.

Chaque ligne est imagée par petites zones d’imagerie appelées plaques. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section

Plaques de la Flow Cell à la page 81

Présentation de la cartouche de réactifs

La cartouche de réactifs est un consommable à usage unique doté d’un système de suivi RFID et de réservoirs scellés par un opercule en aluminium, pré-remplis de réactifs d’amplification et de séquençage.

Figure 5 Cartouche de réactifs

La cartouche de réactifs contient un réservoir désigné pour le chargement de librairies préparées. Après le lancement de l’analyse, les librairies sont transférées automatiquement du réservoir à la Flow Cell.

Plusieurs réservoirs sont réservés pour le lavage après analyse automatique. La solution de lavage est pompée de la cartouche de tampon jusqu’aux réservoirs réservés, à travers le système, puis jusqu’au réservoir de réactifs usagés.

AVERTISSEMENT

équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Manipulez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminezles conformément aux normes de sécurité gouvernementales en vigueur dans votre

région. Pour plus de renseignements sur l’environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse, mise à votre disposition à l’adresse support.illumina.com/sds.html

Guide du système NextSeq 550

Réservoirs réservés

Figure 6 Réservoirs numérotés

Position

7, 8 et 9

Description

Réservés pour des primers personnalisés facultatifs

Charger les librairies

Pour plus de renseignements concernant les primers personnalisés, consultez le Guide des

primers personnalisés NextSeq (document nº 15057456).

Réservoir amovible en position nº 6

La cartouche de réactifs préremplie comprend un réactif de dénaturation en position nº 6 qui contient du formamide. Pour faciliter l’élimination sûre de tout réactif non utilisé après l’analyse de séquençage, le réservoir en position nº 6 est amovible. Pour obtenir plus de renseignements, consultez

Retirer le réservoir usagé de la position nº 6 à la page 27

Présentation de la cartouche de tampon

La cartouche de tampon est un consommable à usage unique contenant trois réservoirs préremplis de solutions tampon et d’une solution de lavage. Le contenu de la cartouche de tampon est suffisant pour séquencer une Flow Cell.

Figure 7 Cartouche de tampon

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Chapitre 2 Premiers pas

Premiers pas

Démarrage de l’instrument

Personnaliser les paramètres du système

Personnaliser les paramètres de l’analyse

Consommables et équipement fournis par l’utilisateur

Guide du système NextSeq 550

Démarrage de l’instrument

Basculez l’interrupteur en position I (Marche).

Figure 8 Interrupteur d’alimentation situé à l’arrière de l’instrument

1 Appuyez sur le bouton d’alimentation situé au-dessus du compartiment des réactifs. Le bouton d’alimentation active l’alimentation de l’instrument et démarre l’ordinateur et les logiciels intégrés à l’instrument.

Figure 9 Bouton d’alimentation situé à l’avant de l’instrument

2 Attendez le chargement complet du système d’exploitation.

Le NextSeq Control Software (NCS) démarre et lance automatiquement le système. À la fin de l’étape d’initialisation, l’écran d’accueil s’ouvre.

3 Si votre système a été configuré de manière à nécessiter des identifiants d’ouverture de session, ouvrez une session à l’aide du nom d’utilisateur et du mot de passe par défaut :

}

Nom d’utilisateur : sbsuser

} Mot de passe : sbs123

Sinon, ouvrez une session à l’aide des identifiants définis pour votre site.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Personnaliser les paramètres du système

Le logiciel de commande comporte des paramètres du système personnalisables pour les options de démarrage, les préférences d’entrée, les paramètres audio et le nom de l’instrument.

Sélectionner l’option de démarrage

1 Dans l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System

Customisation (Personnalisation du système).

2 Sélectionnez l’une des options de démarrage suivantes :

} Sélectionnez Kiosk Mode (Mode kiosque) pour afficher l’interface du logiciel de commande en plein écran.

}

Sélectionnez Windows Mode (Mode Windows) pour accéder à Windows sur l’ordinateur de l’instrument. Toute interaction avec l’interface du logiciel, comme par exemple l’emplacement des boutons, risque d’être modifiée dans ce mode.

3 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer les paramètres et faire défiler l’écran.

Configurer l’option d’entrée et l’indicateur sonore

1 Depuis l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System

Customisation (Personnalisation du système).

2 Cochez la case Use on-screen keyboard (Utiliser le clavier sur l’écran) pour activer le clavier sur l’écran pour l’entrée sur l’instrument.

3 Cochez la case Play audio (Lire les sons) afin d’activer les indicateurs sonores pour les

événements suivants.

} Lors de l’initialisation de l’instrument

} Lors du démarrage d’une analyse

}

Lors de la survenue de certaines erreurs

}

Lorsqu’une action de l’utilisateur est requise

} Lorsqu’une analyse est terminée

4 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer les paramètres et faire défiler l’écran.

Personnaliser l’identification de l’instrument

1 Depuis l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System

Customisation (Personnalisation du système).

2 Pour attribuer une image de votre choix à l’instrument, sélectionnez Browse (Parcourir) et localisez l’image.

3 Saisissez un nom préféré pour l’instrument dans le champ Nick Name (Surnom).

4 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer les paramètres et faire défiler l’écran.

L’image et le nom apparaissent dans le coin supérieur gauche de chaque écran.

Guide du système NextSeq 550

Personnaliser les paramètres de l’analyse

Le logiciel de commande contient des paramètres personnalisables pour les préférences de configuration de l’analyse et l’élimination des réactifs inutilisés.

Configurer les options de configuration de l’analyse

1 Dans l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System

Customization (Personnalisation du système).

2 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour passer à Run Customization (Personnalisation de l’analyse).

3 Cochez la case Use Advanced Load Consumables (Utiliser les consommables de chargement avancé) pour activer l’option permettant le chargement de tous les consommables de l’analyse à partir d’un écran unique.

4 Cochez la case Skip Pre-Run Check Confirmation (Ignorer la confirmation de la vérification avant analyse) pour démarrer automatiquement le séquençage ou le balayage une fois la vérification automatique correctement effectuée.

5 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer les paramètres et quitter l’écran.

Configurer l’option d’élimination automatique

1 Depuis l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System

Customisation (Personnalisation du système).

2 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour passer à Run Customization (Personnalisation de l’analyse).

3 Cochez la case Purge Consumables at End of Run (Éliminer les consommables à la fin de l’analyse) pour éliminer automatiquement les réactifs inutilisés de la cartouche de réactifs vers le réservoir des réactifs usagés après chaque analyse.

REMARQUE

L’élimination automatique des consommables ajoute une durée supplémentaire au flux de travail.

4 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer les paramètres et quitter l’écran.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Consommables et équipement fournis par l’utilisateur

L’équipement et les consommables suivants sont utilisés sur le NextSeq 550.

Consommables fournis par l’utilisateur pour les analyses de séquençage

Consommable

1 N NaOH

(hydroxyde de sodium)

Tris-HCl 200 mM, pH7

Lingettes alcoolisées, isopropyle à 70 % ou

Éthanol à 70 %

Gants jetables, sans talc

Chiffon de laboratoire peu pelucheux

Fournisseur

Fournisseur de laboratoire général

VWR, nº de référence

95041-714

(ou équivalent)

Fournisseur de laboratoire général

VWR, nº de référence

21905-026

(ou équivalent)

Utilisation

Dénaturation de librairie, diluée

à 0,2 N

Dénaturation de librairie

Nettoyage de la Flow Cell et usage général

Usage général

Nettoyage de la Flow Cell

Consommables fournis par l’utilisateur pour la maintenance de l’instrument

Consommable

NaOCl, 5 %

(hypochlorite de sodium)

Tween 20

Eau de laboratoire

Fournisseur

Sigma-Aldrich, nº de référence 239305

(ou équivalent pour laboratoire)

Sigma-Aldrich, nº de référence P7949

Fournisseur de laboratoire général

Utilisation

Lavage de l’instrument à l’aide de la fonction de lavage manuel après analyse; dilution à 0,12 %

Lavage de l’instrument à l’aide des options de lavage manuel, dilution à 0,05 %

Lavage de l’instrument (lavage manuel)

Recommandations à propos de l’eau de laboratoire

Utilisez toujours de lʼeau de laboratoire pour réaliser des procédures sur l’instrument.

N’utilisez jamais d’eau courante ou d’eau désionisée. Voici des exemples d’eaux de laboratoire acceptables :

}

PW1 d’Illumina

}

Eau 18 mégohms (MΩ)

}

Eau Milli-Q

} Eau Super-Q

}

Eau de qualité biologie moléculaire

Équipement fourni par l’utilisateur

Élément

Congélateur, de -15 à -25 °C, sans givre

Bac à glaçons

Réfrigérateur, de 2 à 8 °C

Source

Fournisseur de laboratoire général

Guide du système NextSeq 550

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Chapitre 3 Séquençage

Séquençage

Introduction

Flux de travail de séquençage

Préparer la cartouche de réactifs

Préparer la Flow Cell

Préparer des librairies pour le séquençage

Configurer une analyse de séquençage

Surveiller la progression de l’analyse

Lavage automatique après analyse

Guide du système NextSeq 550

Introduction

Pour effectuer une analyse de séquençage sur le NextSeq 550, préparez une cartouche de réactifs et une Flow Cell, puis suivez les indications du logiciel pour configurer et démarrer l’analyse. La génération d’amplifiats et le séquençage sont effectués sur instrument. Après l’analyse, un lavage de l’instrument commence automatiquement à l’aide des composants déjà chargés sur l’instrument.

Génération d’amplifiats

Lors de la génération d’amplifiats, les molécules d’ADN uniques sont liées à la surface de la Flow Cell, puis subissent une amplification de façon à former des amplifiats.

Séquençage

Les amplifiats sont imagés à l’aide d’une chimie de séquençage à deux canaux et de combinaisons de filtres propres à chacun des terminateurs de chaîne marqués par fluorescence. Lorsque l’imagerie d’une plaque sur la Flow Cell est terminée, la plaque suivante est imagée. Ce processus se répète pour chaque cycle de séquençage. Après l’analyse de l’image, le logiciel définit les bases, les filtre et leur attribue un score de qualité.

Surveillez la progression et les statistiques de l’analyse à partir de l’interface du logiciel de commande, de l’onglet Run (Analyse) dans BaseSpace ou d’un ordinateur en réseau utilisant le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV). Consultez la section

Visualiseur

d’analyse de séquençage à la page 31 .

Analyse

Pendant la progression de l’analyse, le logiciel de commande transfère automatiquement les fichiers de définition des bases (BCL) vers BaseSpace ou l’emplacement de sortie indiqué pour l’analyse secondaire.

Plusieurs méthodes d’analyse sont disponibles en fonction de votre application. Pour plus de renseignements, consultez l’Aide BaseSpace (help.basespace.illumina.com).

Durée de l’analyse de séquençage

La durée de l’analyse de séquençage dépend du nombre de cycles réalisés. La longueur de lecture maximale est une analyse à lecture appariée comprenant 150 cycles par lecture

(2 x 150) plus jusqu’à huit cycles de chaque pour deux lectures d’index.

Pour les durées attendues et autres spécifications du système, consultez la page des spécifications du système NextSeq 550 sur le site Web d’Illumina.

Nombre de cycles dʼune lecture

Lors d’une analyse de séquençage, une lecture comprend un cycle de plus que le nombre de cycles analysés. Par exemple, une analyse de 150 cycles à lecture appariée effectue des lectures de 151 cycles (2 × 151), pour un total de 302 cycles. À la fin de lʼanalyse,

2 x 150 cycles sont analysés. Le cycle supplémentaire est requis pour les calculs de la mise en phase et de la préphase.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Flux de travail de séquençage

Pour les configurations utilisant BaseSpace ou BaseSpace Onsite d’Illumina : configurez l’analyse dans l’onglet Prep (Préparation) de BaseSpace. Consultez l’Aide BaseSpace

(help.basespace.illumina.com).

Préparez une nouvelle cartouche de réactifs : décongelez et inspectez.

Préparez une nouvelle Flow Cell : amenez à température ambiante, déballez et inspectez.

Dénaturez et diluez les librairies (ne s’applique pas à tous les types de librairies). Consultez

Dénaturation et dilution de librairies pour le système NextSeq (document nº 15048776).

Chargez la dilution de la librairie sur la cartouche de réactifs dans le réservoir nº 10.

À partir de l’interface logicielle, sélectionnez Sequence (Séquence) pour lancer les étapes de configuration de l’analyse.

Chargez la Flow Cell.

Videz et rechargez le réservoir de réactifs usagés.

Chargez la cartouche de tampon et la nouvelle cartouche de réactifs.

Examinez les paramètres de l’analyse et les résultats de la vérification automatique.

Sélectionnez Start (Démarrer).

Surveillez votre analyse à partir de l’interface du logiciel de commande, de l’onglet Run

(Analyse) sur BaseSpace ou depuis un ordinateur en réseau utilisant le visualiseur d’analyse de séquençage.

Un lavage de l’instrument démarre automatiquement lorsque le séquençage est terminé.

Guide du système NextSeq 550

Préparer la cartouche de réactifs

1 Retirez la cartouche de réactifs de son lieu de stockage à -25 à -15 °C.

2 Faites décongeler dans un bain d’eau à température ambiante jusqu’à décongélation

(environ 60 minutes). N’immergez pas la cartouche.

3 Tapotez doucement sur la paillasse pour éliminer l’eau de la base, puis séchez la base.

REMARQUE

[Autre méthode] Décongelez les réactifs en les laissant une nuit entre 2 et 8 °C. Il faut au moins 18 heures aux réactifs pour décongeler complètement. À cette température, les réactifs sont stables pendant une durée allant jusqu’à une semaine.

4 Retournez la cartouche cinq fois pour mélanger les réactifs.

5 Inspectez les positions 29, 30, 31 et 32 pour vérifier que les réactifs sont décongelés.

6 Tapotez doucement sur la paillasse pour réduire les bulles dʼair.

AVERTISSEMENT

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Préparer la Flow Cell

1 Sortez un nouvel emballage de Flow Cell de son lieu de stockage à 2 à 8 °C.

2 Laissez l’emballage ouvert de la Flow Cell à température ambiante pendant

30 minutes.

REMARQUE

Si l’emballage en papier aluminium est intact, la Flow Cell peut rester à température ambiante durant 12 heures. Évitez les modifications de température répétées de la

Flow Cell.

3 Sortez la Flow Cell de son emballage en aluminium.

Figure 10 Retrait de l’emballage en aluminium

4 Ouvrez l’emballage double coque en plastique transparent et sortez la Flow Cell.

Figure 11 Retirer de l’emballage double coque

5 Nettoyez la surface en verre de la Flow Cell à l’aide d’une lingette alcoolisée non pelucheuse. Séchez le verre à l’aide d’un chiffon de laboratoire peu pelucheux.

