DiaMetra Estriol Saliva Manuel utilisateur

ESTRIOL SALIVA
pour analyses de routine
Détermination immunoenzymatique directe d'œstriol dans la salive
LOT
IVD
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USAGE PRÉVU
Méthode immunoenzymatique colorimétrique par
compétition pour la détermination quantitative
d'œ striol dans la salive.
Le kit Estriol Saliva est destiné exclusivement à un
usage en laboratoire.
1. SIGNIFICATION CLINIQUE
L'œ striol est l'un des trois œ strogènes principaux
produits par le corps humain. Il est produit avant tout
pendant la grossesse à partir s'une unité maternoplacento-fœ tale.
La production fœ to-placentaire d'œ striol entraîne une
augmentation progressive des niveaux circulants
maternels atteignant un pic en fin de gestation,
considérablement supérieurs aux niveaux des
femmes non enceintes. Dans la circulation
maternelle, l'œ striol est rapidement conjugué dans le
foie et excrété par voie urinaire avec une demi-vie de
20 minutes environ. Puisque la production normale de
l'œ striol dépend d'une circulation materno-placentofœ tale intacte et d'un métabolisme fœ tal fonctionnel,
les taux maternels d'œ striol servent à contrôler l'état
du fœ tus pendant la grossesse, en particulier pendant
le troisième trimestre.
La DHEA-S produite par le cortex de la surrénale du
fœ tus est converti en œ striol par le placenta.
Les niveaux anormalement bas peuvent indiquer,
chez une femme enceinte, un problème dans le
développement de l'enfant.
Les taux d'œ striol sont comparables chez les femmes
non enceintes ou en ménopause et chez les
hommes.
2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE
L'œ striol (antigène) présent dans l'échantillon rentre
en compétition avec l'antigène marqué à la
peroxydase par rapport à l'anticorps anti-œ striol
adsorbé sur microplaque (phase solide).
Après une période donnée d'incubation, la séparation
libre-lié est obtenue par simple lavage de la phase
solide. L’
enzyme présent dans la réaction liée
catalyse la réaction entre le substrat (H2O2) et le
substrat TMB (TMB) en développant une coloration
bleue qui vire au jaune après ajout de la solution
d'arrêt (H2SO4).
L’
intensité de la couleur développée est inversement
proportionnelle à la concentration d'œ striol dans
l'échantillon.
Σ = 96 tests
RÉF DKO026
La concentration d'œ striol dans l'échantillon est
calculée sur la base d'une série de Étalons.
3. REACTIFS, MATERIAUX ET INSTRUMENTS
3.1. Réactifs et matériaux fournis dans le
coffret
1. Étalons d'œ striol (6 flacons, 1 mL chaque)
STD0
RÉF DCE002/2606-0
STD1
RÉF DCE002/2607-0
STD2
RÉF DCE002/2608-0
STD3
RÉF DCE002/2609-0
STD4
RÉF DCE002/2610-0
STD5
RÉF DCE002/2611-0
2. Contrôles (2 flacons, 1 mL chaque)
Contrôle L
RÉF DCE045/2601-0
Contrôle M
RÉF DCE045/2602-0
3. Tampon d'incubation (1 flacon, 30 mL)
Tampon phosphate pH 7,5; BSA 1 g/L; agents de
conservation
RÉF DCE010-0
4. Conjugué (1 flacon, 1 mL)
Conjugué d'œ striol avec peroxydase de raifort (HRP)
RÉF DCE002/2602-0
5. Microplaque coatée (1 microplaque sécable)
Anticorps anti-œ striol adsorbée sur microplaque
RÉF DCE002/2603-0
6. Solution de lavage conc. 50X (1 flacon, 20 mL)
NaCl 45 g/L, Tween-20 55 g/L RÉF DCE006-0
7. Substrat TMB (1 flacon, 15 mL)
H2O2-TMB (0,26 g/L) (éviter tout contact avec la peau)
RÉF DCE004-0
8. Solution d'arrêt (1 flacon, 15 mL)
Acide sulfurique 0,15M (éviter le contact avec la peau)
RÉF DCE005-0
3.2. Réactifs nécessaires non fournis dans le
coffret
Eau distillée.
3.3. Matériaux et instruments auxiliaires
Distributeurs automatiques.
Lecteur pour microplaques (450 nm).
Dispositif de prélèvement de salive
RÉF DKO063
Salivette Sarstedt
RÉF 51.1534.500
Remarques
Conserver tous les réactifs à 2÷8°C, à l'abri de la
lumière.
