MODE D'EMPLOI – MILIEUX
EN BOITES DE PETRI
PRETS A L'EMPLOI
PA-254430.02
Rev.: June 2003
BD Helicobacter Agar, Modified
APPLICATION
La BD Helicobacter Agar, Modified (gélose d'Helicobacter modifiée) est un milieu sélectif
servant à l'isolement de la bactérie Helicobacter pylori à partir d'échantillons gastriques.
PRINCIPES ET EXPLICATION DE LA METHODE
Méthode microbiologique.
Isolée pour la première fois en 1982 par Marshall et Warren, la bactérie Helicobacter pylori a été
identifiée comme étant un agent infectieux majeur, responsable de gastrites chroniques,
d'ulcères duodénaux et gastroduodénaux et de certains types de cancers de l'estomac.1,2 Même
si le diagnostic s'appuie souvent sur des tests sérologiques visant à détecter la présence
d'anticorps contre ce microorganisme ou sur des tests rapides permettant de mettre en évidence
une activité anormale de l'uréase, la mise en culture est indispensable pour détecter une
infection précoce en l'absence de réponse d'anticorps. La culture permet également de
déterminer le profil de sensibilité aux antimicrobiens des souches individuelles. Différents
milieux ont été utilisés pour l'isolement de ce microorganisme qui, s'il n'est pas très exigeant, est
très sensible à l'oxygène car c'est un microaérophile, et nécessite une période d'incubation de 3
à 5 jours.3
La BD Helicobacter Agar, Modified est préparée sur une base de Columbia Agar. La
combinaison antimicrobienne correspond à la formulation décrite par Dent et McNulty, qui
contient des mélanges de vancomycine, d'amphotéricine B, de triméthoprime et de cefsulodine
pour inhiber les flores contaminantes sans perte de récupération des bactéries H. pylori.4 Sur la
proposition de l'équipe de Stevenson, la concentration de cefsulodine a été augmentée afin de
renforcer l'effet inhibiteur des flores contaminantes.5 Grâce à l'ajout de sang de cheval lysé,
l'apport en nutriments est augmenté.
REACTIFS
BD Helicobacter Agar, Modified
Formule* par litre d'eau purifiée
Digestion pancréatique de
12,0 g
Gélose
caséine
Digestion peptique de tissu
5,0
Vancomycine
animal
Extrait de levure
3,0
Amphotéricine B
Extrait de bœuf
3,0
Triméthoprime
Fécule de maïs
1,0
Cefsulodine
Chlorure de sodium
5,0
Sang de cheval lysé
pH 7,3 ± 0,2
*Ajustée et/ou complémentée en fonction des critères de performances imposés.
13,5 g
0,01
0,005
0,02
0,01
7%
PRECAUTIONS
. A usage professionnel uniquement.
Ne pas utiliser les boîtes si elles présentent des signes de contamination microbienne,
décoloration ou dessiccation, ou d'autres signes de détérioration.
Consulter le document « MODE D'EMPLOI GENERAL » pour connaître les procédures de
manipulation aseptique, les risques biologiques, ainsi que les méthodes d'élimination des
produits utilisés.
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STOCKAGE ET DUREE DE CONSERVATION
Dès réception, conserver les boîtes de Pétri dans l'obscurité entre 2 et 8 °C dans leur
emballage d'origine, jusqu'au moment de leur utilisation. Ne pas les congeler ni les surchauffer.
Les boîtes peuvent être ensemencées jusqu'à leur date de péremption (voir étiquette sur
l'emballage) et incubées pendant le délai d'incubation recommandé.
Des boîtes provenant d’une pile ouverte de 10 boîtes sont utilisables pour une semaine
lorsqu’elles sont conservées entre +2 et +8 °C dans un endroit propre.
CONTROLE DE QUALITE PAR L'UTILISATEUR
Ensemencer les échantillons représentatifs avec les souches ci-dessous (pour plus
d'informations, voir le document « MODE D'EMPLOI GENERAL »). Incuber à une température
comprise entre 35 et 37 °C en atmosphère microaérobie, p. ex. dans un récipient BD GasPak
avec une atmosphère obtenue via le système BD CampyPak (avec catalyseur) ou le système
BD CampyPak Plus, pendant 3 à 5 jours.
Souches
Helicobacter pylori ATCC 43504
Croissance
Croissance bonne à importante ; colonies de taille
minuscule à moyenne, transparentes
Candida albicans ATCC 10231
Inhibition partielle à complète
Escherichia coli ATCC 25922
Inhibition partielle à complète
Proteus mirabilis ATCC 43071
Inhibition partielle à complète, essaimage inhibé
Staphylococcus aureus ATCC 29213 Inhibition complète
Non ensemencée
Colonies de couleur bordeaux, légèrement
transparente
METHODE
Matériaux fournis
BD Helicobacter Agar, Modified (boîtes de Pétri Stacker de 90 mm). Produit soumis à
contrôle microbiologique.
Matériaux non fournis
Milieux de culture auxiliaires, réactifs et matériel de laboratoire requis.