Inspecter la Flow Cell

1 Assurez-vous que les ports de Flow Cell ne sont pas obstrués.

2 Vérifiez que les joints de port sont fixés et que les tenons en plastique blanc sont visibles.

Guide du système NextSeq 550

Figure 12 Composants de la Flow Cell

A Joints de port (4)

B Pinces de maintien (4)

C Pinces à ressort (4)

D Châssis de la cartouche de Flow Cell

E Plaque de support

3 Assurez-vous que les quatre pinces de maintien blanches sont bien encliquetées sur le bord de la plaque de support noire.

Si la plaque n’est pas bien fixée sous les pinces, appuyez doucement sur la plaque de support noire et sur le châssis de la cartouche blanche, jusqu’à ce que la plaque s’enclenche sous les pinces.

Figure 13 Inspection des pinces de maintien

A Mauvais positionnement : la pince de maintien n’est pas encliquetée sur le bord de la plaque de support.

B Bon positionnement : la pince de maintien est encliquetée sur le bord de la plaque de support.

4 Vérifiez que les quatre pinces métalliques à ressort sont positionnées à plat contre la plaque de support noire.

Figure 14 Inspection des pinces à ressort

A Mauvais positionnement : la pince à ressort n’est pas à plat contre la plaque de support.

B Bon positionnement : la pince à ressort est à plat contre la plaque de support.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Préparer des librairies pour le séquençage

Le volume et la concentration de chargement de la librairie varient selon la version du

NCS que vous utilisez.

Version du logiciel de commande

NCS v1.3 ou ultérieure

NCS v1.2 ou antérieure

Volume de la librairie

1,3 ml

3 ml

Concentration de la librairie

1,8 pM

3 pM

Dénaturer et diluer les librairies

Si cela est nécessaire pour votre type de librairie, dénaturez et diluez les librairies et ajoutez une librairie de contrôle PhiX. Le volume et la concentration de chargement de la librairie varient selon la version du NCS que vous utilisez. Pour plus de renseignements, consultez

Dénaturation et dilution de librairies pour le système NextSeq (document nº 15048776).

Charger des librairies sur la cartouche de réactifs

1 Nettoyez l’opercule en aluminium recouvrant le réservoir nº 10 étiqueté Load Library

Here (Charger la librairie ici) à l’aide d’un tissu non pelucheux.

2 Percez l’opercule à l’aide d’un embout de pipette de 1 ml propre.

3 Chargez les librairies dans le réservoir nº 10 étiqueté Load Library Here (Charger la librairie ici). Évitez de toucher l’opercule en aluminium pendant le transfert du produit.

Figure 15 Charger les librairies

Guide du système NextSeq 550

Configurer une analyse de séquençage

1 Sur l’écran d’accueil, sélectionnez Experiment (Expérience), puis sélectionnez

Sequence (Séquence).

La commande Sequence (Séquence) ouvre la porte du compartiment d’imagerie, libère les consommables utilisés lors d’une analyse précédente et ouvre une série d’écrans de configuration de l’analyse. Un court délai est normal.

Si l’instrument est configuré pour BaseSpace, vous êtes invité à vous connecter à

BaseSpace. Si l’instrument est configuré en mode autonome, l’étape suivante est le chargement de la Flow Cell.

Se connecter à BaseSpace

1 Saisissez votre nom d’utilisateur et votre mot de passe BaseSpace

2 Sélectionnez Next (Suivant).

Charger la Flow Cell

1 Retirez la Flow Cell usagée ayant servi à la précédente analyse.

2 Alignez la Flow Cell sur les broches d’alignement et placez-la sur la platine.

Figure 16 Charger la Flow Cell

3 Sélectionnez Load (Charger).

La porte se ferme automatiquement, l’identifiant de la Flow Cell s’affiche à l’écran et les capteurs sont activés.

4 Sélectionnez Next (Suivant).

Vider le réservoir à réactifs usagés

1 Retirez le réservoir à réactifs usagés et éliminez son contenu selon les normes en vigueur.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Figure 17 Retirer le réservoir à réactifs usagés

REMARQUE

Placez votre autre main sous le contenant lorsque vous le retirez afin de le soutenir.

AVERTISSEMENT

2 Faites glisser le réservoir à réactifs usagés vide dans le compartiment de tampon jusqu’à la butée. Un déclic indique que le contenant est en place.

Figure 18 Charger le réservoir à réactifs usagés vide

Guide du système NextSeq 550

Charger la cartouche de tampon

1 Retirez la cartouche de tampon usagée du compartiment supérieur.

2 Glissez une nouvelle cartouche de tampon dans le compartiment de tampon jusqu’à la butée.

Un déclic indique que la cartouche est en position, l’identifiant de la cartouche de tampon s’affiche à l’écran et le capteur est activé.

Figure 19 Charger la cartouche de tampon

3 Fermez la porte du compartiment de tampon et sélectionnez Next (Suivant).

Charger la cartouche de réactifs

1 Retirez la cartouche de réactifs usagée du compartiment de réactifs. Mettez au rebut les contenus inutilisés conformément aux normes en vigueur.

AVERTISSEMENT

Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Manipulez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminez-les conformément aux normes de sécurité gouvernementales

en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements sur l’environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse, mise à votre disposition à l’adresse support.illumina.com/sds.html

REMARQUE

Le réservoir à la position 6 est amovible pour faciliter la mise au rebut en toute sécurité des réactifs inutilisés. Pour obtenir plus de renseignements, consultez

Retirer le réservoir

usagé de la position nº 6 à la page 27 .

2 Faites glisser la cartouche de réactifs dans le compartiment de réactifs jusqu’à ce qu’elle s’arrête, puis refermez la porte du compartiment de réactifs.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Figure 20 Charger la cartouche de réactifs

3 Sélectionnez Load (Charger).

Le logiciel positionne automatiquement la cartouche (environ 30 secondes), l’identifiant de la cartouche de réactifs s’affiche à l’écran et les capteurs sont activés.

4 Sélectionnez Next (Suivant).

Retirer le réservoir usagé de la position nº 6

1 Après avoir retiré la cartouche de réactifs usagés de l’instrument, retirez le couvercle de protection en caoutchouc recouvrant la fente à côté de la position nº 6.

Figure 21 Position nº 6 amovible

A Couvercle de protection en caoutchouc

B Position nº 6

2 Appuyez sur l’onglet en plastique transparent, puis poussez vers la gauche pour éjecter le réservoir.

3 Mettez le réservoir au rebut conformément aux normes de sécurité.

Indiquer les paramètres de l’analyse

Les étapes figurant sur l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse) diffèrent selon la configuration du système :

}

BaseSpace ou BaseSpace Onsite : l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse) indique les analyses configurées avec l’onglet Prep de BaseSpace. Si l’analyse prévue n’apparaît pas sur l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse), vérifiez qu’elle est marquée pour séquençage dans BaseSpace.

}

Autonome : l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse) comporte des champs permettant de définir les paramètres de l’analyse.

Guide du système NextSeq 550

Sélectionner une analyse disponible (configuration de BaseSpace)

1 Sélectionnez un nom d’analyse dans la liste des analyses disponibles.

Utilisez les flèches haut et bas pour faire défiler la liste ou saisissez le nom d’une analyse dans le champ de recherche.

2 Sélectionnez Next (Suivant).

3 Confirmez les paramètres de l’analyse.

} Run Name (Nom de l’analyse) : le nom de l’analyse tel qu’attribué dans BaseSpace.

}

Library ID (ID de librairie) : le nom des librairies groupées tel qu’attribué dans

BaseSpace.

}

Recipe (Formule) : le nom de la formule, NextSeq High ou NextSeq Mid, en fonction de la cartouche de réactifs utilisée pour l’analyse.

} Read Type (Type de lecture) : lecture unique ou appariée.

}

Read Length (Longueur de la lecture) : le nombre de cycles par lecture.

}

[Facultatif] Primers personnalisés, le cas échéant.

4 [Facultatif] Sélectionnez l’icône Edit (Modifier) pour modifier les paramètres de l’analyse. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez Save (Enregistrer).

}

Run parameters (Paramètres d’analyse) : modifier le nombre de lectures ou le nombre de cycles par lecture.

}

Custom primers (Primers personnalisés) : modifier les réglages des primers personnalisés utilisés. Pour plus de renseignements, consultez le Guide des primers

personnalisés NextSeq (document nº 15057456).

}

Purge consumables for this run (Éliminer les consommables pour cette analyse) : modifier ce réglage pour éliminer automatiquement les consommables après l’analyse en cours.

5 Sélectionnez Next (Suivant).

Saisir des paramètres d’analyse (configuration autonome)

1 Saisissez le nom d’analyse de votre choix.

2 [Facultatif] Saisissez un identifiant de librairie de votre choix.

3 Sélectionnez une formule dans la liste déroulante Recipe (Formule). Seules les formules compatibles sont répertoriées.

4 Sélectionnez un type de lecture, soit Single Read (Lecture unique), soit Paired End

(Lecture appariée).

5 Indiquez le nombre de cycles pour chaque lecture de l’analyse de séquençage.

}

Read 1 (Lecture 1) : saisissez une valeur dans la limite de 151 cycles.

} Read 2 (Lecture 2) : saisissez une valeur dans la limite de 151 cycles. Cette valeur est généralement identique au nombre de cycles de la lecture 1.

}

Index 1 : saisissez le nombre de cycles nécessaire pour le primer d’index 1 (i7).

}

Index 2 : saisissez le nombre de cycles nécessaire pour le primer d’index 2 (i5).

Le logiciel de commande confirme vos saisies à l’aide des critères suivants :

} Le nombre total de cycles ne dépasse pas le nombre total de cycles permis.

}

Les cycles de la lecture 1 sont supérieurs aux cinq cycles utilisés pour la génération du modèle.

}

Les cycles de lecture d’index ne dépassent pas les cycles de lecture 1 et de lecture 2.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

6 [Facultatif] Si vous utilisez des primers personnalisés, cochez la case correspondant aux primers utilisés. Pour plus de renseignements, consultez le Guide des primers

personnalisés NextSeq (document nº 15057456).

} Lecture 1 : primer personnalisé pour la lecture 1.

}

Lecture 2 : primer personnalisé pour la lecture 2.

}

Index 1 : primer personnalisé pour l’index 1.

}

Index 2 : primer personnalisé pour l’index 2.

7 [Facultatif] Sélectionnez l’icône Edit (Modifier) pour modifier les paramètres de l’analyse. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez Save (Enregistrer).

}

Output folder location (Emplacement du dossier de sortie) : changer l’emplacement du dossier de sortie pour l’analyse en cours. Sélectionnez Browse (Parcourir) pour sélectionner l’emplacement réseau.

} Purge consumables for this run (Éliminer les consommables pour cette analyse) : modifier ce réglage pour éliminer automatiquement les consommables après l’analyse en cours.

}

Use run monitoring for this run (Utiliser le suivi d’analyse pour cette analyse) : modifier le réglage pour activer le suivi d’analyse dans BaseSpace.

8 Sélectionnez Next (Suivant).

Réviser la vérification automatisée

Le logiciel effectue une vérification automatisée du système. Lors de la vérification, les indicateurs suivants s’affichent sur l’écran :

}

Crochet gris : la vérification n’a pas été encore effectuée.

}

Icône

de progression : la vérification est en cours.

} Crochet vert : la vérification a réussi.

}

Croix rouge : la vérification a échoué. Pour tous les éléments non validés, une action est nécessaire avant que vous puissiez continuer. Consultez la section

Résoudre les

erreurs de vérification automatique à la page 55 .

Pour arrêter une vérification automatisée en cours, sélectionnez l’icône située dans le coin inférieur droit. Pour redémarrer la vérification, sélectionnez l’icône . La vérification reprend à la première vérification incomplète ou échouée.

Pour afficher les résultats de chaque vérification dans une catégorie, cliquez sur l’icône d’agrandissement de la catégorie.

Démarrer l’analyse

Une fois la vérification automatique terminée, sélectionnez Start (Démarrer). L’analyse de séquençage commence.

Pour configurer le système afin de démarrer automatiquement l’analyse après une vérification réussie, consultez la section

Configurer les options de configuration de l’analyse à la page 14 .

Guide du système NextSeq 550

Surveiller la progression de l’analyse

1 Surveillez la progression, les intensités et les scores de qualité de l’analyse à mesure que les indicateurs s’affichent à l’écran.

Figure 22 Progression et indicateurs de l’analyse de séquençage

A Run Progress (Progression de l’analyse) : indique l’étape en cours et le nombre de cycles réalisés pour chaque lecture. La longueur de la barre de progression n’est pas proportionnelle au débit d’analyse de chaque étape. Utilisez le temps restant dans le coin supérieur droit pour déterminer la durée exacte.

B Q-Score : indique la répartition des scores de qualité (Q-scores). Consultez

Notation de la

qualité à la page 78

C Intensity (Intensité) : indique la valeur de l’intensité des amplifiats du 90 e percentile de chaque plaque. Les couleurs du tracé indiquent chaque base : A est rouge, C, vert, G, bleu et T, noir. Les couleurs correspondent aux indicateurs de bases utilisés dans le logiciel d’analyse de séquençage (SAV).

D Cluster Density (K/mm²) (Densité des amplifiats [K/mm²]) : indique le nombre dʼamplifiats détectés pour lʼanalyse.

E Clusters Passing Filter (%) (Amplifiats passant par le filtre [%]) : indique le pourcentage d’amplifiats passant par le filtre. Consultez la section

Amplifiats passant par le filtre à la page 75

F Estimated Yield (Gb) (Estimation de rendement [Gb]) : indique le nombre de bases prévues pour l’analyse.

G Image de la Flow Cell : indique le processus en cours sur chaque paire de lignes. Une paire de lignes est imagée tandis qu’une autre paire est à une étape de chimie.

REMARQUE

Après avoir sélectionné Home (Accueil), il est impossible de revenir en arrière pour afficher les indicateurs de l’analyse. Toutefois, les indicateurs de l’analyse sont accessibles sur

BaseSpace ou consultables depuis un ordinateur autonome à l’aide du visualiseur d’analyse de séquençage (SAV).

Cycles des indicateurs de l’analyse

Les indicateurs de l’analyse apparaissent à différents moments au cours d’une analyse.

}

Aucun indicateur ne s’affiche au cours des étapes de génération d’amplifiats.

}

Les cinq premiers cycles sont réservés à la génération du modèle.

}

Les indicateurs de l’analyse apparaissent après le cycle 25, notamment la densité des amplifiats, les amplifiats passant par le filtre (PF), le rendement et les scores de qualité.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Transfert de données

En fonction de la configuration d’analyse sélectionnée, une icône s’affiche à l’écran au cours de l’analyse pour indiquer l’état du transfert de données.

État Illumina

BaseSpace

BaseSpace Onsite Instrument autonome

Connecté

Connecté, transfert de données en cours

Déconnecté

Si le transfert de données est interrompu en cours d’analyse, les données sont stockées temporairement sur l’ordinateur de l’instrument. Une fois la connexion rétablie, le transfert de données reprend automatiquement. Si la connexion n’est pas rétablie avant la fin de l’analyse, supprimez manuellement les données de l’ordinateur de l’instrument manuellement avant le lancement d’une nouvelle analyse.