N'ouvrir le sachet du Réactif 5 (Microplaque Coatée)
qu'après l'avoir ramené à température ambiante et
refermez-le tout de suite après avoir prélevé les
bandes à utiliser; une fois ouvert, il est stable
jusqu'à la date d'échéance du coffret.
Éviter de détacher la feuille adhésive des bandes
qui ne sont pas utilisées pendant l'analyse en cours.
4. AVERTISSEMENTS
• Ce coffret est exclusivement pour usage in vitro et
l'essai doit être exécuté par un personnel expert.
• Utilisez les dispositifs de protection individuelle
prévus pendant toute opération avec les réactifs
fournis.
• Certains réactifs contiennent de petites quantités
R
de Proclin 300 comme conservateur. Eviter tout
contact avec peau et les muqueuses.
• Le Chromogène TMB contient un irritant qui peut
être nocif si inhalé, ingéré ou absorbé à travers la
peau. Pour empêcher des lésions, éviter toute
inhalation ou ingestion par la peau ou les yeux et
tout contact cutané ou oculaire.
• La solution d'arrêt est constituée d'une solution
d'acide sulfurique dilué. L'acide sulfurique est
poison et corrosif et peut être toxique s'il est
ingéré. Pour prévenir toute brûlure chimique
possible, éviter le contact avec la peau et les yeux.
• Éviter l'exposition du réactif TMB/H2O2 à la lumière
directe du soleil, aux métaux et aux substances
oxydantes. Ne pas congeler la solution.
• Cette méthode permet de déterminer des
concentrations d'œ striol de 2,5 à 4000 pg/mL.
• L'administration de stéroïdes naturels ou
synthétiques peut altérer les taux salivaires
d'œ striol.
5. PRÉCAUTIONS D'USAGE
• Observer rigoureusement l'ordre des passages
indiqué dans le présent protocole.
• Tous les réactifs doivent être conservés à une
température contrôlée de 2-8°C dans leurs
conteneurs originaux. Les exceptions sont
clairement marqués.
• Avant usage, laisser reposer tous les éléments
des coffrets et les échantillons à température
ambiante (22-28°C) et mélanger avec soin.
• Ne pas échanger des éléments du coffret
provenant de lots différents. Les dates d'échéance
rapportées sur les étiquettes des récipients
d'expédition et sur celles de tous les ampoules
doivent être observées. Ne pas utiliser d'éléments
au-delà de leur date d'échéance.
• Si vous utilisez des équipements automatisés est
de la responsabilité de l'utilisateur de s'assurer
que le kit a été correctement validées.
• Un lavage incomplet ou peu soigné et une
aspiration insuffisante du liquide dans les puits des
tests ELISA peuvent provoquer un manque de
précision et/ou un arrière-plan élevé.
• Il est important de maintenir constants les temps
de réaction dans chaque puits afin d'obtenir les
•
•
•
•
•
résultats susceptibles d'être répétés. Le pipetage
des échantillons ne doit pas durer plus de 10
minutes afin d'éviter tout résultat incorrect. S'il se
prolonge au-delà des 10 minutes, il est
recommandé de suivre l'ordre de distribution. Si
vous devez utiliser plus d’
une microplaque, il est
conseillé de répéter la courbe dose-réponse.
L’
ajout de la solution de substrat donne lieu à une
réaction cinétique qui est interrompue par l'ajout
de la solution de blocage. Par conséquent, il est
nécessaire d'ajouter le substrat et la solution
bloquante dans la séquence même afin d'éliminer
toute variation temporelle pendant la réaction.
Observer les instructions relatives à l'exécution du
contrôle de qualité dans les laboratoires cliniques
en testant les contrôles et/ou les groupes de
sérum.
Observer la plus grande précision dans la
reconstitution et la distribution des réactifs.
Ne
pas
utiliser
des
échantillons
microbiologiquement
contaminés
ou
des
échantillons hautement lipémiques ou hémolysés.
Les lecteurs de microplaques mesurent dans le
sens vertical. Ne pas toucher le fond des puits.
6. PROCÉDURE
6.1. Préparation des étalons (S0… .S5)
Avant utilisation, laisser sur l'agitateur rotatif pendant
au moins 5 minutes.
Les concentrations suivantes d'œ striol correspondent
aux étalons :
S0
S1
S2
S3
S4
S5
pg/mL
0
2,5
15
100
600
4000
Stables 6 mois à 2÷8 °C à compter de l'ouverture des
flacons.
