1.
6 Préparation des Réactifs
2.
Tampon de Lavage:
•
•
•
•
3.
4.
Laisser la solution concentrée de tampon de lavage revenir à température
ambiante. Vérifier que tout cristal de sel est dissout. Si des cristaux persistent,
placer la bouteille (bien vissée) de solution concentrée de tampon de lavage
dans un bêcher contenant de l’eau chaude, jusqu’à ce que tous les cristaux
soient dissous.
Rincer le distributeur de tampon de lavage ainsi que le tube avec de l’eau
distillée.
Bien mélanger la solution concentrée de tampon de lavage en inversant
doucement la bouteille plusieurs fois.
Dans une éprouvette graduée ou un flacon de 1 L, mélanger-le contenu de la
bouteille de solution concentrée de tampon de lavage (50 mL) avec 950 mL
d’eau distillée ou dé ionisée. Bien mélanger.
Transférer cette solution dans le distributeur de tampon de lavage.
Une fois préparée et stockée à température ambiante (20-25°C) ou réfrigérée
(2-8°C), cette solution peut être utilisée pendant un mois,
REMARQUE: Les cycles répétés de congélation/décongélation doivent être
évités. Les échantillons qui ont été décongelés doivent être bien mélangés
avant centrifugation.
9 Étapes à suivre pour le dosage
Pour obtenir des instructions détaillées pour réaliser ce test, se référer au Manuel
d’utilisation du Luminomètre CLA
Matériel fourni
• Kit CLA de dosage des IgE spécifiques d’allergène (voir paragraphe 4,
REACTIFS/COMPOSANTS)
Solution d’anticorps:
•
•
•
Matériel nécessaire non fourni dans le Kit réactifs
•
Kit Équipement CLA, comprenant:
- Portoir de lavage, pouvant contenir jusqu’à 40 cuves de dosage
- Un réservoir de lavage
- Une bouteille de lavage et son piston
- Une micro pipette et des cônes
- Des récipients jetables, de 50 mL
- Une seringue de 3 CC
•
Une éprouvette graduée ou un flacon de 1 L, afin de préparer du tampon de
lavage
•
De l’eau distillée ou dé ionisée
•
Des tubes pour la collecte des échantillons
•
Une centrifugeuse pouvant tourner à 2000-3000 x g ou 2500-3600 rpm
•
Des tubes de stockage en plastique propre, nécessaires à la préparation des
échantillons
•
Du papier absorbant
•
Des mouchoirs propres ne contenant pas de coton
•
Un luminomètre CLA-1
Laisser revenir la solution d’anticorps à température ambiante.
Inverser doucement la solution d’anticorps avant utilisation.
Si elle n’est pas utilisée, la solution d’anticorps réfrigérée (2-8°C) peut être
utilisée jusqu’à la date d’expiration du kit.
REMARQUE: Une bouteille de solution d‘anticorps suffit pour vingt (20)
cuves de dosage contenant 30 allergènes par cuve et 2 contrôles.
Mélange Photo réactif:
Préparer le mélange photo réactif juste avant utilisation.
•
•
Laisser les composés photo réactifs A, B, C, D revenir à température
ambiante.
Dans un récipient, mélanger des volumes égaux de composé photo réactif A,
B, C et D avec une micro pipette à cône jetable. Il faut un volume minimal de
350 μL de chaque composé photo réactif par cuve de dosage, soit au total
1.4 mL par cuve de dosage.
REMARQUE: Afin d’éviter toute contamination des réactifs, utiliser un
nouveau cône jetable pour chacun des composés photo réactifs.
•
Préparation des cuves de dosage et des échantillons des patients
1.
Avant utilisation, centrifuger à nouveau les échantillons de patients pendant 10
à 20 minutes à 2000-3000 x g ou 2500-3600 rpm.
Remuer doucement le récipient afin de mélanger la solution.
REMARQUE: Le frein de la centrifugeuse pourrait déloger le culot, et
augmenter le bruit de fond et produire des résultats erronés. Éteindre le frein
avant de centrifuger les échantillons
REMARQUE: Le mélange photo réactif doit être utilisé dans les 60
minutes qui suivent le mélange.
7
•
•
•
•
8
Laisser le sang coaguler pendant 1 heure à 2 heures à température
ambiante.
Centrifuger le sang coagulé pendant 10 à 20 minutes à 2000-3000 x g ou
2500-3600 rpm.