Service de copie de l’analyse

La suite logicielle du système NextSeq contient un service de copie de l’analyse. RTA v2 demande au service de copier des fichiers situés à un emplacement source vers un emplacement de destination; et le service traite les demandes de copie dans l’ordre d’arrivée. Si une exception survient, le fichier retourne en file d’attente de copie en fonction du nombre de fichiers contenus dans la file d’attente de copie.

Visualiseur d’analyse de séquençage

Le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV) affiche des indicateurs de séquençage générés au cours de l’analyse. Les indicateurs s’affichent sous forme de diagrammes, de graphiques et de tableaux qui s’appuient sur des données générées par le RTA et écrits sur des fichiers InterOp. Les indicateurs sont mis à jour pendant la progression de l’analyse.

Sélectionnez Refresh (Actualiser) à tout moment pendant l’analyse pour afficher les indicateurs métriques à jour. Pour plus de renseignements, consultez le Guide de l’utilisateur

du visualiseur d’analyse de séquençage (référence 15020619).

Le SAV est inclus dans le logiciel installé sur l’ordinateur de l’instrument. Vous pouvez aussi installer le SAV sur un autre ordinateur associé au même réseau que l’instrument pour surveiller les indicateurs d’analyse à distance.

Guide du système NextSeq 550

Lavage automatique après analyse

Une fois l’analyse de séquençage terminée, le logiciel lance un lavage automatique après analyse à l’aide d’une solution de lavage contenue dans la cartouche de tampon et de

NaOCI contenu dans la cartouche de réactifs.

Le lavage automatique après analyse dure 90 minutes environ. Une fois le lavage terminé, le bouton Home (Accueil) redevient actif. Les résultats du séquençage restent visibles à l’écran pendant le lavage.

Après le lavage

Après le lavage, les dispositifs dʼaspiration restent abaissés afin d’empêcher l’air de pénétrer dans le système. Laissez les cartouches en place jusqu’à l’analyse suivante.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Chapitre 4 Balayage

Balayage

Introduction

Flux de travail de balayage

Télécharger le dossier DMAP

Charger la puce BeadChip dans l’adaptateur

Configurer un balayage

Surveiller la progression du balayage

Guide du système NextSeq 550

Introduction

Pour effectuer un balayage sur le NextSeq 550, il vous faut les composants d’analyse suivants :

}

Une puce BeadChip hybridée et marquée

}

L’adaptateur de puce BeadChip réutilisable

} Des fichiers de carte de décodage (DMAP) correspondant à la puce BeadChip que vous utilisez

}

Un fichier de manifeste correspondant à la puce BeadChip que vous utilisez

}

Un fichier de groupement correspondant à la puce BeadChip que vous utilisez

Les fichiers de sortie sont générés lors du balayage puis mis en file d’attente pour un transfert vers le dossier de sortie spécifié.

Effectuez l’analyse à l’aide du logiciel BlueFuse Multi, qui nécessite que les données de balayage soient disponibles au format de fichier de typage génotypique (GTC). Par défaut, le NextSeq 550 génère les données normalisées et les typages génotypiques associés sous le format d’un fichier GTC. Vous pouvez facultativement configurer l’instrument afin de générer des fichiers de données d’intensité (IDAT) supplémentaires. Pour plus de renseignements, consultez la section

Configuration des balayages de la puce BeadChip à la page 71 .

Decode File Client

Le dossier DMAP contient des renseignements permettant d’identifier l’emplacement des billes sur la puce BeadChip et de quantifier le signal associé à chaque bille. Un dossier

DMAP unique existe pour chaque code à barres de la puce BeadChip.

L’utilitaire Decode File Client vous permet de télécharger des dossiers DMAP directement depuis les serveurs d’Illumina à l’aide d’un protocole HTTP standard.

Pour accéder à Decode File Client, accédez à la page d’assistance de Decode File Client sur le site Web d’Illumina (support.illumina.com/array/array_software/decode_file_ client/downloads.html) Installez le Decode File Client sur un ordinateur ayant accès à l’emplacement réseau du dossier DMAP.

Pour en savoir plus, consultez la section

Télécharger le dossier DMAP à la page 37

Fichiers de manifeste et fichiers de groupement

Pour chaque puce BeadChip, le logiciel requiert un accès à un fichier de manifeste et à un fichier de groupement. Chaque fichier de manifeste et de groupement est unique au type de puce BeadChip. Vérifiez que vous utilisez les fichiers de groupement dont le nom de fichier contient NS550. Les fichiers sont compatibles avec le système NextSeq.

}

Fichier de manifeste : les fichiers de manifeste décrivent le SNP ou le contenu de la sonde sur une puce BeadChip. Les fichiers de manifeste utilisent le format de fichier

*.bpm.

} Fichiers de groupement : les fichiers de groupement décrivent les positions des amplifiats pour la puce à ADN de génotypage d’Illumina et sont utilisés lors de l’analyse de données pour effectuer le typage génotypique. Les fichiers de groupement utilisent le format de fichier *.egt.

L’emplacement des fichiers est défini dans l’écran BeadChip Scan Configuration

(Configuration des balayages de la puce BeadChip). Depuis l’écran d’accueil NCS, sélectionnez Manage Instrument (Gérer l’instrument), System Configuration

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

(Configuration du système) puis BeadChip Scan Configuration (Configuration des balayages de la puce BeadChip).

Lorsque l’instrument NextSeq 550 est installé, le représentant Illumina télécharge ces fichiers et définit le chemin dans le logiciel de commande. Il n’est pas nécessaire de modifier ces fichiers, sauf en cas de perte ou de disponibilité d’une mise à jour. Pour plus de renseignements, consultez la section

Remplacer les fichiers de manifeste et les fichiers de

groupement à la page 63

Guide du système NextSeq 550

Flux de travail de balayage

Téléchargez les renseignements DMAP et enregistrez-les dans l’emplacement spécifié pour le dossier DMAP.

Chargez la puce BeadChip dans l’adaptateur de puce BeadChip.

Chargez l’adaptateur de puce BeadChip dans l’instrument.

Indiquez les paramètres de balayage : emplacement du dossier DMAP et emplacement de sortie.

Examinez les résultats de la vérification automatique.

Sélectionnez Start (Démarrer).

Surveillez le balayage à partir de l’interface du logiciel de commande.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Télécharger le dossier DMAP

Vous pouvez accéder au dossier DMAP à l’aide du Deecode File Client par compte ou par puce BeadChip (vue par défaut).

Accéder au dossier DMAP par compte

1 Depuis l’onglet principal du Decode File Client, sélectionnez une option de téléchargement :

} AutoPilot (Pilote automatique)

}

All BeadChips not yet downloaded (Toutes les puces BeadChip non encore téléchargées)

}

All BeadChips (Toutes les puces BeadChip)

} BeadChips by Purchase Order (Puces BeadChip par bon de commande)

} BeadChips by barcode (Puces BeadChip par code à barres)

2 Saisissez les renseignements requis.

3 Localisez le dossier DMAP que vous souhaitez télécharger.

4 Vérifiez que vous disposez d’assez d’espace libre dans l’emplacement de téléchargement.

5 Lancez le téléchargement. Consultez l’état du téléchargement sur l’onglet Download

Status and Log (État et journal de téléchargement).

6 Enregistrez le dossier DMAP vers l’emplacement du dossier DMAP spécifié.

Accéder au dossier DMAP par puce BeadChip

1 Identifiez les puces BeadChip à l’aide de deux des options suivantes :

}

BeadChip barcode (Code à barres de la puce BeadChip)

}

BeadChips box ID (Identifiant de boîte de la puce BeadChip)

}

Purchase order number (Numéro de bon de commande - vente)

} Sales order number (Numéro de bon de commande - achat)

2 Localisez le dossier DMAP que vous souhaitez télécharger.

3 Vérifiez que vous disposez d’assez d’espace libre dans l’emplacement de téléchargement.

4 Lancez le téléchargement. Consultez l’état du téléchargement sur l’onglet Download

Status and Log (État et journal de téléchargement).

5 Enregistrez le dossier DMAP vers l’emplacement du dossier DMAP spécifié.

Guide du système NextSeq 550

Charger la puce BeadChip dans l’adaptateur

1 Appuyez sur la pince de maintien de l’adaptateur. La pince s’incline légèrement vers l’arrière et s’ouvre.

2 En tenant la puce BeadChip par les bords, positionnez-la avec le code à barres près de la pince de maintien et placez-la dans l’étagère encastrée de l’adaptateur.

Figure 23 Chargez la puce BeadChip dans l’adaptateur

3 En utilisant l’une des ouvertures présentes sur les côtés de la puce BeadChip, assurezvous que celle-ci est fixée dans l’étagère encastrée de l’adaptateur.

Figure 24 Positionnez et fixez la puce BeadChip

4 Relâchez doucement la pince de maintien pour fixer la puce BeadChip.

5 Inspectez la puce BeadChip en l’observant de côté pour vous assurer qu’elle est à plat sur l’adaptateur. Repositionnez la puce BeadChip si nécessaire.

Figure 25 Inspectez la position de la puce BeadChip

A Bon positionnement : la puce BeadChip est à plat sur l’adaptateur lorsque vous relâchez la pince.

B Mauvais positionnement : la puce BeadChip n’est pas à plat lorsque vous relâchez la pince.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Configurer un balayage

1 Sur l’écran d’accueil, sélectionnez Experiment (Expérience), puis sélectionnez Scan

(Balayage).

La commande Scan (Balayage) ouvre la porte du compartiment d’imagerie, libère les consommables utilisés lors d’une analyse précédente s’ils sont présents, et ouvre une série d’écrans de configuration du balayage. Un court délai est normal.

Décharger les consommables de séquençage

Si des consommables de séquençage usagés sont présents lorsque vous configurez un balayage, le logiciel vous invite à décharger la cartouche de réactifs et la cartouche de tampon avant de passer à l’étape suivante.

1 Si vous y êtes invité, retirez les consommables de séquençage usagés provenant d’une analyse de séquençage précédente.

a Retirez la cartouche de réactifs du compartiment de réactifs. Mettez des contenus inutilisés au rebut conformément aux normes en vigueur.

b Retirez la cartouche de tampon usagée du compartiment de tampon.

AVERTISSEMENT

2 Fermez les portes du compartiment de réactifs et du compartiment de tampon.

Charger l’adaptateur de puce BeadChip

1 Utilisez les broches d’alignement pour placer l’adaptateur de puce BeadChip sur la platine.

Figure 26 Charger l’adaptateur de puce BeadChip

2 Sélectionnez Load (Charger).

La porte se ferme automatiquement, l’identifiant de la puce BeadChip s’affiche à l’écran et les capteurs sont activés. Un court délai est normal. Si le code à barres de la

Guide du système NextSeq 550

puce BeadChip ne peut pas être lu, une boîte de dialogue apparait pour vous permettre de saisir le code à barres manuellement. Consultez la section

Le logiciel ne peut pas lire le

code à barres de la puce BeadChip à la page 62 .

3 Sélectionnez Next (Suivant).

Configuration du balayage

1 Sur l’écran Scan Setup (Configuration du balayage), confirmez les informations suivantes :

}

Barcode (Code à barres) : le logiciel lit le code à barres de la puce BeadChip lorsque celle-ci est chargée. Si le code à barres est saisi manuellement, le bouton Edit

(Modifier) apparaît afin de permettre des modifications.

}

Type : le champ du type de puce BeadChip est généré automatiquement en fonction du code à barres de la puce BeadChip.

} DMAP Location (Emplacement DMAP) : l’emplacement du dossier DMAP est défini dans l’écran BeadChip Scan Configuration (Configuration des balayages de la puce

BeadChip). Pour changer l’emplacement pour le balayage actuel uniquement, sélectionnez Browse (Parcourir) puis rendez-vous à l’emplacement correct.

}

Output Location (Emplacement de sortie) : l’emplacement de sortie est défini dans l’écran BeadChip Scan Configuration (Configuration des balayages de la puce

BeadChip). Pour changer l’emplacement pour le balayage actuel uniquement, sélectionnez Browse (Parcourir) puis sélectionnez l’emplacement préféré.

2 Sélectionnez Next (Suivant).

Réviser la vérification automatisée

Le logiciel effectue une vérification automatisée du système. Lors de la vérification, les indicateurs suivants s’affichent sur l’écran :

}

Crochet gris : la vérification n’a pas été encore effectuée.

}

Icône

de progression : la vérification est en cours.

}

Crochet vert : la vérification a réussi.

}

Croix rouge : la vérification a échoué. Pour tous les éléments non validés, une action est nécessaire avant que vous puissiez continuer. Consultez la section

Résoudre les

erreurs de vérification automatique à la page 55 .

Pour afficher les résultats de chaque vérification dans une catégorie, cliquez sur l’icône d’agrandissement de la catégorie.

Démarrer le balayage

Une fois la vérification automatique terminée, sélectionnez Start (Démarrer). Le balayage commence.

Pour configurer le système afin de démarrer automatiquement le balayage après une vérification réussie, consultez la section

Configurer les options de configuration de l’analyse à la page 14 .

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Surveiller la progression du balayage

1 Surveillez la progression du balayage grâce à l’image générée par la puce BeadChip.

Chaque couleur qui se trouve sur l’image indique l’état du balayage.

}

Gris clair : balayage non effectué

}

Gris foncé : balayage effectué, mais non enregistré.

} Vert : balayage effectué et enregistré avec succès.

}

Rouge : échec du balayage et de l’enregistrement.

En cas d’échec de l’enregistrement, vous pouvez balayer à nouveau les échantillons comprenant des sections dont le balayage a échoué. Consultez la section

Échec du

balayage de la puce BeadChip à la page 62 .

2 Sélectionnez l’image de la puce BeadChip pour basculer entre la vue complète et la vue détaillée d’un échantillon sélectionné.

} La vue complète affiche les échantillons sur la puce BeadChip et les sections au sein de chaque échantillon.

}

La vue détaillée affiche chaque section au sein de l’échantillon sélectionné.

Figure 27 Image de la puce BeadChip : vue complète et vue détaillée

REMARQUE

L’arrêt d’un balayage est définitif. Si vous mettez fin au balayage avant qu’il ne soit terminé, les données de balayage ne sont pas enregistrées.

Transfert de données

Les données sont mise en file d’attente pour un transfert vers le dossier de sortie de balayage une fois le balayage terminé. Les données sont temporairement écrites vers l’ordinateur de l’instrument. Le dossier temporaire est automatiquement supprimé de l’ordinateur de l’instrument lorsqu’un balayage ultérieur est lancé.

