Macherey-Nagel NucleoSpin 96 Virus, 96-well kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Bioanalysis
Biologie
Moléculaire
User manual
Manuel
d’utilisation
Extraction d’ARN / ADN viral
n NucleoSpin® 96 Virus
n NucleoSpin® 96 Virus Core Kit
Juin 2022 / Rev. 08
www.mn-net.com
www.mn-net.com
Contact MN
Germany and international
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.:
+49 24 21 969-0
Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only)
E-mail: info@mn-net.com
Technical Support Bioanalysis
Tel.:
+49 24 21 969-270
E-mail: tech-bio@mn-net.com
USA
MACHEREY-NAGEL Inc.
924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA
Toll-free: 888 321 6224 (MACH)
E-mail: sales-us@mn-net.com
France
MACHEREY-NAGEL SAS
1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France
Tel.:
+33 388 68 22 68
E-mail: sales-fr@mn-net.com
MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 €
Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531
Switzerland
MACHEREY-NAGEL AG
Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland
Tel.:
+41 62 388 55 00
E-mail: sales-ch@mn-net.com
www.mn-net.com
Extraction d’ARN / ADN viral
Sommaire
1 Composition
4
1.1 Composants des kits
4
1.2 Réactifs et équipement nécessaires
5
1.3 A propos de ce manuel d’utilisation
6
2 Description des kits
7
2.1 Principe général
7
2.2 Caractéristiques du kit
8
2.3 Equipement nécessaire
9
2.4 Accessoires recommandés pour les kits NucleoSpin® 96 Virus Core Kit
10
2.5 Automatisation de la procédure sur les plateformes robotiques
12
2.6 Echantillons biologiques
12
2.7 ARN carrier
13
2.8 Procédures d’élution
14
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
15
4 Instructions de sécurité
17
4.1 Elimination des déchets
5 Protocoles
17
18
5.1 NucleoSpin® 96 Virus – procédure par centrifugation
18
5.2 NucleoSpin® 96 Virus (Core Kit) – procédure sur système d’aspiration
23
6 Annexes
29
6.1 Optimisation des performances
29
6.2 Informations de commande
30
6.3 Restriction d’utilisation / garantie
31
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
3
Extraction d’ARN / ADN viral
1
Composition
1.1
Composants des kits
NucleoSpin® 96 Virus
REF
2 x 96 preps
740691.2
4 x 96 preps
740691.4
Tampon de lyse RAV1 1
3 x 40 mL
6 x 40 mL
Tampon de lavage RAW
2 x 75 mL
300 mL
Tampon de lavage RAV3
(Concentré)1
100 mL
2 x 100 mL
H2O RNase-free
125 mL
125 mL
Tampon d’élution RE
125 mL
125 mL
ARN carrier (lyophilisé)1
3 x 1 mg
6 x 1 mg
Protéinase K (lyophilisée)¹
2 x 50 mg
3 x 75 mg
Tampon de Protéinase PB
8 mL
15 mL
Plaques NucleoSpin® 96 Virus
(bagues bleues)
2
4
Plaques ’MN Wash Plates4’
2
4
Blocs 96 puits ronds avec barrettes
de bouchons
2
4
Barrettes de bouchons
24
48
Blocs 96 puits carrés ’MN’
6
12
Rack de barrettes de 8 tubes3
2
4
Films adhésifs en PE
10
20
Manuel d’utilisation
1
1
2
1
Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3.
2
Tampon d’élution RE : Tris/HCl 5 mM, pH 8.5.
3
Set de 1 rack avec 12 barrettes de 8 tubes chacune et barrettes de bouchons incluses.
4
Utilisation sous vide ou à pression positive uniquement.
4
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
Extraction d’ARN / ADN viral
Composants des kits (suite)
NucleoSpin® 96 Virus Core Kit
REF
4 x 96 preps
740452.4
Tampon de lyse RAV1 1
6 x 40 mL
Tampon de lavage RAW
300 mL
Tampon de lavage RAV3
(Concentré)1
2 x 100 mL
H2O RNase-free
125 mL
Tampon d’élution RE
2
125 mL
ARN carrier (lyophilisé)1
®
6 x 1 mg
Plaques NucleoSpin 96 Virus
(bagues bleues)
4
Manuel d’utilisation
1
1.2
Réactifs et équipement nécessaires
Réactif
•
Ethanol 96 – 100 % (pour la préparation des réactifs; voir chapitre 3)
Pour des informations détaillées concernant le matériel requis en fonction de la
procédure choisie, par centrifugation, sur système d’aspiration ou encore sur système
de pression positive, voir le paragraphe 2.3.