Pour Unites SI : pg/mL x 3,5 = pmol/L
6.2. Préparation de la solution de lavage
Avant l'usage, diluer le contenu de chaque flacon de
solution de lavage concentrée et tamponnée (50x)
avec de l'eau distillée jusqu'à un volume de 1000 mL.
Pour préparer des volumes moindres, respecter le
rapport de dilution de 1:50. La solution de lavage
diluée est stable à 2÷8°C pendant au moins 30 jours.
6.3. Préparation du conjugué dilué
Préparer immédiatement avant l'usage.
Diluer 10 μL de Conjugué (réactif 4) à 1 mL de
Tampon d'incubation (réactif 3).
Mettre à agiter délicatement sur un agitateur rotatif.
Stables pendant 3 heures à température ambiante
(22÷28°C).
6.4. Préparation de l'échantillon
Ce kit permet la détermination de œ striol dans les
échantillons de salive.
Il est conseillé, pour le prélèvement de l'échantillon,
d'utiliser les tubes des Dispositifs de prélèvement de
salive Diametra ou des Salivette Sarstedt (RÉF.
51.1534.500).
6.4.1. Méthode et limites
Recueillir les échantillons de salive dans les temps
prescrits. Pour une meilleure reproductibilité et
précision, il est conseillé de prélever au moins 3
échantillons dans un intervalle de temps non
inférieur à 2 heures et de constituer un pool avec
ces spécimens avant de les tester.
En l'absence d'indications spécifiques aux fins du
prélèvement de la salive, il est possible de recueillir
les échantillons à tout moment en tenant toutefois
en compte les facteurs suivants :
a) Si le prélèvement de la salive doit être effectué
le matin, il faut le faire avant de se laver les
dents.
b) Pendant la journée, attendre au moins une
heure après avoir mangé ou bu avant de
recueillir les échantillons de salive.
c) Il est très important d'obtenir un échantillon
liquide – non contaminé par la nourriture, des
produits cosmétiques, du sang, du chewinggum ou d'autres matières étrangères.
6.4.2. Traitement de la salive
A) Dispositif de prélèvement de salive
Diametra
Faire passer la salive à travers la paille et jusque
dans l'éprouvette en verre.
1) Centrifuger l'échantillon pendant 15 minutes à
3000 t/min.
2) Le déposer à –20°C pendant au moins 1 heure.
3) Décongeler l'échantillon.
4) Centrifuger encore pendant 15 minutes à 3000
t/min.
5) L'échantillon de salive est alors près pour être
testé.
6) Conserver l'échantillon à 2÷8°C pendant une
semaine ou à –20°C pendant une période de
temps plus longue.
B) Salivette Sarstedt (voir ifu)
6.5. Procédure
Puisqu'il faut opérer en double, préparer deux puits
pour chaque point de la courbe d'étalonnage (S0-S5),
deux pour chaque contrôle, deux pour chaque
échantillon et un pour le blanc.
Réactif
Étalon/
contrôle
Échantillon
Échantillon
Blanc
50 µL
Étalon S0-S5,
Contrôle L-M
50 µL
Conjugué dilué
100 µL
100 µL
Laisser incuber 1h à température ambiante
(22÷28°C).
Retirer le contenu de chaque puits, laver les puits
trois fois avec 300 µL de solution de lavage diluée.
Substrat TMB
100 µL
100 µL
100 µL
Laisser incuber 15 minutes à température ambiante
(22÷28°C), à l'abri de la lumière.
Solution
d'arrêt
100 µL
100 µL
100 µL
Agiter doucement la microplaque.
Lire l'absorbance (E) à 450 nm en mettant à zéro
avec le blanc.
7. CONTRÔLE DE QUALITÉ
Chaque laboratoire devrait analyser les échantillons
dans la gamme des niveaux élevés, normaux et bas
d'œ striol pour vérifier les prestations de l'analyse. Ces
échantillons devraient être traités comme inconnus et
les valeurs déterminées devraient être dans chaque
test effectué. Les tableaux de contrôle de la qualité
devraient être observés afin de suivre les prestations
des réactifs fournis. Des méthodes statistiques
appropriées devraient être employées pour vérifier la
tendance. Le laboratoire devrait définir des limites
d'acceptabilité des prestations d'analyse. Les autres
paramètres qui devraient être contrôlés incluent les
interceptions de 80, 50 et 20% de la courbe
d'étalonnage pour évaluer la reproductibilité. De plus,
la capacité d'absorption maximale devrait être
constante avec l'expérience précédente. La déviation
significative par rapport aux prestations établies peut
indiquer un changement non observé des états ou
une dégradation expérimentale des réactifs du
coffret. Des réactifs frais doivent être utilisés pour
déterminer le motif des variations.