La durée nécessaire au transfert des données dépend de votre connexion réseau. Avant de lancer un balayage ultérieur, vérifiez que les données ont été écrites vers le dossier de sortie. Pour ce faire, vérifiez que des fichiers GTC sont présents dans le dossier du code à barres. Pour plus de renseignements, consultez la section

Structure du dossier de sortie de

balayage à la page 86

Guide du système NextSeq 550

Si la connexion est interrompue, le transfert de données reprend automatiquement lorsqu’elle reprend. Chaque fichier dispose d’un minuteur d’une heure après sa mise en file d’attente pour un transfert vers le dossier de sortie. Si le minuteur expire ou si l’instrument est redémarré avant la fin du transfert, les données ne sont pas écrites dans le dossier de sortie.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Chapitre 5 Maintenance

Maintenance

Introduction

Effectuer un lavage manuel

Mises à jour logicielles

Arrêter l’instrument

Guide du système NextSeq 550

Introduction

Les procédures de maintenance comprennent des lavages manuels de l’instrument et des mises à jour du logiciel du système lorsque celles-ci sont disponibles.

}

Lavages de l’instrument : un lavage automatique après analyse est lancé après chaque analyse de séquençage afin de maintenir les performances de l’instrument. Toutefois, il est nécessaire d’effectuer régulièrement un lavage manuel dans certaines conditions.

Consultez la section

Effectuer un lavage manuel à la page 45

} Mises à jour logicielles : quand une version mise à jour du logiciel du système est disponible, vous pouvez l’installer automatiquement en vous connectant à BaseSpace ou manuellement en téléchargeant le programme d’installation sur le site Web d’Illumina. Consultez la section

Mises à jour logicielles à la page 48

Maintenance préventive

Illumina vous recommande de planifier un service de maintenance préventive tous les ans.

Si vous n’êtes pas lié par un contrat de services, veuillez communiquer avec le gestionnaire de compte de votre région ou l’assistance technique d’Illumina pour organiser un service de maintenance préventive facturable.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Effectuer un lavage manuel

Les lavages manuels sont initiés depuis l’écran d’accueil. Parmi les options de lavage figurent Quick Wash (Lavage rapide) et Manual Post-Run Wash (Lavage manuel après analyse).

Types de lavage

Quick Wash (Lavage rapide)

Durée : 20 minutes

Manual Post-Run Wash

(Lavage manuel après analyse)

Durée : 90 minutes

Description

Rince le système avec une solution de lavage fournie par l’utilisateur composée d’eau de laboratoire et de Tween 20 (cartouche de lavage du tampon).

• Nécessaire pour chaque période de 14 jours d’inactivité de l’instrument avec une cartouche de réactifs et une cartouche de tampon en place.

• Nécessaire pour chaque période de sept jours à état sec de l’instrument (cartouche de réactifs et cartouche de tampon retirées).

• Nécessaire après un arrêt.

Rince le système avec une solution de lavage fournie par l’utilisateur composée d’eau de laboratoire et de Tween 20 (cartouche de lavage du tampon) ainsi que d’hypochlorite de sodium à 0,12 % (cartouche de lavage des réactifs).

Nécessaire lorsque le lavage automatique après analyse n’a pas été effectué.

Un lavage manuel nécessite l’utilisation de la cartouche de lavage des réactifs et de la cartouche de lavage du tampon qui sont fournies avec l’instrument, ainsi que d’une

Flow Cell usagée. Une Flow Cell usagée peut être utilisée jusqu’à 20 fois pour des lavages de l’instrument.

Figure 28 Cartouche de lavage des réactifs et cartouche de lavage du tampon

Préparer un lavage manuel après analyse

Consommables fournis par l’utilisateur

• NaOCl

Volume et description

1 ml, dilution à 0,12 %

Chargé dans la cartouche de lavage de réactifs (position nº 28)

Guide du système NextSeq 550

Consommables fournis par l’utilisateur

• Tween 20 à 100 %

• Eau de laboratoire

Volume et description

Utilisée pour préparer une solution de lavage Tween 20 à

0,05 % de 125 ml

Chargée dans la cartouche de lavage du tampon (réservoir central)

REMARQUE

Utilisez toujours une nouvelle dilution de NaOCI préparée au cours des dernières 24 heures.

Si vous préparez un volume supérieur à 1 ml, stockez la dilution restante entre 2 et 8 °C pour une utilisation dans les 24 heures suivantes. Sinon, jetez la dilution de NaOCl restante.

1 Combinez les volumes suivants dans un microtube à centrifuger pour obtenir 1 ml de

NaoCl à 0,12 % :

} NaOCl à 5 % (24 µl)

} Eau de laboratoire (976 µl)

2 Retournez le tube pour mélanger.

3 Ajoutez 1 ml de NaOCI à 0,12 % à la cartouche de lavage des réactifs. Le réservoir approprié est équivalent à la position nº 28 de la cartouche préremplie.

Figure 29 Charger le NaOCl

4 Combinez les volumes suivants afin d’obtenir une solution de lavage de Tween 20 à

0,05 % :

} Tween 20 à 100 % (62 µl)

} Eau de laboratoire (125 ml)

5 Ajoutez 125 ml de solution de lavage dans le réservoir central de la cartouche de lavage du tampon.

6 Sélectionnez Perform Wash (Procéder au lavage), puis sélectionnez Manual Post-Run

Wash (Lavage manuel après analyse).

Préparer un lavage rapide

Consommables fournis par l’utilisateur

• Tween 20 à 100 %

• Eau de laboratoire

Volume et description

Utilisée pour préparer une solution de lavage Tween 20 à

0,05 % de 40 ml

Chargée dans la cartouche de lavage du tampon (réservoir central)

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

1 Combinez les volumes suivants afin d’obtenir une solution de lavage de Tween 20 à

0,05 % :

} Tween 20 à 100 % (20 µl)

} Eau de laboratoire (40 ml)

2 Ajoutez 40 ml de solution de lavage dans le réservoir central de la cartouche de lavage du tampon.

3 Sélectionnez Perform Wash (Procéder au lavage), puis sélectionnez Quick Wash

(Lavage rapide).

Charger une Flow Cell usagée et les cartouches de lavage

1 En l’absence de Flow Cell usagée, chargez une Flow Cell usagée. Sélectionnez Load

(Charger), puis sélectionnez Next (Suivant).

2 Retirez le réservoir à réactifs usagés et jetez son contenu conformément aux normes en vigueur.

AVERTISSEMENT

Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Manipulez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminez-les conformément aux normes de

sécurité gouvernementales en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements sur l’environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse, mise à votre disposition à l’adresse support.illumina.com/sds.html

3 Faites glisser le réservoir à réactifs usagés vide dans le compartiment de tampon jusqu’à la butée.

4 Retirez la cartouche de tampon usagée de la précédente analyse, le cas échéant.

5 Chargez la cartouche de lavage du tampon contenant la solution de lavage.

6 Retirez la cartouche de réactifs usagée de la précédente analyse, le cas échéant.

7 Chargez la cartouche de lavage des réactifs.

8 Sélectionnez Next (Suivant). La vérification avant lavage démarre automatiquement.

Démarrer le lavage

1 Sélectionnez Start (Démarrer).

2 À la fin du lavage, sélectionnez Home (Accueil).

Après le lavage

Après le lavage, les dispositifs dʼaspiration restent abaissés afin d’empêcher l’air de pénétrer dans le système. Laissez les cartouches en place jusqu’à l’analyse suivante.

Guide du système NextSeq 550

Mises à jour logicielles

Les mises à jour logicielles font partie d’une suite logicielle appelée System Suite qui comprend les logiciels suivants :

}

NextSeq Control Software (NCS)

}

NextSeq recipes

} RTA v2

}

NextSeq Service Software (NSS)

}

Visualiseur d’analyse de séquençage (SAV)

}

BaseSpace Broker

Vous pouvez installer les mises à jour logicielles automatiquement à l’aide d’une connexion Internet ou manuellement à partir d’un emplacement réseau ou USB.

}

Mises à jour automatiques : pour les instruments connectés à un réseau doté d’un accès à Internet, une icône d’alerte s’affiche sur le bouton Manage Instrument (Gérer l’instrument) situé sur l’écran d’accueil lorsqu’une mise à jour est disponible.

}

Mises à jour manuelles : téléchargez le programme d’installation System Suite sur la page d’aide du système NextSeq 550 sur le site Web Illumina.

Mise à jour automatique des logiciels

1 Sélectionnez Manage Instrument (Gérer l’instrument).

2 Sélectionnez Software Update (Mise à jour logicielle).

3 Sélectionnez Install the update already downloaded from BaseSpace (Installer la mise

à jour téléchargée auparavant à partir de BaseSpace).

4 Sélectionnez Update (Mettre à jour) pour commencer la mise à jour. Une boîte de dialogue apparaît pour la confirmation de la commande.

5 Suivez les invites de l’assistant d’installation : a Acceptez l’accord de licence.

b Lisez les notes de mise à jour.

c Consultez la liste des logiciels inclus dans la mise à jour.

Le logiciel de commande redémarre automatiquement une fois la mise à jour logicielle effectuée.

REMARQUE

Si une mise à jour du micrologiciel est incluse, un redémarrage automatique du système est nécessaire une fois le micrologiciel mis à jour.

Mise à jour manuelle des logiciels

1 Téléchargez le fichier d’installation de System Suite sur le site Web d’Illumina et enregistrez-le dans un emplacement réseau.

Vous pouvez également copier le fichier d’installation du logiciel sur une clé USB.

2 Sélectionnez Manage Instrument (Gérer l’instrument).

3 Sélectionnez Software Update (Mise à jour logicielle).

4 Sélectionnez Manually install the update from the following location (Installer manuellement la mise à jour à partir de l’emplacement suivant).

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

5 Sélectionnez Browse (Parcourir) pour accéder à l’emplacement du fichier d’installation du logiciel, puis sélectionnez Update (Mise à jour).

6 Suivez les invites de l’assistant d’installation : a Acceptez l’accord de licence.

b Lisez les notes de mise à jour.

c Consultez la liste des logiciels inclus dans la mise à jour.

Le logiciel de commande redémarre automatiquement une fois la mise à jour logicielle effectuée.

REMARQUE

Si une mise à jour du micrologiciel est incluse, un redémarrage automatique du système est nécessaire une fois le micrologiciel mis à jour.

Guide du système NextSeq 550

Arrêter l’instrument

1 Sélectionnez Manage Instrument (Gérer l’instrument).

2 Sélectionnez System Power Options (Options d’alimentation du système).

3 Sélectionnez Shut Down (Arrêter).

La commande d’arrêt ferme le logiciel de manière sûre et coupe l’alimentation de l’instrument. Attendez au moins 60 secondes avant de rallumer l’instrument.

ATTENTION

Ne déplacez pas l’instrument. Un déplacement inapproprié de l’instrument peut avoir un impact sur l’alignement optique et compromettre l’intégrité des données. Si vous devez déplacer l’instrument, communiquez avec votre représentant Illumina.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Annexe A Dépannage

Dépannage

Introduction

Fichiers de dépannage

Résoudre les erreurs de vérification automatique

Réservoir à réactifs usagés plein

Flux de travail de réhybridation

Erreurs de puce BeadChip et de balayage

Formules personnalisées et dossiers de formules

Vérification du système

Message d’erreur RAID

Configurer les paramètres du système

Guide du système NextSeq 550

Introduction

En cas de questions techniques, consultez les pages dʼassistance du NextSeq 550 sur le site

Web d’Illumina. Les pages d’assistance fournissent un accès à la documentation, aux téléchargements et aux foires aux questions.

Connectez-vous à votre compte MyIllumina pour accéder aux bulletins d’assistance.

En cas de problème avec la qualité ou la performance de l’analyse, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Consultez la section

Assistance technique à la page 91

Il est possible de partager un lien vers le résumé d’analyse dans BaseSpace avec l’assistance technique d’Illumina pour faciliter le dépannage.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Fichiers de dépannage

Le représentant de lʼassistance technique d’Illumina peut vous demander de fournir des copies des fichiers propres à lʼanalyse ou propres au balayage afin de résoudre les problèmes. Généralement, les fichiers suivants sont utilisés pour le dépannage.

Fichiers de dépannage pour les analyses de séquençage

Fichier clé

Fichier de renseignements sur l’analyse (RunInfo.xml)

Fichier des paramètres de l’analyse

(RunParameters.xml)

Fichiers de configuration RTA

(RTAConfiguration.xml)

Fichiers InterOp (*.bin)

Fichiers journaux

Fichiers journaux des erreurs (*ErrorLog*.txt)

Fichiers journaux globaux

(*GlobalLog*.tsv)

Fichiers journaux des lignes (*LaneLog*.txt)

Dossier Description

Dossier racine

Data\Intensities Comprend les paramètres de configuration RTA pour l’analyse.

Le fichier RTAConfiguration.xml est créé au début de l’analyse.

InterOp

Contient des renseignements concernant les paramètres et les composants des analyses. Parmi les renseignements figurent le RFID, le numéro de série, la référence et la date de péremption.

Ces fichiers de rapport binaires sont utilisés par le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV).

Les fichiers InterOp sont mis à jour tout au long de l’analyse.

Logs

Comprend les renseignements suivants :

• Nom de l’analyse

• Nombre de cycles de l’analyse

• Nombre de cycles pour chaque lecture

• Si la lecture est une lecture indexée

• Nombre de témoins et de plaques sur la

Flow Cell

RTA Logs

Les fichiers journaux décrivent chaque étape effectuée par l’instrument au cours de chaque cycle et répertorient les versions de logiciels et de micrologiciels utilisées lors de l’analyse. Le fichier nommé [NomInstrument]_CurrentHardware.csv

répertorie les numéros de série des composants de l’instrument.

Journal des erreurs RTA.

Les fichiers journaux des erreurs sont mis à jour à chaque fois qu’une erreur se produit.

RTA Logs

Journal de tous les évènements RTA.

Les fichiers journaux globaux sont mis à jour tout au long de l’analyse.

Journal des événements RTA en cours.

Les fichiers journaux des lignes sont mis à jour tout au long de l’analyse.

Guide du système NextSeq 550

Erreurs RTA

Pour résoudre les erreurs RTA, vérifiez d’abord le journal des erreurs RTA, qui est stocké dans le dossier RTALogs. Ce fichier n’est pas présent pour les analyses réussies. Joignez le journal des erreurs lors du signalement des problèmes à l’assistance technique d’Illumina.

Fichiers de dépannage pour les balayages des puces à ADN

Fichier clé

Fichier des paramètres du balayage

(ScanParameters.xml)

Dossier

Dossier racine

Fichiers journaux

Fichiers d’indicateurs

Fichier de nouveau balayage

Journaux

[Code à barres]

Description

Contient des renseignements sur les paramètres du balayage. Parmi ces renseignements figurent la date du balayage, le code à barres de la puce BeadChip, l’emplacement du fichier de groupement et l’emplacement du fichier de manifeste.

Les fichiers journaux décrivent chaque étape effectuée sur l’instrument lors du balayage.

Les indicateurs sont fournis sous forme d’indicateurs d’échantillon et d’indicateurs de section.