Pour
les
accessoires
recommandés
lors
de
l’utilisation
des
kits
NucleoSpin® 96 Virus Core Kit (kits de composition réduite; REF 740452.4), voir le
paragraphe 2.4.
1
Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3.
2
Tampon d’élution RE : Tris/HCl 5 mM, pH 8.5.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
5
Extraction d’ARN / ADN viral
1.3
A propos de ce manuel d’utilisation
Nous recommandons vivement aux nouveaux utilisateurs de consulter le protocole
détaillé des kits NucleoSpin® 96 Virus ou NucleoSpin® 96 Virus Core avant la
première utilisation.
Les utilisateurs expérimentés pourront se référer au résumé du protocole, conçu pour
un suivi rapide de la succession des étapes de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible en ligne: www.mn‑net.com.
Merci de contacter notre support technique à propos de toute mise à jour de ce manuel
par rapport aux versions antérieures.
6
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
Extraction d’ARN / ADN viral
2
Description des kits
2.1
Principe général
Le kit NucleoSpin® 96 Virus est conçu pour la purification simultanée de l’ARN et de
l’ADN viral. Le kit associe la sélectivité de la technologie membrane de silice pour
la fixation des acides nucléiques et le format ’haut débit’ 96 puits. Selon la méthode
utilisée avec le kit NucleoSpin® 96 Virus, les ARN viraux sont lysés rapidement et
efficacement avec le Tampon de lyse RAV1, fortement concentré en GITC. Les virus
à ADN (par exemple: HBV) sont souvent plus difficiles à extraire et nécessite une
digestion des échantillons avec la Protéinase K incluse dans le kit. Le Tampon de
lyse et l’éthanol permettent de créer les conditions de fixation adéquates des acides
nucléiques à la membrane de silice de la plaque NucleoSpin® Virus. L’ARN carrier
contenu dans le Tampon de lyse RAV1 améliore la fixation et le rendement d’extraction à
partir des échantillons faiblement titrés en ARN/ADN viral. Les contaminants (potentiels
inhibiteurs de PCR), comme les sels, les métabolites et les composants cellulaires
macromoléculaires solubilisés sont éliminés lors des étapes de lavages avec les
tampons éthanoliques RAW et RAV3. Les acides nucléiques viraux purifiés peuvent
être élués dans un tampon faiblement salin ou dans de l’eau exempte de RNase et sont
directement utilisables pour les applications de RT-PCR ou de PCR.
Choix du kit NucleoSpin® 8/96 Virus
Le NucleoSpin® 96 Virus permet la purification de 96 échantillons en parallèle. Ce kit
est originellement conçu pour une utilisation par centrifugation; l’utilisation sur système
d’aspiration ou de pression positive est également possible. L’utilisation du kit sur
une plateforme robotisée de pipetage (équipée de chambre à vide le plus souvent)
nécessite une flexibilité dans les différents types de consommables utilisés pour la
lyse, les lavages et l’élution. MACHEREY‑NAGEL répond à ce besoin en proposant
les kits NucleoSpin® 96 Virus Core Kit, recommandé pour l’utilisation manuelle ou
automatisée sur système d’aspiration ou de pression positive. Les ’Core kits’ contiennent
les composants essentiels comme les plaques de purification 96 puits, les tampons,
mais ne comprennent pas les consommables plastiques ou les enzymes. Il est ainsi
possible de les compléter en définissant les consommables les plus adaptés aux
besoins et contraintes de l’utilisateur parmi les divers accessoires proposés dans notre
catalogue. Pour un débit d’extraction plus faible, les kits NucleoSpin® 96 Virus sont
également proposés au format ’barrettes de 8-puits’ (voir ’Informations de commande’).