Types, prélèvement et transport des échantillons
Prélever sur le patient plusieurs échantillons frais de biopsie gastrique, dont au moins en
provenance de l'antre pylorique et un du corps de l'estomac, et les placer dans un milieu de
transport adapté. Le suc gastrique ne convient pas. Si l'échantillon peut être transporté et traité
sans délai, l'utilisation d'une solution saline physiologique est possible. Si un certain délai est
prévisible, il faut impérativement utiliser un milieu de transport tel que le milieu de Stuart ou le
BD Port-A-Cul maintenu à une température comprise entre 4 et 8 °C et traiter les échantillons
sous 24 h. Ce microorganisme est très sensible au dessèchement et à l'exposition à l'oxygène.6
Des recherches ont prouvé que l'ajout de glycérol dans le milieu de transport utilisé accroît sa
viabilité, à condition que le milieu soit réfrigéré (à +4 °C par exemple) ou congelé.7
Mode opératoire du test
La surface de la gélose doit avoir un aspect lisse et humide, mais sans excès. Ne pas utiliser les
boîtes de Pétri présentant des signes de dessèchement, et notamment de contraction du milieu.
Lors de la manipulation des échantillons et des cultures, éviter toute exposition prolongée à l'air
car ce microorganisme est très sensible à l'oxygène.6
Broyer ou hacher les échantillons obtenus lors de la biopsie dans une petite quantité de solution
saline physiologique stérile avant de les placer dans le milieu. L'homogénat doit immédiatement
être placé à la surface du milieu, recueilli à l'aide de l'anse à ensemencer, puis strié sur la
surface via la méthode d'isolement par striation. Un milieu non sélectif tel que la BD Columbia
Agar with 5% Horse Blood ou la BD Chocolate Agar (GC Agar with IsoVitaleX) doit être
ensemencé avec la BD Helicobacter Agar, Modified pour que la récupération des pathogènes
présents soit complète.
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Incuber les boîtes de Pétri ensemencées pendant 3 à 5 jours à 35 ± 2 °C en atmosphère
microaérobie, p. ex. dans un récipient BD GasPak avec une atmosphère obtenue via le système
BD CampyPak (avec un catalyseur) ou le système BD CampyPak Plus.
Résultats
Après l'incubation, les boîtes de Pétri doivent présenter des colonies isolées dans les zones où
l'inoculum a été correctement dilué. Les colonies d'Helicobacter pylori ont une taille petite à
moyenne et un aspect transparent.
La réalisation d'une coloration de Gram sur les colonies correspondantes révèle la présence de
bâtonnets Gram négatifs légèrement courbes. Une réaction positive rapide aux tests d'uréase,
d'oxidase et de catalase effectués directement sur la croissance issue de la boîte de Pétri
d'isolement (à condition que cette croissance soit suffisante) révèle la présence d'H. pylori.
L'identification définitive doit s'appuyer sur des tests biochimiques appropriés.6 Eviter tout délai
pendant la manipulation de la culture car la majorité des souches d'Heliobacter pylori ne
résistent pas à une exposition à l'air d'une durée supérieure à 30 à 45 min.6 Repiquer
immédiatement sur des milieux non sélectifs appropriés (voir Mode opératoire du test) et
incuber comme décrit ci-dessus.
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES ET LIMITES DE LA PROCEDURE
La BD Helicobacter Agar, Modified est un milieu servant à l'isolement de la bactérie
Helicobacter pylori à partir d'échantillons gastriques humains. 5,6
Des bactéries autres que l'Helicobacter pylori peuvent se développer dans ce milieu. Il peut
s'agir notamment d'Helicobacter spp. autres que H. pylori ou de contaminants issus des flores
normales.
La croissance issue de ce milieu doit faire l'objet d'une différenciation supplémentaire, au moyen
de tests biochimiques, morphologiques ou moléculaires. Ne pas appliquer d'échantillons fécaux
à la BD Helicobacter Agar, Modified, car ce milieu n'est pas assez sélectif pour éliminer les
flores intestinales.
Ce milieu n'a pas subi de tests visant à déterminer la croissance de Helicobacter spp. autres
que H. pylori.
REFERENCES
1. Warren, J.R., and B.J. Marshall. 1983. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in
active chronic gastritis. Lancet i: 1273-1275.
2. National Institutes of Health. 1994. NIH Consensus Conference. Helicobacter pylori in peptic
ulcer disease. NIH Consensus Development Panel on Helicobacter pylori in peptic ulcer
disease. JAMA 272: 65-69.
3. Goodwin, C.S., and J.A. Armstrong. 1990. Microbiological aspects of Helicobacter pylori
(Campylobacter pylori). Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 9: 1-13.
4. Dent, J.C., and C.A.M. McNulty. 1988. Evaluation of a new selective medium for
Campylobacter pylori. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 7: 555-568.
5. Stevenson, T.H., L.M. Lucia, and G.R. Acuff. 2000. Development of a selective medium for
isolation of Helicobacter pylori from cattle and beef samples. Appl. Environ. Microbiol. 66:
723-727.
6. Jerris, R.C. 1995. Helicobacter. In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover,
and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for
Microbiology, Washington, D.C.
7. Han, S.W., et al. 1995. Transport and storage of Helicobacter pylori from gastric mucosal
biopsies and clinical isolates. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 14: 349-352.
CONDITIONNEMENT
BD Helicobacter Agar, Modified
No réf. 254430
Milieux en boîtes de Pétri prêts à l'emploi, 20 unités
PA-254430.02
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INFORMATIONS COMPLEMENTAIRES
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BD Diagnostic Systems
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