Transférer le sérum dans un tube en plastique propre marqué de stockage.
Les échantillons de sérum stockés entre 2 et 8°C peuvent être conservés
pendant une semaine au maximum. Au-delà de cette période, les conserver
congeler à -20°C.
2.
Instructions pour le stockage
Conserver les composants du kit entre 2 et 8°C. S’ils sont stockés
correctement, ces composés peuvent être utilisés jusqu’à la date d’expiration
imprimée sur l’étiquette de chaque réactif.
Ne pas congeler les composants du kit.
Les cuves de dosage sont stockées dans un sac en plastique contenant une
éponge humide. S’assurer que le sac en plastique est refermé proprement
avant et après chaque utilisation. Si l’éponge s’assèche, l’humidifier à nouveau
avec du tampon de lavage, puis refermer le sac en plastique. Ces cuves de
dosage peuvent être utilisées jusqu’à la date d’expiration du kit si elles sont
conservées entre 2 et 8°C.
S’il existe des signes de détérioration, ne pas utiliser le kit. Les signes de
détérioration incluent une odeur inhabituelle, une apparence turbide ou tout
autre signe de contamination.
3.
4.
5.
6.
Sortir du sac en plastique les cuves de dosage nécessaires (une par
échantillon). Refermer le sac et remettre les cuves non utilisées dans le
réfrigérateur.
Essuyer l’humidité à l’extérieur de chaque cuve de dosage.
Indiquer le numéro d’identification du patient sur chacune des cuves de dosage,
en orientant la grille colorée vers le bas.
Noter les numéros de lot des kits, des groupes d’antigènes, ainsi que le numéro
d’identification des patients
Tapoter doucement l’extrémité de la cuve de dosage sur un papier absorbant
afin d’éliminer tout résidu de liquide.
Méthode Standard
A. Remplir les cuves de dosage avec du sérum:
1.
Attacher la seringue de 3 cc sur le haut de la cuve de dosage.
2.
Insérer la partie basse de la cuve de dosage dans un tube contenant du
sérum de patient. Éviter tout précipité et/ou couches de lipides.
3.
A l’aide de la seringue, aspirer lentement le sérum afin de remplir
complètement la cuve de dosage. S’assurer que le filament supérieur
est complètement couvert par du sérum et qu’aucune bulle ne se soit
formée dans la cuve de dosage.
B. Boucher et incuber les cuves de dosage:
1.
Sans ôter la seringue, insérer un bouchon blanc sur la partie inférieure de
la cuve de lavage.
2.
Enlever la seringue et placer un bouchon noir sur le haut de la cuve de
dosage.
Collecte et Préparation des Échantillons
Manipuler les échantillons provenant de patients, ainsi que les composants du kit
selon les précautions prescrites pour tout échantillon de sérum humain ou de sang
pouvant contenir un agent infectieux. Au cours de la manipulation des échantillons
provenant de patients, suivre les précautions d’usage ou celles suggérées par votre
institution.9-11
Le volume minimal de sérum humain nécessaire, sans utilisation d’agitateur rotatif,
par cuve de dosage individuelle est le suivant:
REMARQUE: insérer les bouchons à fond afin d’éviter toute fuite.
3.
Placer les cuves de dosage remplies de sérum verticalement sur le portoir
de lavage.
4.
Laisser incuber à température ambiante pendant 16 à 24 heures, Noter
l’heure du début de l’incubation.
Une cuve de dosage contenant 30 allergènes, 1,5 mL de sérum
Protocole à suivre pour la collecte, la préparation et le stockage du sérum à utiliser
dans le test CLA:
C. Préparer le tampon de lavage en suivant les instructions décrites dans le
paragraphe 6, PREPARATION DES REACTIFS.
Prélever un échantillon de sang veineux dans un tube de séparation du sérum de
10 mL ou un tube à bouchon rouge. Le patient n’a pas besoin d’être à jeûn. Aucune
préparation spéciale n’est nécessaire.
D. Élimination du Sérum:
1.
Enlever le bouchon blanc de la cuve de dosage, remettre la cuve de
dosage sur le portoir de lavage.
2.
Enlever le bouchon noir de la cuve de dosage de façon à éliminer le sérum
dans le réservoir de lavage. Noter l’heure du début D’arrêt de l’incubation.
REMARQUE: Un sérum hémolysé ou contenant des lipides peut avoir un effet
adverse sur l’efficacité du kit CLA de dosage des IgE spécifiques d’allergène.
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