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
7
Extraction d’ARN / ADN viral
Table 1: Guide de sélection du kit
Utilisation manuelle,
par centrifugation
Application
Kits recommandés
Faible / ​moyen débit
Haut débit
NucleoSpin® 8 Virus*
NucleoSpin® 96 Virus
Utilisation manuelle,
Faible / ​moyen débit
système d’aspiration ou
de pression positive
Haut débit
NucleoSpin® 8 Virus*
NucleoSpin® 8 Virus Core Kit
Utilisation automatisée, Faible / ​moyen débit
système d’aspiration ou Haut débit
de pression positive
NucleoSpin® 8 Virus Core Kit*
NucleoSpin® 96 Virus Core Kit
2.2
NucleoSpin® 96 Virus
NucleoSpin® 96 Virus Core Kit
Caractéristiques du kit
•
NucleoSpin® 96 Virus permet la purification simultanée d’ADN et d’ARN viral
à partir de 100 – 150 μL de plasma, de sérum ou d’autres fluides biologiques
acellulaires. Les échantillons peuvent être utilisés frais ou congelés. Par ailleurs,
les surnageants clarifiés issus de suspensions de tissus, d’échantillons de fèces,
d’écouvillons ou encore les échantillons de sang dilué peuvent être également
utilisés. Pour des informations concernant le prétraitement des échantillons, merci
de consulter le paragraphe 2.6.
•
Les acides nucléiques purifiés sont utilisables pour les applications de PCR/RTPCR en temps réel, la PCR ou tout autre type de réaction enzymatique. La limite
de détection pour certains virus dépend de la méthode de détection utilisée, par
exemple la (RT-)PCR nichée. L’utilisation d’un contrôle interne d’extraction, ainsi
que de contrôles positifs et négatifs d’extraction permettent de vérifier le bon
déroulement de la procédure de purification, d’amplification et de détection des
acides nucléiques viraux ciblés.
•
NucleoSpin® 96 Virus Core Kit est conçu à l’origine pour la procédure sur
système d’aspiration ou de pression positive (manuelle ou automatisée sur
plateforme robotique). L’utilisation sur système d’aspiration ou de pression positive
permet une automatisation facile sur les instruments de pipetage automatisés
courants. Pour plus d’informations concernant l’automatisation et la disponibilité
de scripts prêt-à-l’emploi, disponibles pour certaines plateformes, voir le
paragraphe 2.5 et contacter votre distributeur local ou MN directement.
* Consulter le manuel d'utilisation NucleoSpin® 8 Virus. Voir paragraphe 6.2 pour les informations de commande.
8
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
Extraction d’ARN / ADN viral
Table 2: Résumé des caractéristiques du kit
Paramètre
NucleoSpin® 96 Virus (Core Kit)
Technologie
membrane de silice
Format
Plaques 96 puits
Procédure
Manuelle ou automatisée, système d’aspiration, de
pression positive ou par centrifugation
Volume d’échantillon
100 – 150 μL*
Rendement d’extraction > 90 %
Limite de détection
30 – 60 cp/mL
Volume d’élution
70 – 100 μL
Durée de la procédure
60 min/plaque
Capacité de fixation
40 μg
2.3
Equipement nécessaire
Procédure par centrifugation
Pour la procédure par centrifugation, une centrifugeuse pour microplaques, capable
de recevoir les plaques NucleoSpin® Virus positionnées sur un bloc 96 puits ronds
ou carrés, et capable d’atteindre une accélération de 5,600 – 6,000 x g est requise
(hauteur minimale nécessaire dans les nacelles: 85 mm).
Procédure sur système d’aspiration
Bien que le kit NucleoSpin® 96 Virus soit originellement conçu pour une utilisation par
centrifugation, l’utilisation sur système d’aspiration est également possible. Le volume
mort de la membrane de silice lors de l’élution est plus élevé que lors de l’utilisation
en centrifugeuse. Afin d’obtenir des éluats concentrés et pour éviter les risques de
contaminations croisées, nous recommandons d’effectuer l’élution par centrifugation.
Les consommables requis pour la procédure sur système d’aspiration sont différents
de ceux utilisés en centrifugeuse. Aussi, pour l’utilisation sur une chambre à vide, nous
recommandons les kits NucleoSpin® 96 Virus Core Kit. Pour l’utilisation manuelle, une
chambre à vide ’NucleoVac 96 Vacuum Manifold’ (voir ’Informations de commande’) est
nécessaire pour les kits NucleoSpin® 96 Virus Core Kit.
* La lyse doit être effectuée dans des blocs à puits carrés MN si la taille de l’échantillon est de 150 μL. Des blocs à
puits carrés MN supplémentaires peuvent être nécessaires (voir les informations de commande).
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
9
Extraction d’ARN / ADN viral
2.4
Accessoires recommandés pour les kits NucleoSpin® 96
Virus Core Kit
Le kit NucleoSpin® 96 Virus Core Kit contient les tampons, l’ARN carrier et les plaques
NucleoSpin® 96 Virus Binding Plates. Les blocs et composants complémentaires (ex:
plaque de lyse, d’élution et la Protéinase K) ne sont pas inclus dans les ’core kits’.