7.1. Interprétation des résultats
Si un ordinateur a été utilisé pour calculer les
résultats, il faut impérativement que les valeurs des
calibrateurs
tombent
dans
les
10%
des
concentrations assignées.
8. RÉSULTATS
8.1. Extinction moyenne
Calculer l'extinction moyenne (Em) de chaque point
de la courbe d'étalonnage (S0–S5) et de chaque
échantillon.
8.2. Courbe d'étalonnage
Sur un graphique des valeurs d'absorbance, tracer
les valeurs calculées des extinctions moyennes (Em)
de chaque étalon (S0–S5) en fonction des
concentrations. Tracer la meilleur courbe passant par
les points d'étalonnage (par ex. : logistique à quatre
paramètres).
8.3. Calcul des résultats
Sur le graphique, faire une interpolation des valeurs
d'absorbance relatives à chaque échantillon et en lire
la concentration correspondante en pg/mL.
9. VALEURS DE RÉFÉRENCE
Du fait que les valeurs d'œ striol salive ont un rythme
circadien, nous suggérons de recueillir les
échantillons à la même heure (8 h A.M.).
Les valeurs suivantes peuvent servir d'indication
préliminaire jusqu'à ce que chaque laboratoire
établisse sa propre fourchette de valeurs normales :
Groupe
Heure
N
Femmes
Pré-ménopause
8 AM
5 AM
21
21
Semaine de grossesse
22°
24°
26°
28°
30°
32°
34°
36°
37°
38°
39°
40°
Fourchette
+/- SD
(pg/mL)
0 - 21.0
0 - 6.8
Fourchette
absolue
(pg/mL)
0 - 32.0
0 - 8.9
Salive (pg/mL)
(700 ± 500)
(900 ± 600)
(1200 ± 700)
(1500 ± 800)
(1800 ± 800)
(2200 ± 1100)
(3200 ± 1300)
(4100 ± 1600)
(4500 ± 1700)
(5000 ± 2000)
(5300 ± 2000)
(5700 ± 2000)
10. PARAMÈTRES CARACTÉRISTIQUES
10.1. Précision
10.1.1. Intra-essai
La variabilité à l'intérieur du même coffret a été
déterminée en répliquant (16x) la mesure de deux
contrôles salivaires différents. La variabilité intraessai est ≤ 9,7%.
10.1.2. Inter-essai
La variabilité entre coffrets différents a été
déterminée en répliquant (10x) la mesure de deux
sérums de contrôle différents avec des coffrets
appartenant à des lots différents. La variabilité interessai est ≤ 13,7%.
10.2. Exactitude
L'épreuve de récupération conduite sur un échantillon
de salive enrichi avec 50 – 300 – 2000 pg/mL d'œ striol
a donné une valeur moyenne (±SD) de 100,6% ±
14,6%.
10.3. Sensibilité
La concentration minimale d'œ striol mesurable qui
pouvant être distinguées par l'étalon zéro est de 1,0
pg/mL avec une limite de confiance de 95%.
10.4. Spécificité
L'anticorps employé présente les réactions croisées
suivantes, calculées à 50% selon Abraham :
Πstriol salive
16 épi-œ striol
15 α-OH-œ striol
Πstriol 3-sulfate
Πstradiol
17 épi-œ striol
Œ striol 3α-glucoronate
Œ striol 16α-glucoronate
Prednisone
Estrone
100 %
10,5 %
7,0 %
2,0 %
0,1 %
-2
< 1x10 %
-2
< 1x10 %
-2
< 1x10 %
-2
< 1x10 %
-4
< 1x10 %
10.5. Corrélation
Le coffret d'œ striol salive (Diametra) a été comparé à
un coffret disponible en commerce. 30 échantillons
de salive ont été testés. La courbe de régression est :
y = 1,03x + 0,68
2
r = 0,988
y = Coffret Diametra Elisa pou l'œ striol salive
x = Coffret Salimetrics Elisa pou l'œ striol salive
11. DISPOSITIONS RELATIVES À L'ÉLIMINATION
DES DÉCHETS
Les réactifs doivent être jetés conformément aux lois
en vigueur.