[code à barres]_sample_metrics.csv : pour chaque

échantillon et chaque canal (rouge et vert), répertorie les paramètres Percent Off Image (Pourcentage hors image),

Percent Outliers (Pourcentage de points aberrants), P05,

P50, P95, Avg FWHM Avg (Moyenne de FWHM),

FWHM Stddev (Écart-type de FWHM), and Min

Registration Score (Score minimal d’enregistrement).

[code à barres]_section_metrics.csv : pour chaque section et plaque, répertorie les paramètres Laser Z-position

(Position Z du laser), Through Focus Z-position

(Position Z de la mise au point), Red FWHM (FWHM, rouge), Green FWHM (FWHM, vert), Red Avg Pixel

Intensity (Intensité moyenne des pixels, rouge), Green

Avg Pixel Intensity (Intensité moyenne des pixels, vert),

Red Registration Score (Score d’enregistrement, rouge), et Green Registration Score (Score d’enregistrement, vert).

[code à barres]_rescan.flowcell : répertorie les emplacements des plaques ajustés pour un nouveau balayage, qui comprennent un chevauchement plus élevé entre les plaques.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Résoudre les erreurs de vérification automatique

Si des erreurs se produisent au cours de la vérification automatique, utilisez les recommandations d’action suivantes pour résoudre l’erreur. Les vérifications automatiques diffèrent entre les séquençages et les balayages de puce à ADN.

Vérifications des analyses de séquençage

Si une vérification avant analyse échoue, le RFID de la cartouche de réactifs n’est pas verrouillé et peut être utilisé pour une nouvelle analyse. Cependant, le RFID est verrouillé une fois que les opercules en aluminium sont percés.

Vérifications du système

Doors Closed (Portes fermées)

Consumables Loaded

(Consommables chargés)

Action recommandée

Assurez-vous que les portes du compartiment sont fermées.

Required Software

(Logiciel requis)

Instrument Disk Space

(Espace disque de l’instrument)

Network Connection

(Connexion réseau)

Network Disk Space

(Espace disque réseau)

Les capteurs des consommables n’enregistrent rien. Assurezvous que chaque consommable est correctement chargé.

Sur l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse), sélectionnez Back (Retour) pour retourner à l’étape de chargement, puis répétez la configuration de l’analyse.

Des composants critiques du logiciel sont manquants.

Effectuez une mise à jour manuelle pour restaurer tous les composants du logiciel.

Le disque dur de l’instrument n’a pas assez d’espace disponible pour réaliser l’analyse. Il est possible que les données provenant d’une analyse précédente n’aient pas été transférées.

Effacez les données d’analyse du disque dur de l’instrument.

La connexion réseau a été interrompue. Vérifiez l’état du réseau et la connexion au réseau physique.

Soit le compte BaseSpace est plein, soit le serveur réseau est plein.

Température

Temperature

(Température)

Temperature Sensors

(Capteurs de température)

Fans (Ventilateurs)

Action recommandée

Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.

Système d’imagerie

Imaging Limits (Limites de l’imagerie)

Action recommandée

Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.

Guide du système NextSeq 550

Système d’imagerie

Z Steps-and-Settle (Étapes et installation Z)

Bit Error Rate (Taux d’erreur binaire)

Flow Cell Registration

(Enregistrement de la

Flow Cell)

Action recommandée

Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.

Il est possible que la Flow Cell ne soit pas correctement positionnée.

• Sur les écrans Run Setup (Configuration de l’analyse), sélectionnez Back (Retour) pour retourner à l’étape de la

Flow Cell. La porte du compartiment d’imagerie s’ouvre.

• Déchargez et rechargez la Flow Cell pour vous assurer qu’elle est correctement positionnée.

Distribution des réactifs

Valve Response (Réponse de la vanne)

Pump (Pompe)

Buffer Mechanism

(Mécanisme du tampon)

Spent Reagents Empty

(Réactifs usagés vides)

Action recommandée

Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.

Videz le réservoir à réactifs usagés et rechargez le réservoir vide.

Vérifications des balayages de puce à ADN

Vérifications du système

Doors Closed (Portes fermées)

Consumables Loaded

(Consommables chargés)

Action recommandée

Assurez-vous que les portes du compartiment sont fermées.

Required Software

(Logiciel requis)

Verify Input Files (Vérifier les fichiers d’entrée)

Instrument Disk Space

(Espace disque de l’instrument)

Les capteurs des consommables n’enregistrent rien. Assurezvous que chaque consommable est correctement chargé.

Sur l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse), sélectionnez Back (Retour) pour retourner à l’étape de chargement, puis répétez la configuration de l’analyse.

Des composants critiques du logiciel sont manquants.

Effectuez une mise à jour manuelle pour restaurer tous les composants du logiciel.

Vérifiez que le chemin du fichier de groupement et du fichier de manifeste est correct et que les fichiers sont présents.

Effacez les données d’analyse du disque dur de l’instrument.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Vérifications du système

Network Connection

(Connexion réseau)

Network Disk Space

(Espace disque réseau)

Action recommandée

La connexion réseau a été interrompue. Vérifiez l’état du réseau et la connexion au réseau physique.

Soit le compte BaseSpace est plein, soit le serveur réseau est plein.

Système d’imagerie

Imaging Limits (Limites de l’imagerie)

Z Steps-and-Settle (Étapes et installation Z)

Bit Error Rate (Taux d’erreur binaire)

Auto-Center (Centrage automatique)

Action recommandée

Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.

Déchargez l’adaptateur de puce BeadChip. Vérifiez que la puce BeadChip est fixée dans l’adaptateur, puis rechargez l’adaptateur.

Guide du système NextSeq 550

Réservoir à réactifs usagés plein

Commencez toujours une analyse avec un réservoir à réactifs usagés vide.

Si vous commencez une analyse sans avoir vidé le réservoir des réactifs usagés, les capteurs du système poussent le logiciel à interrompre l’analyse lorsque le réservoir est plein. Les capteurs du système ne peuvent pas interrompre une analyse durant la génération d’amplifiats, la resynthèse des paires de bases ou le lavage automatique après analyse.

Lorsque l’analyse est interrompue, une boîte de dialogue s’affiche et fournit des options permettant de relever les dispositifs d’aspiration et de vider le réservoir plein.

Vider le réservoir des réactifs usagés

1 Sélectionnez Raise Sippers (Soulever les dispositifs d’aspiration).

2 Retirez le réservoir à réactifs usagés et jetez le contenu de manière appropriée.

3 Remettez le réservoir vide dans le compartiment de tampon.

4 Sélectionnez Continue (Continuer). L’analyse reprend automatiquement.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Flux de travail de réhybridation

Une analyse de réhybridation peut être nécessaire si les indicateurs générés au cours des quelques premiers cycles montrent des intensités inférieures à 2 500. Certaines librairies à faible diversité peuvent montrer des intensités inférieures à 1 000, ce qui est attendu et ne peut pas être résolu par une réhybridation.

REMARQUE

L’utilisation de la commande End Run (Terminer l’analyse) est définitive. L’analyse ne peut pas reprendre, les consommables de l’analyse ne peuvent pas être réutilisés et les données de séquençage ne sont pas enregistrées.

Lorsque vous arrêtez une analyse, le logiciel effectue les étapes suivantes avant de terminer l’analyse :

}

Place la Flow Cell en état de sécurité.

}

Débloque l’identification par radiofréquence (RFID) de la Flow Cell pour une analyse ultérieure.

} Attribue une date de péremption de réhybridation à la Flow Cell.

} Écrit les journaux d’analyse pour les cycles terminés. Un délai est normal.

}

Saute le lavage après analyse automatique.

Lorsque vous lancez une analyse de réhybridation, le logiciel effectue les étapes suivantes pour effectuer l’analyse :

}

Crée un dossier d’analyse basé sur le nom unique de l’analyse.

}

Vérifie que la date de réhybridation de la Flow Cell n’est pas dépassée.

}

Amorce les réactifs. Un délai est normal.

} Passe l’étape de génération d’amplifiats.

}

Retire le primer de lecture 1 précédent.

}

Hybride un nouveau primer de lecture 1.

}

Continue la lecture 1 et le reste de l’analyse selon les paramètres de l’analyse spécifiés.

À quel moment arrêter une analyse pour réhybridation

Une réhybridation ultérieure est possible uniquement si vous arrêtez l’analyse aux points suivants :

}

Après le cycle 5 : les intensités apparaissent après l’enregistrement du modèle, qui nécessite les 5 premiers cycles du séquençage. Bien qu’il soit considéré sûr d’arrêter une analyse après le cycle 1, il est recommandé d’arrêter après le cycle 5. N’arrêtez pas une analyse au cours de la génération d’amplifiats.

} Lecture 1 ou lecture d’index 1 : arrêtez l’analyse avant que ne commence la resynthèse des paires de bases appariées. La Flow Cell ne peut pas être enregistrée pour une réhybridation ultérieure après le début de la resynthèse des paires de bases appariées.

Consommables requis

Une analyse de réhybridation nécessite une nouvelle cartouche de réactifs et une nouvelle cartouche de tampon NextSeq, quel que soit le moment où l’analyse a été arrêtée.

Arrêter l’analyse en cours

1 Sélectionnez End Run (Arrêter l’analyse). Lorsque vous êtes invité à confirmer la commande, sélectionnez Yes (Oui).

Guide du système NextSeq 550

2 Lorsque vous êtes invité à enregistrer la Flow Cell, sélectionnez Yes (Oui). Notez la date de péremption de réhybridation.

3 Retirez la Flow Cell enregistrée et placez-la à une température comprise entre 2 °C et

8 °C jusqu’à ce que vous soyez prêt à configurer l’analyse de réhybridation.

REMARQUE

Vous pouvez stocker la Flow Cell jusqu’à sept jours à une température comprise entre 2 °C et 8 °C dans un étui de protection à rabat en plastique sans l’emballage dessiccant. Pour de meilleurs résultats, réhybridez la Flow Cell enregistrée sous 3 jours.

Effectuer un lavage manuel

1 Sur l’écran d’accueil, sélectionnez Perform Wash (Procéder au lavage).

2 Dans l’écran Wash Selection (Sélection de lavage), sélectionnez Manual Post-Run

Wash (Lavage manuel après analyse). Consultez la section

Effectuer un lavage manuel à la page 45 .

REMARQUE

Si vous n’avez pas retiré la cartouche de réactifs et la cartouche de tampon de l’analyse arrêtée, vous pouvez les utiliser pour le lavage manuel. Sinon, effectuez le lavage manuel à l’aide de la cartouche de lavage des réactifs et de la cartouche de lavage du tampon.

Configurer une nouvelle analyse dans l’onglet Prep (Préparation) de

BaseSpace

1 Si l’instrument est configuré pour BaseSpace ou BaseSpace Onsite, configurez une nouvelle analyse sous l’onglet Prep (Préparation) en utilisant les mêmes paramètres que ceux de l’analyse d’origine.

ASTUCE

Cliquez sur l’onglet Pools (Groupements), sélectionnez l’identifiant de groupement pertinent pour conserver les paramètres de l’analyse précédente, puis assignez un nom unique pour la nouvelle analyse.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Configurer une analyse sur l’instrument

1 Préparez une nouvelle cartouche de réactifs.

2 Si la Flow Cell enregistrée a été stockée, laissez-la atteindre la température ambiante

(15 à 30 minutes).

3 Nettoyez et chargez la Flow Cell enregistrée.

4 Retirez le réservoir à réactifs usagés et jetez le contenu de façon appropriée, puis rechargez le flacon vide.

5 Chargez la nouvelle cartouche de tampon et la nouvelle cartouche de réactifs.

6 Sur l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse), sélectionnez l’une des options suivantes :

}

BaseSpace ou BaseSpace Onsite : sélectionnez l’analyse et confirmez les paramètres de l’analyse.

} Standalone (Autonome) : saisissez le nom de l’analyse et spécifiez des paramètres identiques à ceux de l’analyse d’origine.

7 Sélectionnez Next (Suivant) pour effectuer une vérification avant analyse, puis démarrez l’analyse.

Guide du système NextSeq 550

Erreurs de puce BeadChip et de balayage

Le logiciel ne peut pas lire le code à barres de la puce BeadChip

Lorsque la boîte de dialogue d’erreur de code à barres apparaît, sélectionnez l’une des options suivantes :

} Sélectionnez Rescan (Nouveau balayage). Le logiciel tente à nouveau de lire le code

à barres.

}

Sélectionnez le champ de texte et saisissez le code à barres numérique tel qu’affiché dans l’image. En fonction de la puce Beadchip, les numéros de code à barres peuvent comporter jusqu’à 12 chiffres. Sélectionnez Save (Enregistrer). L’image du code à barres est enregistrée dans le dossier de sortie.

} Sélectionnez Cancel (Annuler). La porte du compartiment d’imagerie s’ouvre afin de décharger l’adaptateur de puce BeadChip.

Échec du balayage de la puce BeadChip

Les images sont enregistrées après leur numérisation. L’enregistrement identifie les billes en mettant en corrélation leur emplacement dans l’image numérisée et les renseignements fournis par le dossier de bille référencée, ou DMAP.

Les sections dont l’enregistrement échoue sont indiquées en rouge sur l’image de la puce

BeadChip.

Figure 30 Puce BeadChip affichant des sections échouées

Une fois la numérisation terminée et les données de numérisation écrites vers le dossier de sortie, le bouton Rescan (Nouveau balayage) est activé.

Lorsque le bouton Rescan (Nouveau balayage) est sélectionné, le logiciel effectue les étapes suivantes :

}

Exécution d’un nouveau balayage des échantillons qui comportent des sections

échouées avec un chevauchement entre plaques plus élevé.

} Génération des fichiers de sortie dans le dossier de sortie original.

}

Écrasement des fichiers de sortie précédents pour les sections échouées.

}

Incrémentation du compteur de balayage d’une unité pour chaque nouveau balayage, mais en arrière-plan. Le logiciel ne renomme pas le dossier de sortie.

Commencer ou renouveler un balayage

1 Sélectionnez Rescan (Nouveau balayage) pour effectuer un balayage des échantillons comportant des sections échouées.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

2 Si le balayage échoue toujours, mettez fin au balayage.

3 Retirez la puce BeadChip et l’adaptateur, puis inspectez la puce BeadChip à la recherche de poussière et de débris. Utilisez de l’air en canette ou toute autre méthode de nettoyage à air comprimé pour éliminer les débris.

4 Rechargez la puce BeadChip et lancez un nouveau balayage.

Lorsqu’un nouveau balayage est lancé, le logiciel effectue les étapes suivantes :

}

Balayage de la totalité de la puce BeadChip.

}

Génération des fichiers de sortie dans un nouveau dossier de sortie.

}

Incrémentation du compteur de balayage d’une unité en fonction du décompte de balayages du dernier balayage.

Remplacer les fichiers de manifeste et les fichiers de groupement

1 Accédez à la page d’assistance d’Illumina (support.illumina.com) correspondant à la puce BeadChip que vous utilisez, puis cliquez sur l’onglet Downloads

(Téléchargements).