L’utilisateur pourra choisir les consommables les plus adaptés à ses besoins parmi le
catalogue d’accessoires proposés par MN.
La procédure NucleoSpin® 96 Virus Core Kit, est identique au protocole standard
(voir chapitre 5).
Les accessoires recommandés pour les kits NucleoSpin® 96 Virus Core Kits sont
disponibles au catalogue MACHEREY‑NAGEL (voir ’informations de commande’):
Etape du
protocole
Consommables adaptés,
non inclus dans les ’core kits’
1. Lyse des
échantillons
Bloc 96 puits ronds
avec 12 barrettes de
bouchons
Remarques
Les blocs 96 puits ronds
ou les barrettes de tubes
peuvent être fermés avec les
barrettes de bouchons.
ou
Rack de barrettes
de tubes avec
12 barrettes de
bouchons
ou
Bloc 96 puits carrés
’MN’
Blocs 96 puits carrés
Protéinase K
Les blocs 96 puits carrés
ne peuvent pas être fermés
avec les barrettes de
bouchons. Le scellement
avec des films adhésifs en
PE n’est pas recommandé
(risque de décollement
lors des étapes de
mélange). Le mélange
par pipetages répétés
est alors recommandé
pour homogénéiser les
échantillons dans le Tampon
de lyse RAV1.
Pour certains échantillons,
et pour l’extraction de
l’ADN viral, l’utilisation de la
protéinase K est nécessaire.
10
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
Extraction d’ARN / ADN viral
Etape du
protocole
Consommables adaptés,
non inclus dans les ’core kits’
2. Création
des
conditions
de fixation
Barrettes de
bouchons
Lors de l’utilisation des
blocs 96 puits ronds ou des
barrettes de tubes pour
la lyse des échantillons,
des barrettes de bouchons
supplémentaires sont
nécessaires.
3. Transfert
des
échantillons
Bloc 96 puits carrés
’MN’
Utilisable pour collecter les
déchets liquides.
4. Fixation
des acides
nucléiques
à la
membrane
Plaque de lavage ’MN
Wash Plate’
La plaque de lavage
minimise le risque de
contaminations (utilisable
lors de la procédure par
aspiration uniquement).
5. L
avages de
la
membrane
de silice*
Bloc 96 puits carrés
’MN’
Utilisable pour collecter les
déchets liquides.
6. E
lution de
l’ADN
Barrettes de tubes
avec barrettes de
bouchons
Les blocs 96 puits ronds
et les barrettes de tubes
peuvent être fermés avec les
barrettes de bouchons.
Remarques
ou
Bloc 96 puits ronds
* L’utilisation du Bloc 96 puits carrés MN est facultative. Pour la collecte des déchets, le bac à déchets de la
chambre à vide NucleoVac peut être utilisé.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
11
Extraction d’ARN / ADN viral
2.5
Automatisation de la procédure sur les plateformes
robotiques
Les kits NucleoSpin® 96 Virus Core Kit sont recommandés pour l’automatisation. Le
protocole décrit au paragraphe 5.2 est utilisable comme base de travail pour la création
de scripts robotiques pour l’automatisation du kit. Pour connaître la disponibilité de
scripts prêts à l’emploi ou des conseils généraux concernant l’automatisation du
kit NucleoSpin® 96 Virus Core Kit sur certaines plateformes, merci de contacter
MACHEREY‑NAGEL.
Lors de l’utilisation sur système d’aspiration, l’utilisation de la plaque de lavage à usage
unique ’MN Wash Plate’, à positionner dans la chambre à vide, est recommandée.
Elle permet de minimiser le risque de contaminations croisées induites par la création
d’aérosols lors des étapes d’aspiration. Visiter notre site web www.mn‑net.com ou
contacter votre distributeur local ou MACHEREY‑NAGEL directement pour obtenir un
support technique concernant l’équipement, les scripts et la sélection du protocole
adapté à vos besoins.