BIBLIOGRAPHIE
1. Fisher-Rasmussen W., et al Acta Obstet.
Gynecol Scand 60: 417 -420 (1981)
2. Truran, P. L., et al Clin. Chem. 28/12, 2393
(1982)
3. Vining R.F., et al J. Clin. Endoc. Metab. 56,454
(1983)
4. Bagger P.V., et al Acta Obstet Gynec Scand
60:187 (1981)
5. Osterman, T. M., et al Clin. Chem. 25 (5) 716
(1979)
6. Wisdom, G.B.Clin Chem. 22 (8) 1243-1255
(1976)
Éd. 10/2011
DCM026-10
DiaMetra S.r.l. - Siège social : Via Garibaldi, 18 –
20090 SEGRATE (MI) Italie
Tél. 0039-02-2139184 – 02-26921595
Fax 0039–02–2133354
Fabricant : Via Giustozzi 35/35a – Z.I. Paciana –
06034 FOLIGNO (PG) Italie
Tél. 0039–0762–24851
Fax 0039–0762–316197
Courriel : info@diametra.com
DIA.METRA SRL
Mod. PIS
IT
NOTICE D'INFORMATION
Spiegazione dei simboli
DE
Verwendete Symbole
RÉF
yyyy-mm-dd
Σ = xx
Max
Min
GB
Explanation of symbols
FR
ES
Explication des symboles
Significado de los simbolos
PT
Explicaçao dos simbolos
DE
ES
FR
GB
IT
PT
In vitro Diagnostikum
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Dispositif médical de diagnostic in vitro
In vitro Diagnostic Medical Device
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Dispositivos medicos de diagnostico in vitro
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Hergestellt von
Elaborado por
Fabriqué par
Manufacturer
Produttore
Produzido por
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Bestellnummer
Nûmero de catálogo
Références du catalogue
Catalogue number
Numero di Catalogo
Número do catálogo
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Herstellungs datum
Fecha de fabricacion
Date de fabrication
Date of manufacture
Data di produzione
Data de produção
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Verwendbar bis
Establa hasta (usar antes de último día del mes)
Utiliser avant (dernier jour du mois indiqué)
Use by (last day of the month)
Utilizzare prima del (ultimo giorno del mese)
Utilizar (antes ultimo dia do mês)
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Biogefährdung
Riesgo biológico
Risque biologique
Biological risk
Rischio biologico
Risco biológico
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Gebrauchsanweisung beachten
Consultar las instrucciones
Consulter le mode d’emploi
Consult instructions for use
Consultare le istruzioni per l’uso
Consultar instruções para uso
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Chargenbezeichnung
Codigo de lote
Numéro de lot
Batch code
Codice del lotto
Codigo do lote
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Ausreichend für “n”Tests
Contenido suficiente para ”n”tests
Contenu suffisant pour “n”tests
Contains sufficient for “n”tests
Contenuto sufficiente per “n”saggi
Contém o suficiente para “n”testes
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Inhalt
Contenido del estuche
Contenu du coffret
Contents of kit
Contenuto del kit
Conteúdo do kit
DE
ES
FR
GB
IT
PT
Temperaturbereich
Límitaciôn de temperatura
Limites de température de conservation
Temperature limitation
Limiti di temperatura
Temperaturas limites de conservação
yyyy-mm
Cont.
DIA.METRA SRL
Mod. PIS
NOTICE D'INFORMATION
SUGGESTIONS POUR LA RÉSOLUTION DES PROBLÈMES / DÉPANNAGE
ERREUR CAUSES POSSIBLES / SUGGESTIONS
Aucune réaction colorimétrique du dosage
- non distribution du conjugué
- contamination du conjugué et/ou du substrat
- erreurs dans l'exécution du dosage (par ex., distribution accidentelle des réactifs dans le mauvais ordre ou en
provenance des mauvais flacons, etc.)
Réaction trop faible (DO trop basse)
- conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original)
- temps d'incubation trop court, température d'incubation trop basse
Réaction trop intense (DO trop élevée)
- conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original)
- temps d'incubation trop long, température d'incubation trop élevée
- mauvaise qualité de l'eau utilisée pour la solution de lavage (bas degré de déionisation)
- lavages insuffisants (conjugué non entièrement aspiré)
Valeurs inexplicablement hors plage
- contamination des pipettes, embouts ou récipients - lavages insuffisants (conjugué non entièrement aspiré)
CV% intra-essai élevé
- les réactifs et/ou les bandes n'ont pas atteint la température ambiante avant usage
- le dispositif de lavage pour microplaques ne lave pas correctement (suggestion : nettoyer la tête du dispositif de
lavage)
CV% inter-essai élevé
- conditions d'incubation non constantes (temps ou température)
- contrôles et échantillons non distribués en même temps (avec les mêmes intervalles) (contrôler l'ordre de
distribution)
- variabilité intrinsèque des opérateurs
">