2 Téléchargez les fichiers à remplacer ou à mettre à jour, puis copiez les fichiers vers l’emplacement réseau de votre choix.

REMARQUE

Vérifiez que vous avez sélectionné les fichiers de manifeste et les fichiers de groupement compatibles avec le système NextSeq 550. Les fichiers compatibles contiennent NS550 dans leur nom de fichier.

3 Uniquement dans les cas où l’emplacement a changé, mettez l’emplacement à jour sur l’écran BeadChip Scan Configuration (Configuration des balayages de la puce

BeadChip) de la manière suivante : a Sur l’écran d’accueil NCS, sélectionnez Manage Instrument (Gérer l’instrument).

b Sélectionnez System Configuration (Configuration du système).

c Sélectionnez BeadChip Scan Configuration (Configuration des balayages de la puce BeadChip)

4 Sélectionnez Browse (Parcourir) puis accédez à l’emplacement des fichiers remplacés ou mis à jour.

Guide du système NextSeq 550

Formules personnalisées et dossiers de formules

Ne modifiez pas les formules d’origine. Enregistrez toujours la formule d’origine sous un nouveau nom. Si une formule originale est modifiée, l’utilitaire de mise à jour du logiciel ne peut plus reconnaître la formule pour les mises à jour ultérieures et les versions plus récentes ne sont pas installées.

Enregistrez les formules personnalisées dans le dossier de formules approprié. Les dossiers de formules sont organisés comme suit.

Custom

High : formules personnalisées utilisées avec une trousse de débit élevé.

Mid : formules personnalisées utilisées avec une trousse de débit moyen.

High : formules d’origine utilisées avec une trousse de débit élevé.

Mid : formules d’origine utilisées avec une trousse de débit moyen.

Wash : contient la formule de lavage manuel.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Vérification du système

Une vérification du système n’est pas nécessaire pour un fonctionnement normal ou pour la maintenance de l’instrument. Toutefois, un représentant de l’assistance technique d’Illumina peut vous demander de réaliser une vérification du système à des fins de dépannage.

REMARQUE

Si un lavage de l’instrument est prévu, effectuez le lavage avant de lancer une vérification du système.

Lancer une vérification du système ferme automatiquement le logiciel de contrôle et lance le NextSeq Service Software (NSS). Le logiciel de service se lance et ouvre l’écran Load

(Charger), qui est configuré pour une utilisation de l’option de chargement avancé.

Figure 31 Vérifications du système disponibles

Les cases non cochées sur l’écran Select (Sélectionner) indiquent les tests nécessitant l’assistance d’un représentant de terrain d’Illumina.

Réaliser une vérification du système

1 Dans l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System Check

(Vérification du système). Lorsque vous êtes invité à fermer le logiciel de commande avant de poursuivre, sélectionnez Yes (Oui).

2 Chargez les consommables comme suit : a Si une Flow Cell usagée ne se trouve pas déjà sur l’instrument, chargez une

Flow Cell usagée.

b Videz le réservoir de réactifs usagés et repositionnez-le sur l’instrument.

c Chargez la cartouche de lavage du tampon contenant 120 ml d’eau de laboratoire dans le réservoir central.

d Chargez la cartouche de lavage des réactifs. Vérifiez que la cartouche de lavage des réactifs est vide et propre.

3 Sélectionnez Load (Charger). Le logiciel positionne la Flow Cell et la cartouche de lavage des réactifs. Sélectionnez Next (Suivant).

4 Sélectionnez Next (Suivant). La vérification du système commence.

Guide du système NextSeq 550

5 [Facultatif] Lorsque la vérification du système est terminée, sélectionnez View (Afficher) en regard du nom de la vérification pour afficher les valeurs associées à chaque vérification.

6 Sélectionnez Next (Suivant). Le rapport de vérification du système s’ouvre.

7 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer le rapport dans un fichier zippé.

Naviguez vers un emplacement sur le réseau pour enregistrer le fichier.

8 Lorsque vous avez terminé, sélectionnez Exit (Quitter).

9 Lorsque vous êtes invité à fermer le logiciel de service et à redémarrer le logiciel de commande, sélectionnez Yes (Oui). Le logiciel de commande redémarre automatiquement.

Vérifications du mouvement

Vérification du système

BSM

Description

FCLM et FAM

Stage Tests (Tests de la platine)

Vérifie le gain et la distance du mécanisme de conduite des compartiments (BSM) afin de confirmer que le module fonctionne correctement.

Vérifie le gain et la distance du mécanisme de chargement de la

Flow Cell (FCLM) et du module d’automatisation des liquides

(FAM) pour confirmer que les modules fonctionnent correctement.

Vérifie les limites de parcours et les performances de la platine XY et des six platines Z, une pour chaque caméra.

Vérification des composants optiques

Vérification du système

Flow Cell Registration

(Enregistrement de la

Flow Cell)

Description

Mesure l’inclinaison de la lame sur un plan optique, teste les fonctionnalités de la caméra, teste le module d’imagerie et vérifie l’enregistrement de la Flow Cell dans la position correcte d’imagerie.

Vérifications de la fluidique

Vérification du système

Valve Response

(Réponse de la vanne)

Pressure Decay (Perte de pression)

Flow Rate (Débit)

Description

Vérifie la précision des mouvements de la vanne et de la pompe ainsi que l’amplitude de mouvement de la seringue de la pompe.

Vérifie le taux de fuite d’un système fluidique étanche, afin de confirmer que la Flow Cell est insérée correctement en position de séquençage.

Vérifie la fonctionnalité des capteurs de bulles, qui servent à détecter la présence d’air dans les lignes de réactifs. Mesure les débits pour vérifier la présence d’occlusions ou de fuites.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Vérifications thermiques

Vérification du système

Fans (Ventilateurs)

Thermal Probes

(Sondes thermiques)

Description

Vérifie la vitesse des ventilateurs du système en impulsions par minute (imp/min) pour confirmer que les ventilateurs fonctionnent. Les ventilateurs qui ne fonctionnent pas renvoient une valeur négative.

Vérifie la température moyenne de chaque capteur thermique.

Les capteurs thermiques qui ne fonctionnent pas renvoient une valeur négative.

Guide du système NextSeq 550

Message d’erreur RAID

L’ordinateur du système NextSeq est équipé de deux disques durs. Si un disque dur cesse de fonctionner, le système génère un message d’erreur RAID et vous suggère de prendre contact avec l’assistance technique d’Illumina. Dans la plupart des cas, le remplacement du disque dur est nécessaire.

Vous pouvez continuer la procédure de configuration de l’analyse et les opérations normales. Le but de ce message est de pouvoir planifier à l’avance une visite de service pour éviter des interruptions durant le fonctionnement normal de l’instrument. Pour continuer, sélectionnez Acknowledge (Accuser réception), puis Close (Fermer).

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Configurer les paramètres du système

Le système est configuré lors de l’installation. Toutefois, si une modification est nécessaire ou si le système doit être reconfiguré, utilisez les options de configuration du système.

}

Configuration réseau : fournit des options de paramètres de l’adresse IP, d’adresse de serveur de noms de domaine (DNS), de nom d’ordinateur et de nom de domaine.

}

Configuration BaseSpace : fournit des options de méthodes d’analyse, y compris

BaseSpace, BaseSpace Onsite, le mode autonome et la surveillance de l’analyse dans

BaseSpace, ainsi que des paramètres d’identifiants BaseSpace par défaut et de création de rapports sur la santé de l’instrument.

}

Configuration des balayages de la puce BeadChip : fournit des options permettant de définir l’emplacement du dossier DMAP par défaut, l’emplacement du dossier de sortie, le format de fichier des images enregistrées et le type de fichier de sortie.

Définir la configuration réseau

1 Dans l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System

Configuration (Configuration du système).

2 Sélectionnez Network Configuration (Configuration du réseau).

3 Sélectionnez Obtain an IP address automatically (Obtenir automatiquement une adresse IP) pour récupérer l’adresse IP sur un serveur DHCP.

REMARQUE

Le protocole DHCP (Dynamic Host Configuration Protocol) est un protocole réseau standard utilisé sur les réseaux IP afin de distribuer les paramètres de configuration du réseau de manière dynamique.

Sinon, sélectionnez Use the following IP address (Utiliser l’adresse IP suivante) pour connecter manuellement l’instrument à un autre serveur de la manière suivante.

Communiquez avec votre administrateur réseau pour obtenir les adresses spécifiques à votre installation.

} Saisissez l’adresse IP. L’adresse IP est une série de quatre nombres séparés par des points, par exemple 168.62.20.37.

}

Saisissez le masque de sous-réseau, qui est une subdivision du réseau IP.

}

Saisissez l’adresse de la passerelle par défaut, c’est-à-dire le routeur du réseau qui se connecte à Internet.

4 Sélectionnez Obtain a DNS address automatically (Obtenir automatiquement une adresse DNS) pour connecter l’instrument au serveur de nom de domaine associé à l’adresse IP.

Sinon, sélectionnez Obtain a DNS address automatically (Obtenir automatiquement une adresse DNS) pour connecter manuellement l’instrument au serveur de nom de domaine de la manière suivante.

} Saisissez les adresses DNS préférées. L’adresse DNS est le nom du serveur utilisé pour traduire les noms de domaine en adresses IP.

}

Saisissez l’adresse DNS secondaire. L’adresse secondaire est utilisée si le DNS préféré ne peut pas traduire un nom de domaine particulier en adresse IP.

5 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour passer à l’écran Computer (Ordinateur).

Guide du système NextSeq 550

REMARQUE

Le nom de l’ordinateur de l’instrument est attribué à l’ordinateur de l’instrument au moment de sa fabrication. Toute modification du nom de l’ordinateur peut avoir un impact sur la connectivité et nécessite un administrateur réseau.

6 Connectez l’ordinateur de l’instrument à un domaine ou à un groupe de travail de la manière suivante.

}

Pour les instruments connectés à Internet : sélectionnez Member of domain

(Membre du domaine), puis saisissez le nom du domaine associé à la connexion

Internet au niveau de votre installation. Les modifications de domaine nécessitent le nom d’utilisateur et le mot de passe d’un administrateur.

} Pour les instruments non connectés à Internet : sélectionnez Member of work

group (Membre du groupe de travail), puis saisissez le nom du groupe de travail. Le nom du groupe de travail est propre à votre établissement.

7 Sélectionnez Save (Enregistrer).

Définir la configuration BaseSpace

1 Dans l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System

Configuration (Configuration du système).

2 Sélectionnez BaseSpace Configuration (Configuration de BaseSpace).

3 Sélectionnez l’une des options suivantes pour définir un emplacement où les données seront envoyées pour une analyse ultérieure.

}

Sélectionnez BaseSpace pour envoyer les données de séquençage à l’environnement

BaseSpace d’Illumina.

[Facultatif] Cochez la case Output Folder (Dossier de sortie), sélectionnez Browse (Parcourir), puis accédez à un emplacement réseau secondaire où les fichiers BCL seront enregistrés en plus de BaseSpace.

} Sélectionnez l’option BaseSpace Onsite. Dans le champ Server Name (Nom du serveur), saisissez le chemin complet de votre serveur BaseSpace Onsite.

[Facultatif]

Cochez la case Output Folder (Dossier de sortie), sélectionnez Browse (Parcourir), puis accédez à un emplacement réseau secondaire où les fichiers BCL seront enregistrés en plus du serveur BaseSpace Onsite.

}

Sélectionnez Standalone instrument (Instrument autonome) pour enregistrer les données uniquement vers un emplacement réseau. Sélectionnez Browse (Parcourir) pour sélectionner l’emplacement réseau de votre choix. Le logiciel de commande génère automatiquement le nom du dossier de sortie.

}

[Facultatif] Sélectionnez Use Run Monitoring (Utiliser la surveillance d’analyse) pour surveiller l’analyse à l’aide des outils de visualisation de BaseSpace. Des identifiants de connexion BaseSpace ainsi qu’une connexion Internet sont nécessaires.

4 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour passer à l’écran BaseSpace.

5 Si vous avez sélectionné BaseSpace ou BaseSpace Onsite, réglez les paramètres

BaseSpace de la manière suivante.

} Saisissez les paramètres User Name (Nom d’utilisateur) et Password (Mot de passe) de BaseSpace afin d’enregistrer l’instrument auprès de BaseSpace.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

}

Sélectionnez Use default login and bypass the BaseSpace login screen (Utiliser la connexion par défaut et passer l’écran de connexion BaseSpace) pour définir le nom d’utilisateur et le mot de passe enregistrés en tant qu’identifiants de connexion par défaut. Ce réglage permet de passer outre l’écran BaseSpace lors de la configuration de l’analyse.

6 Si vous avez sélectionné BaseSpace, sélectionnez Send instrument health information

to Illumina (Envoyer des renseignements sur l’état de l’instrument à Illumina) pour envoyer des fichiers journaux à Illumina. Cette option n’est pas disponible avec

BaseSpace Onsite.

7 Sélectionnez Save (Enregistrer).

Configuration des balayages de la puce BeadChip

1 Dans l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System

Configuration (Configuration du système).

2 Sélectionnez BeadChip Scan Configuration (Configuration des balayages de la puce

BeadChip)

3 Pour spécifier un emplacement par défaut pour le dossier DMAP, sélectionnez Browse

(Parcourir) et accédez à l’emplacement de votre choix sur le réseau de votre installation.

REMARQUE

Avant chaque balayage, téléchargez et copiez le contenu DMAP vers cet emplacement.

Le contenu DMAP est requis pour chaque puce BeadChip et est unique à chaque code à barres de puce BeadChip.

4 Pour spécifier un emplacement de sortie par défaut, sélectionnez Browse (Parcourir) et accédez à l’emplacement de votre choix sur le réseau de votre installation.

5 Sélectionnez un format de fichier d’image pour les images enregistrées. Le type d’image par défaut est JPG.

6 Sélectionnez un format de fichier de sortie pour les données de balayage. Le type de fichier de sortie par défaut est GTC only (GTC uniquement).

7 Sélectionnez Save (Enregistrer).

8 Dans l’écran Scan Map (Carte de balayage), indiquez le chemin complet du fichier de manifeste et du fichier de groupement pour chaque type de puce BeadChip.

Sélectionnez Browse (Parcourir) pour chaque type de fichier et accédez au dossier qui contient ces fichiers.

Guide du système NextSeq 550

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Annexe B Real-Time Analysis

Real-Time Analysis

Présentation de Real-Time Analysis

Flux de travail de Real-Time Analysis

Guide du système NextSeq 550

Présentation de Real-Time Analysis

Le NextSeq 550 utilise une version du logiciel Real-Time Analysis (RTA) appelée RTA v2.

RTA v2 fonctionne sur l’ordinateur de l’instrument. Il extrait les intensités à partir des images, réalise la définition des bases et lui attribue des scores de qualité. RTA v2 communique avec le logiciel de commande par le biais d’une interface Web HTTP et de fichiers mémoire partagés. Si RTA v2 est arrêté, il ne reprend pas le traitement et les données de l’analyse ne sont pas enregistrées.