2.6
Echantillons biologiques
Echantillons liquides
Les fluides biologiques ou les échantillons semi fluides peuvent être utilisés (ex:
sérum, urine, lavages bronchoalvéolaire). Pour le bon déroulement de la purification
des acides nucléiques, il est important d’obtenir un lysat clarifié, homogénéisé et non
visqueux avant le dépôt sur la plaque NucleoSpin® 96 Virus. Ainsi, vérifier l’absence
de précipités dans les échantillons (en particulier s’ils sont anciens ou congelés). Les
précipités peuvent être éliminés par centrifugation après l’ajout du tampon de lyse
RAV1 et l’incubation de lyse. Eviter de clarifier les échantillons par centrifugation ou
filtration avant l’étape de lyse dans le tampon RAV1, car des virus d’intérêt pourraient
demeurés associés aux particules solides éliminés. L’incubation dans le tampon de
lyse RAV1 peut être prolongée afin de dissoudre et digérer les structures cellulaires,
les précipités et les particules virales. L’ARN, cependant, est sensible à la dégradation
et une incubation prolongée pourrait réduire le rendement d’extraction.
Echantillons solides (tissus, fèces)
Préparer une suspension à 10 % (masse / volume) de tissus dans le tampon (ex: PBS)
en utilisant un broyeur commercial (rotor stator ou système de broyage à billes, etc.)
Centrifuger la suspension afin d’éliminer les particules. Utiliser le surnageant clarifié
pour la suite de la procédure.
Ecouvillons
Incuber l’écouvillon dans un tampon adéquat (ex: PBS) ou du milieu de culture cellulaire
pendant 30 min. Poursuivre avec l’échantillons exempt de particules.
* La lyse doit être effectuée dans des blocs 96 puits carrés MN si la taille de l’échantillon est de 150 μL. Des blocs
96 puits carrés MN supplémentaires peuvent être nécessaires (voir les informations de commande).
12
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
Extraction d’ARN / ADN viral
Echantillons sanguins
Les échantillons de sang total peuvent être utilisés, si possible en les diluent dans du
tampon PBS. L’utilisation de sang non dilué peut induire le colmatage de la membrane
de silice des plaques NucleoSpin® 96 Virus. Le volume de PBS ajouté pour la dilution
doit être optimisé en fonction de la nature et l’origine des échantillons de sang. En
règle général, nous recommandons de débuter avec 50 µL de sang dilué avec 50 µL
de tampon PBS.
Volume d’échantillon
Les kits NucleoSpin® 96 Virus et NucleoSpin® 96 Virus Core Kits sont conçus pour
un volume d’échantillon de 100 µL. Si nécessaire, le volume traité peut être augmenté
à 150 µL Pour traiter des échantillons de 150 µL, les volumes de Tampon de lyse RAV1
et d’éthanol doivent être augmentés à 600 µL. En fonction des cônes utilisés, le volume
total de lysat (1300 µL) pourra nécessiter deux étapes de chargement sur la plaque
NucleoSpin® 96 Virus. Les volumes de tampons contenus dans les kits sont suffisant
pour permettre le traitement d’échantillons de 150 μL*.
Traitement à la Protéinase K
L’utilisation de Protéinase K est nécessaire pour l’extraction d’ADN viral ou l’extraction
simultanée d’ADN et d’ARN viral. Pour l’extraction d’ARN viral seul, la digestion avec
la Protéinase K n’est généralement par nécessaire. Le traitement à la Protéinase K
est cependant recommandé pour la purification de l’ARN viral à partir d’échantillons
visqueux (ex: crachats).
Lyse des échantillons
Pour l’extraction d’ARN viral, la lyse des échantillons dans le Tampon RAV1 pendant
10 min à 15 – 25 °C est suffisante. Pour l’extraction d’ARN viral à partir d’échantillons
visqueux, par exemple les crachats ou les surnageants de suspension de tissus ou
de fèces, une étape de lyse à 70°C peut être nécessaire. Pour l’extraction, simultanée
d’ARN et d’ADN viral, la durée d’incubation (ex: 5 – 15 min) et la température (ex: TA,
56 °C, ou 70 °C) devront être optimisées en fonctions des échantillons biologiques à
traiter.
2.7
ARN carrier
Les kits NucleoSpin® 96 Virus contiennent un ARN carrier optimisant la fixation des
acides nucléiques viraux à la membrane de silice et réduisant le risque de dégradation de
l’ARN viral. Noter que les éluats issus de la procédure NucleoSpin® 96 Virus contiennent
les acides nucléiques viraux et l’ARN carrier, dont la quantité peut excéder celle des acides
nucléiques viraux purifiés. Ainsi, il n’est pas possible de quantifier les acides nucléiques
viraux extraits au moyen de méthodes photométriques ou fluorométriques. Des
méthodes spécifiques de quantification comme la PCR ou la RT-PCR quantitative sont
recommandées. En outre, l’ARN carrier peut inhiber les réactions de PCR. La quantité d’
ARN carrier utilisée peut nécessiter des optimisations, selon le système de PCR utilisé.