REMARQUE

Les performances de démultiplexage ne sont pas calculées. L’onglet Index du visualiseur d’analyse de séquençage (SAV) n’est donc pas rempli.

Entrées de RTA v2

RTA v2 nécessite les entrées suivantes pour le traitement :

} Les images des plaques contenues dans la mémoire locale du système.

}

RunInfo.xml, qui est généré automatiquement au début de l’analyse et fournit le nom de l’analyse, le nombre de cycles, l’état d’indexation d’une lecture ainsi que le nombre de plaques sur la Flow Cell.

} RTA.exe.config, qui est un fichier de configuration logicielle au format XML.

RTA v2 reçoit des commandes du logiciel de commande indiquant l’emplacement du fichier RunInfo.xml et si un dossier de sortie facultatif est spécifié.

Fichiers de sortie RTA v2

Les images de chaque canal passent dans la mémoire sous forme de plaques. La plaque est une petite zone d’imagerie sur la Flow Cell qui constitue pour la caméra l’unité de vision.

À partir de ces images, le logiciel produit des fichiers de sortie qui prennent la forme d’un ensemble de fichiers de définition des bases dont la qualité est notée et de fichiers de filtrage. Tous les autres fichiers supportent les fichiers de sortie.

Type de fichiers

Fichiers de définition des bases

Fichiers de filtrage

Fichier d’emplacement des amplifiats

Fichiers index de définition des bases

Description

Chaque plaque qui est analysée est incluse dans un fichier cumulé de définition des bases (*.bcl) pour chaque ligne et chaque cycle. Le fichier cumulé de définition des bases contient la définition des bases ainsi que le score de qualité associé à chaque amplifiat dans cette ligne.

Chaque plaque produit des renseignements sur le filtre qui sont rassemblés dans un fichier de filtrage (*.filter) pour chaque ligne.

Le fichier de filtrage spécifie si un amplifiat a franchi les filtres.

Les fichiers d’emplacement des amplifiats (*.locs) contiennent les coordonnées X et Y de chaque amplifiat dans une plaque. Lors de la génération du modèle, un fichier d’emplacement des amplifiats est créé pour chaque ligne.

Un fichier d’index de définition des bases (*.bci) est produit pour chaque ligne afin de préserver les renseignements originaux sur la plaque. Le fichier d’index contient une paire de valeurs pour chaque plaque, qui sont respectivement le numéro de cette plaque et le nombre d’amplifiats qu’elle contient.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Les fichiers de sortie sont utilisés pour une analyse en aval dans BaseSpace. Vous pouvez aussi utiliser le logiciel de conversion bcl2fastq pour la conversion FASTQ, ainsi que des solutions d’analyse tierces. NextSeq Les fichiers nécessitent bcl2fastq v2.0 ou ultérieure.

Pour la dernière version de bcl2fastq, consultez la page de téléchargement de NextSeq sur le site Web d’Illumina.

RTA v2 fournit des indicateurs en temps réel sur la qualité de l’analyse, stockés dans des fichiers InterOp. Les fichiers InterOp sont des fichiers de sortie binaires contenant des indicateurs relatifs aux plaques, aux cycles et au niveau de lecture nécessaires pour afficher des indicateurs en temps réel en utilisant le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV).

Pour la dernière version du SAV, consultez la page de téléchargement du SAV sur le site

Web d’Illumina.

Amplifiats passant par le filtre

Au cours de l’analyse, RTA v2 filtre les données brutes pour supprimer les lectures non conformes au seuil de qualité des données. Les amplifiats qui se chevauchent et ceux de mauvaise qualité sont supprimés.

Dans le cas d’une analyse sur deux canaux, RTA v2 utilise un système basé sur une population pour déterminer la pureté d’une définition des bases. Les amplifiats franchissent le filtre (PF) lorsqu’une définition des bases au cours des 25 premiers cycles a une pureté de < 0,63. Les bases des amplifiats qui ne franchissent pas le filtre ne sont pas définies.

Gestion des erreurs

RTA v2 crée des fichiers journaux et les écrit dans le dossier RTALogs. Les erreurs sont enregistrées dans un fichier d’erreur au format *.tsv

Les fichiers journaux et d’erreur suivants sont transférés vers leur emplacement final de sortie à la fin du traitement :

}

*GlobalLog*.tsv récapitule les événements importants survenus pendant l’analyse.

} *LaneNLog*.tsv répertorie les événements relatifs au traitement de chaque ligne.

}

*Error*.tsv répertorie les erreurs survenues au cours d’une analyse.

}

*WarningLog*.tsv répertorie les avertissements reçus au cours d’une analyse.

Guide du système NextSeq 550

Flux de travail de Real-Time Analysis

Génération du modèle

Enregistrement et extraction des intensités

Correction de la mise en phase

Définition des bases

Notation de la qualité

Établit les emplacements des amplifiats.

Enregistre l’emplacement de chaque amplifiat sur la Flow Cell et détermine une valeur d’intensité pour chaque amplifiat.

Corrige les effets de la mise en phase et de la mise en préphase.

Détermine une définition des bases pour chaque amplifiat.

Attribue un score de qualité à chaque définition des bases.

Génération du modèle

La première étape du flux de travail RTA est la génération du modèle, qui définit la position de chaque amplifiat dans une plaque à l’aide des coordonnées X et Y.

La génération du modèle nécessite les données d’image des cinq premiers cycles de l’analyse. Une fois l’imagerie du dernier cycle de modèle pour une plaque réalisée, le modèle est généré.

REMARQUE

Pour détecter un amplifiat pendant la génération du modèle, il doit y avoir au moins une base autre que G dans les cinq premiers cycles. Pour toutes les séquences d’indexage, RTA v2 nécessite au moins une base autre que G dans les deux premiers cycles.

Le modèle est utilisé comme référence pour l’étape suivante d’enregistrement et l’extraction des intensités. Les emplacements des amplifiats sur toute la Flow Cell sont écrits dans les fichiers d’emplacement des amplifiats (*.locs), un pour chaque ligne.

Enregistrement et extraction des intensités

L’enregistrement et l’extraction des intensités commencent après la génération du modèle.

}

L’enregistrement aligne les images produites par chaque cycle d’imagerie selon le modèle.

}

L’extraction d’intensité détermine une valeur d’intensité pour chaque amplifiat du modèle pour une image donnée.

S’il y a échec d’enregistrement de l’image d’un cycle, quelle qu’elle soit, aucune définition des bases ne sera générée pour cette plaque dans ce cycle. Utilisez le logiciel SAV

(visualiseur d’analyse de séquençage) pour examiner les vignettes et trouver les images dont l’enregistrement a échoué.

Correction de la mise en phase

Lors de la réaction de séquençage, chaque brin d’ADN dans un amplifiat s’étend d’une base par cycle. La mise en phase et la mise en préphase ont lieu lorsqu’un brin se retrouve hors phase par rapport au cycle d’incorporation en cours.

} La mise en phase se produit lorsqu’un brin est en retard d’une base.

} La mise en préphase se produit lorsqu’un brin est en avance d’une base.

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Figure 32 Mise en phase et en préphase

A Lecture avec une base présentant une mise en phase

B Lecture avec une base présentant une mise en préphase

RTA v2 corrige les effets de la mise en phase et de la mise en préphase, qui exploite au maximum la qualité des données à chaque cycle tout au long de l’analyse.

Définition des bases

La définition des bases détermine une base (A, C, G ou T) pour chaque amplifiat d’une plaque donnée d’un cycle spécifique. Le NextSeq 550 utilise le séquençage à deux canaux, qui ne nécessite que deux images pour encoder les données de quatre bases ADN : une à partir du canal rouge et une à partir du canal vert.

Les intensités extraites d’une image et leur comparaison avec une autre image donnent quatre populations distinctes, chacune correspondant à un nucléotide. Le processus de définition des bases détermine à quelle population appartient chaque amplifiat.

Figure 33 Visualisation de l’intensité des amplifiats

Tableau 1 Définition des bases dans le séquençage à deux canaux

Base

Canal rouge

Canal vert

Résultat

A 1

(allumé)

Amplifiats montrant une intensité tant dans le canal rouge que dans le vert.

C 1

(allumé)

(éteint)

Amplifiats montrant une intensité seulement dans le canal rouge.

G 0

(éteint)

Amplifiats ne montrant d’intensité dans aucun emplacement d’amplifiat connu.

T 0

(éteint)

(allumé)

Amplifiats montrant une intensité seulement dans le canal vert.

Guide du système NextSeq 550

Notation de la qualité

Un score de qualité, ou « Q-score », permet de prédire la probabilité d’une erreur dans la définition des bases. Un Q-score plus élevé implique qu’une définition des bases est de plus haute qualité et a de plus fortes probabilités d’être correcte.

Le score de qualité constitue un moyen simple de communiquer les probabilités de petites erreurs. On représente un score de qualité sous la forme « Q(X) », où X est le score. Le tableau suivant montre la relation entre le score de qualité et la probabilité d’une erreur.

Score de qualité Q(X)

Q40

Q30

Q20

Q10

Probabilité d’une erreur

0,0001 (1 sur 10 000)

0,001 (1 sur 1 000)

0,01 (1 sur 100)

0,1 (1 sur 10)

REMARQUE

La notation de la qualité s’appuie sur une version modifiée de l’algorithme Phred.

La notation de la qualité calcule un ensemble d’indicateurs prévisionnels pour chaque définition des bases, puis utilise ces valeurs pour rechercher un score de qualité dans un tableau de qualité. Les tableaux de qualité servent à fournir des indicateurs de qualité extrêmement précis pour des analyses générées par une configuration spécifique de plateforme de séquençage et de version de chimie.

Une fois le score de qualité établi, les résultats sont enregistrés dans des fichiers de définition des bases (*.bcl).

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Annexe C Fichiers et dossiers de sortie

Fichiers et dossiers de sortie

Fichiers de sortie de séquençage

Structure du dossier de sortie de séquençage

Fichiers de sortie du balayage

Structure du dossier de sortie de balayage

Guide du système NextSeq 550

Fichiers de sortie de séquençage

Type de fichiers

Fichiers de définition des bases

Fichier index de définition des bases

Fichier d’emplacement des amplifiats

Fichiers de filtrage

Fichiers InterOp

Fichier de configuration

RTA

Fichier de renseignements sur l’analyse

Description, emplacement et nom des fichiers

Chaque plaque analysée est incluse dans un fichier de définition des bases; ces fichiers sont rassemblés dans un fichier pour chaque ligne de chaque cycle. Le fichier cumulé contient la définition des bases ainsi que le score de qualité codé associé à chaque amplifiat de cette ligne.

Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] : les fichiers sont stockés dans un dossier pour chaque ligne.

[Cycle].bcl.bgzf

, dans lequel [Cycle] représente le numéro à quatre chiffres du cycle. Les fichiers de définition des bases sont compressés à l’aide du logiciel de compression gzip.

Pour chaque ligne, un fichier index binaire indique les renseignements sur la plaque d’origine dans une paire de valeurs pour chaque plaque, qui sont le numéro et le nombre d’amplifiats de la plaque.

Les fichiers d’index de définition des bases sont créés la première fois qu’un fichier de définition des bases est créé pour une ligne.

Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] : les fichiers sont stockés dans un dossier pour chaque ligne.

s_[Ligne].bci

Pour chaque plaque, les coordonnées XY de chaque amplifiat sont rassemblées dans un fichier d’emplacement des amplifiats pour chaque ligne. Les fichiers d’emplacement des amplifiats sont le résultat de la génération du modèle.

Data\Intensities\L00[X] : les fichiers sont stockés dans un dossier pour chaque ligne.

s_[ligne].locs

Les fichiers de filtrage spécifient si les amplifiats ont franchi les filtres.

Les renseignements de filtrage sont rassemblés dans un seul fichier de filtrage pour chaque ligne et chaque lecture.

Les fichiers de filtrage sont générés au cycle 26 et portent sur 25 cycles de données.

Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] : les fichiers sont stockés dans un dossier pour chaque ligne.

s_[ligne].filter

Fichier de compte rendu binaire nécessaire pour le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV). Les fichiers InterOp sont mis à jour tout au long de l’analyse.

Dossier InterOp

Créé au début de l’analyse, le fichier de configuration RTA indique les paramètres de l’analyse.

[Dossier racine] , RTAConfiguration.xml

Indique le nom de l’analyse, le nombre de cycles à chaque lecture, si la lecture est une lecture indexée et le nombre de témoins et de plaques sur la Flow Cell. Le fichier de renseignements sur l’analyse est créé au début de l’analyse.

[Dossier racine] , RunInfo.xml

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Type de fichiers

Fichier vignette

Description, emplacement et nom des fichiers

Une vignette pour chaque canal de couleur (rouge et vert) pour les plaques 1, 6 et 12 depuis toutes les caméras, les surfaces hautes et basses à chaque cycle au cours de l’imagerie.

Thumbnail_Images\L00[X]\C[X.1] : les fichiers sont stockés dans un dossier pour chaque ligne et dans un sous-dossier pour chaque cycle.

s_[ligne]_[plaque]_[canal].jpg

: dans le nom du fichier, la plaque est représentée par un numéro à cinq chiffres qui indique la surface, le témoin, la caméra et la plaque. Pour plus de renseignements, consultez la section

Numérotation des plaques à la page 83

et la section

Nommage

des vignettes à la page 83 .

Plaques de la Flow Cell

La plaque est une petite zone d’imagerie sur la Flow Cell qui constitue pour la caméra l’unité de vision. Le nombre total de plaques dépend du nombre de lignes, de témoins et de surfaces imagés sur la Flow Cell, ainsi que de la façon dont les caméras fonctionnent conjointement pour recueillir les images.

}

Les Flow Cell à haut débit comportent 864 plaques au total.

}

Les Flow Cell à débit moyen comportent 288 plaques au total.

Tableau 2 Plaques de la Flow Cell

Composant de la

Flow Cell

Débit

élevé

Lignes

Débit moyen

Description

Surfaces

Témoins par ligne

Segments de caméra

Plaques par témoin par segment de caméra

Nombre total de plaques imagées

864

288

Une ligne est un canal physique possédant des ports d’entrée et de sortie dédiés.

La Flow Cell est imagée sur deux surfaces : le dessus et le dessous. Le système image le dessus d’une plaque, puis le dessous de la même plaque avant de passer à la plaque suivante.

Un témoin est une colonne de plaques sur une ligne.

L’instrument utilise six caméras pour imager la Flow Cell en trois segments pour chaque ligne.

La plaque est la zone de la Flow Cell qui constitue pour la caméra une unité d’image.

Le nombre total de plaques est égal aux lignes × surfaces × témoins × segments de caméra × plaques par témoin par segment.

Numérotation des lignes

Les lignes 1 et 3, appelées paire de lignes A, sont imagées simultanément. Les lignes 2 et 4, appelées paire de lignes B, sont imagées lorsque l’imagerie de la paire de lignes A est terminée.

Guide du système NextSeq 550

Figure 34 Numérotation des lignes

A Paire de lignes A : lignes 1 et 3

B Paire de lignes B : lignes 2 et 4

Numérotation des témoins

Chaque ligne est imagée en trois témoins. Les témoins sont numérotés de 1 à 3 pour les

Flow Cell à débit élevé.

Figure 35 Numérotation des témoins

Numérotation des caméras

Le système NextSeq 550 utilise six caméras pour l’imagerie de la Flow Cell.

Les caméras sont numérotées de 1 à 6. Les caméras 1 à 3 effectuent l’imagerie de la ligne 1.

Les caméras 4 à 6 effectuent l’imagerie de la ligne 3. Une fois l’imagerie des lignes 1 et 3 effectuée, le module d’imagerie se déplace sur l’axe X pour effectuer l’imagerie des lignes 2 et 4.

Figure 36 Numérotation des caméras et des segments (Flow Cell à débit élevé illustrée)

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Numérotation des plaques

Chaque témoin du segment de chacune des caméras comporte 12 plaques. Les plaques sont numérotées de 01 à 12 dans un format de deux chiffres, peu importe le numéro du témoin ou le segment de caméra.

Figure 37 Numérotation des plaques

Le numéro complet de la plaque comporte cinq chiffres pour indiquer son emplacement comme suit :

} Surface : 1 représente la surface supérieure, et 2, la surface inférieure

} Témoin : 1, 2 ou 3

}

Caméra : 1, 2, 3, 4, 5 ou 6

}

Plaque : 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11 ou 12

Exemple : la plaque portant le numéro 12508 indique qu’il s’agit d’une surface supérieure, du témoin 2, de la caméra 5 et de la plaque 8.

Le numéro complet à cinq chiffres de la plaque est utilisé dans le nom des vignettes et des fichiers de mise en phase empirique. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section

Fichiers de sortie de séquençage à la page 80

Nommage des vignettes

Une vignette pour chaque canal de couleur (rouge et vert) pour les plaques 1, 6 et 12 est générée depuis toutes les caméras, les surfaces hautes et basses à chaque cycle au cours de l’imagerie. Les fichiers de vignettes sont générés au format JPG.

Chaque nom d’image commence par s_ et reçoit ensuite les éléments que prévoit la convention de dénomination suivante :

} Ligne : 1, 2, 3 ou 4

}

Plaque : numéro de la plaque à cinq chiffres, correspondant à la surface, au témoin, à la caméra et à la plaque

}

Canal : rouge ou vert

Exemple : s_3_12512_green.jpg, qui correspond à la ligne 3, la surface supérieure, le témoin 2, la caméra 5, la plaque 12 et le canal vert.

Guide du système NextSeq 550

Structure du dossier de sortie de séquençage

Le logiciel de commande génère automatiquement le nom du dossier de sortie.

Data

Intensities

BaseCalls

L001 : fichiers de définition des bases de la ligne 1, rassemblés dans un fichier par cycle.

L002 : fichiers de définition des bases de la ligne 2, rassemblés dans un fichier par cycle.

L003 : fichiers de définition des bases de la ligne 3, rassemblés dans un fichier par cycle.

L004 : fichiers de définition des bases de la ligne 4, rassemblés dans un fichier par cycle.

L001 : fichier *.locs rassemblant les emplacements des amplifiats de la ligne 1.

L002 : fichier *.locs rassemblant les emplacements des amplifiats de la ligne 2.

L003 : fichier *.locs rassemblant les emplacements des amplifiats de la ligne 3.

L004 : fichier *.locs rassemblant les emplacements des amplifiats de la ligne 4.

Images

Focus

L001 : images de mise au point de la ligne 1.

L002 : images de mise au point de la ligne 2.

L003 : images de mise au point de la ligne 3.

L004 : images de mise au point de la ligne 4.

InterOp : fichiers binaires utilisés par le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV).

Logs : fichiers journaux décrivant les étapes de fonctionnement.

Recipe : fichier de formule propre à l’analyse portant l’identifiant de la cartouche de réactifs.

RTALogs (JournauxRTA) : fichiers journaux décrivant les étapes de l’analyse.

Thumbnail_Images : vignettes pour les plaques 1, 6 et 12 dans chaque témoin de chaque cycle.

RTAComplete.xml

RTAConfiguration.xml

RunInfo.xml

RunNotes.xml

RunParameters.xml

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Fichiers de sortie du balayage

Type de fichiers

Fichiers GTC

Fichiers images

Description, emplacement et nom des fichiers

Fichier de typage génotypique. Un fichier GTC est généré pour chaque échantillon balayé sur la puce BeadChip. Le nom du fichier comprend le code à barres et l’échantillon analysé.

[code à barres]_[échantillon].gtc

Les fichiers images sont nommés d’après la zone qui a été balayée sur la puce BeadChip. Ce nom comprend le code à barres, l’échantillon et la section sur la puce BeadChip, le témoin, ainsi que le canal d’imagerie

(rouge ou vert).

[code à barres]_[échantillon]_[section]_[témoin]_[caméra]_[plaque]_

[canal].jpg

• Code à barres : le nom de fichier commence par le code à barres de la puce BeadChip.

• Échantillon : une zone de la puce BeadChip numérotée selon une rangée (R0X), de haut en bas, et selon une colonne (C0X) de gauche

à droite.

• Section : une rangée numérotée au sein d’un échantillon.

• Témoin : les puces BeadChip sont imagées sous la forme d’un ensemble de plaques qui se chevauchent. Seul un témoin est donc utilisé pour l’imagerie de la section.

• Caméra : la caméra utilisée pour recueillir l’image.

• Plaque : une zone d’imagerie qui constitue pour la caméra l’unité de vision.

• Canal : un canal est soit rouge, soit vert.

Guide du système NextSeq 550

Structure du dossier de sortie de balayage

[Date]_[Nom de l’instrument]_[Nº de balayage]_[Code à barres]

[Code à barres]

Config

Effective.cfg : enregistre les paramètres de configuration utilisés lors du balayage.

Focus : contient les fichiers images servant à mettre au point le balayage.

Logs : contient les fichiers journaux répertoriant chaque étape effectuée pendant le balayage.

PreScanDiagnosticFiles

[Date_Heure] Barcode Scan

ProcessedBarcode.jpg : image du code à barres de la puce BeadChip.

Diagnostics de balayage (fichiers journaux)

PreScanChecks.csv : enregistre les résultats de la vérification automatique.

Fichiers GTC : fichiers de typage génotypique (un fichier par échantillon).

Fichiers IDAT : (facultatif) fichiers de données d’intensité (deux fichiers par

échantillon, un fichier par canal).

Fichiers images : images du balayage pour chaque échantillon, section, témoin, caméra, plaque et canal.

[Code à barres]_sample_metrics.csv

[Code à barres]_section_metrics.csv

ScanParameters.xml

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Index

A adaptateur

chargement de la puce BeadChip 39

orientation de la puce BeadChip 38

aide

amplifiats passant par le filtre 75

analyse

fichiers de sortie 80

analyse temps réel

mise en phase 76

analyse, primaire

pureté du signal 75

arrêter l’instrument 50

assistance clientèle 91 assistance technique 91

B balayer des fichiers de sortie

icônes de transfert 31

bouton d’alimentation 6, 12

C cartouche de réactifs

préparation 20

présentation 9

réservoir nº 28 46

cartouche de tampon 10, 26

compartiment d’imagerie 4 compartiment de réactifs 4 compartiment du tampon 4

compatibilité

Flow Cell, cartouche de réactifs 8 suivi RFID 8-9

composants

barre d’état 4 compartiment d’imagerie 4 compartiment de réactifs 4 compartiment du tampon 4

configuration autonome 28 configuration de BaseSpace 28

configuration de l’analyse,option

avancée 14

consommables 8

analyses de séquençage 15

cartouche de réactifs 9

cartouche de tampon 10

consommables de lavage 45-46

eau de laboratoire 15

Flow Cell 8

Guide du système NextSeq 550

maintenance de l'instrument 15

consommables fournis par

l’utilisateur 15

cycles d’une lecture 18

Decode File Client 34

accéder par compte 37 accès par puce BeadChip 37

définition des bases 77

dépannage

échec de l’enregistrement de la

numérisation 62

fichiers spécifiques à lʼanalyse 53

fichiers spécifiques au balayage 54

impossible de lire le code à barres de

la puce BeadChip 62

indicateurs de basse qualité 59

options pour communiquer avec

nous 52

remplacer les fichiers de manifeste et

les fichiers de groupement 63

réservoir des réactifs usagés 58

vérification avant analyse 55

dépannage du système

vérification du système 65

documentation 3, 91

dossier DMAP

Decode File Client 34

téléchargement 37

durée de l’analyse 18

éliminer les consommables 14

E emplacement des amplifiats

fichiers 80

génération du modèle 76

emplacement du dossier 28

erreurs et avertissements 5

dans les fichiers de sortie 75

erreurs lors de la vérification avant

analyse 55

F fichiers d’entrée, balayage

dossier DMAP 34

dossier DMAP, télécharger 37

fichiers de groupement 34, 63 fichiers de manifeste 34, 63

fichiers de définition des bases 80 fichiers de filtrage 80 fichiers de sortie 80

fichiers de sortie, balayage

GTC, IDAT 85

fichiers de sortie, séquençage 80

fichiers GTC 85

fichiers InterOp 53, 80

fichiers journaux

Flow Cell

broches d’alignement 24

dénomination du fichier image 83

emballage 21

imagerie 82

inspection 21 joints de port 21 nettoyage 21

nombre de témoins 82

numérotation des lignes 81

numérotation des plaques 83

flux de travail

cartouche de réactifs 20, 26 cartouche de tampon 26

connexion à BaseSpace 24

durée de l’analyse 18

Flow Cell 24

hypochlorite de sodium 46

indicateurs de l’analyse 30

mode autonome 28 mode BaseSpace 28

option de chargement avancé 14

préparation de la Flow Cell 21

vérification avant analyse 29, 40

flux de travail de séquençage 76

formamide, position 6 27

formation en ligne 3

génération du modèle 76

gérer l’instrument

arrêt 50

personnalisation 13

hypochlorite de sodium, lavage 46

I icônes

erreurs et avertissements 5

état 5

imagerie, séquençage à deux canaux 77

indicateurs

cycles d’intensité 30 cycles de densité des amplifiats 30

définition des bases 77

indicateurs de l’analyse 30

instrument

bouton d’alimentation 6

démarrage 12

paramètres de configuration 69

intensités 77

interrupteur d’alimentation 12

L lavage

automatique 32

composants de lavage 45

consommables fournis par

l’utilisateur 45 lavage manuel 45

lavage après analyse 32

lavage de l’instrument 45

logiciel analyse d’image, définition des

bases 5

configuration de l’instrument 13

durée de l’analyse 18

initialisation 12

mise à jour automatique 48 mise à jour manuelle 48

paramètres de configuration 69

sur instrument 5

logiciel BlueFuse Multi 2

logiciel de commande 5 logiciel Real-Time Analysis 2, 5

résultats 80

longueur de lecture 18

M maintenance de l'instrument

consommables 15

maintenance préventive 44

message d’erreur RAID 68

mise à jour logicielle 48

mise en phase empirique 76 mise en phase, mise en préphase 76

nom d’utilisateur et mot de passe 12

nom d’utilisateur et mot de passe du

système 12

nom de l’avatar 13

nom de l’instrument,

personnalisation 13

numérotation des caméras 82

numérotation des lignes 81

numérotation des plaques 83

numérotation des témoins 82

option de chargement avancé 13-14

paires de lignes 81

paramètres de configuration 69

paramètres de l’analyse

mode autonome 28 mode BaseSpace 28 modifier les paramètres 28

passant par le filtre (PF) 75

personnalisation 13

préventive, maintenance 44

probabilité d’erreur 78

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

puce BeadChip

adaptateur 6, 38

analyse 2

chargement 39

échec de l’enregistrement 62

impossible de lire le code à

barres 62

orientation du code à barres 38

types 2

Q-scores 78

R réactifs

mise au rebut adéquate 26

sous forme de trousse 8

réactifs usagés

élimination 24

mise au rebut 47

réservoir plein 58

recommandations relatives à l’eau de

laboratoire 15

réhybridation de primer 59 réhybridation, lecture 1 59

RTA v2

arrêt 74

gestion des erreurs 75

présentation 74

RunInfo.xml 53, 80

scores de qualité 78 algorithme Phred 78

séquençage consommables fournis par

l'utilisateur 15

service de copie de l’analyse 31

suivi RFID 8

T transfert de données

données de balayage 41

icônes d’activité 31 service de copie de l’analyse 31

vérification avant analyse 29, 40

vérification du système 65

vignettes 81

visualiseur d’analyse de séquençage 18

Guide du système NextSeq 550

Support nº 20001843

Document nº 15069765 v01 FRA

Assistance technique

Pour obtenir une assistance technique, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.

Tableau 3 Coordonnées générales d’Illumina

Site Web

www.illumina.com

Courriel

techsupport@illumina.com

Tableau 4 Numéros de téléphone de l’assistance clientèle d’Illumina

Région

Amérique du Nord

Allemagne

Australie

Autriche

Belgique

Danemark

Espagne

Finlande

France

Numéro de la personne-ressource

+(1) 800 809 4566

0800 180 8994

1 800 775 688

0800 296575

0800 81102

80882346

900 812168

0800 918363

0800 911850

Région

Irlande

Italie

Norvège

Nouvelle Zélande

Pays-Bas

Royaume-Uni

Suède

Suisse

Autres pays

Numéro de la personne-ressource

+(1) 800 812 949

800 874909

800 16836

0800 451 650

0800 0223859

0800 917 0041

020790181

0800 563118

+(44) 179 534 000

Fiches signalétiques : disponibles sur le site Web d’Illumina à l’adresse support.illumina.com/sds.html

Documentation du produit : disponible en téléchargement au format PDF sur le site Web d’Illumina. Accédez au site support.illumina.com, sélectionnez un produit, puis sélectionnez Documentation & Literature (Documentation et littérature).

Guide du système NextSeq 550

Illumina

5200 Illumina Way

San Diego, Californie 92122 États-Unis

+(1) 800 809 ILMN (4566)

+(1) 858 202 4566 (en dehors de l’Amérique du Nord) techsupport@illumina.com

www.illumina.com

20001843

Support nº 20001843

Hello! I am an AI chatbot specifically trained to assist you with the illumina NextSeq 550 System Guide. I have thoroughly reviewed the document and can help you locate the exact information you need or explain the content in clear and simple terms. Whether you’re looking for guidance on specific features, troubleshooting steps, or general usage, feel free to ask your questions. The more details you provide about your concerns or needs, the more accurately and effectively I can assist you!

Assistant typing

Assistant is out of keyboard. Please, try again later.

It looks like you''ve reached a document that is written in multiple languages, including one that isn''t your native language. You can use the following links to temporarily hide pages without the language you prefer.