* La lyse doit être effectuée dans des blocs 96 puits carrés MN si la taille de l’échantillon est de 150 μL. Des blocs
96 puits carrés MN supplémentaires peuvent être nécessaires (voir les informations de commande).
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
13
Extraction d’ARN / ADN viral
2.8
Procédures d’élution
Le rendement d’élution de l’ARN ou de l’ADN viral fixé sur la membrane de silice
dépend du volume de tampon d’élution utilisé. Celui-ci peut être ajusté de 75 à 200 µL,
le volume distribué optimal étant de 100 – 125 μL. Le volume mort de la membrane
est d’environ 45 µL, il est ainsi aisé d’estimer le volume final récupéré en fonction du
volume déposé sur la membrane.
Concentration optimisée: lorsqu’un volume réduit de tampon d’élution est utilisé
(75 – 100 μL), environ 70 – 80 % des acides nucléiques fixés peuvent être élués,
induisant une forte concentration d’ARN/ADN viral extrait. Il est également possible de
procéder à l’élution en deux étapes avec, par exemple, 75 μL chacune, ce qui permet
d’obtenir une meilleure efficacité d’élution mais un éluat moins concentré.
Préchauffer le tampon d’élution (70 °C): Utiliser le tampon d’élution préchauffé
permet d’améliorer l’efficacité de l’élution et donc le rendement total. En option, il est
possible d’incuber la plaque NucleoSpin® 96 Virus pendant 3 min à 60 – 70 °C après le
dépôt du tampon d’élution et avant de procéder à l’élution finale.
14
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
Extraction d’ARN / ADN viral
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention: les Tampons RAV1 et RAW contiennent des sels de guanidine! Porter des
gants et des lunettes de protection !
ATTENTION: le tampon RAV1 contient du thiocyanate de guanidine et le Tampon
RAW contient du chlorhydrate de guanidine, pouvant former des composés hautement
réactifs en cas de mélange avec de l’eau de Javel. NE PAS ajouter de javel ou de
solutions acides directement dans les déchets liquides issus de la procédure.
Avant de débuter toute procédure NucleoSpin® 96 Virus (Core Kit), préparer les
réactifs suivants:
•
Tampon de lavage RAV3: Ajouter le volume d’éthanol 96 – 100 % indiqué sur
le flacon de Tampon de lavage RAV3 concentré fourni dans le kit. Indiquer sur
l’étiquette que l’ajout d’éthanol a bien été effectué.
•
Avant la première utilisation du kit, ajouter le volume de Tampon de Protéinase
PB indiqué sur le flacon de Protéinase lyophilisé pour dissoudre l’enzyme
lyophilisée. La solution de Protéinase K est stable à -20 °C pendant 6 mois.
Diviser la solution en aliquotes.
•
Avant utilisation, ajouter 1 mL de Tampon de lyse RAV1 dans le tube d’ARN
carrier lyophilisé. Dissoudre l’ARN carrier et transférer le dans le flacon de
RAV1. Indiquer sur le flacon que l’ARN carrier a été ajouté. En raison du mode de
production et de la faible quantité d’ARN carrier lyophilisé contenu dans le flacon,
celui-ci peut ne pas être visible dans le flacon.
L’ARN carrier dispose d’une durée de conservation limitée une fois dissous dans
le tampon de lyse RAV1. Pour cela, les kits NucleoSpin® 96 Virus (Core Kit)
contiennent plusieurs flacons d’ARN carrier.
Stockage de l’ARN carrier dans le tampon RAV1
Le tampon RAV1 contenant l’ARN carrier peut être stocké à 15 – 25 °C pendant
1 – 2 semaines. La conservation à 15 – 25 °C prévient la précipitation des sels et
évite de devoir préchauffer la solution pour les dissoudre.
Pour une conservation jusqu’à 4 semaines du Tampon RAV1 contenant l’ARN
carrier, le stockage à 4°C est recommandé. Pour un stockage à long terme,
préparer des aliquotes et conserver à -20 °C. La conservation à 4 °C peut induire
la précipitation de sels. Ainsi, le mélange devra être réchauffé à 40 – 60 °C pendant
au plus 5 min afin de dissoudre les précipités de sels.
Attention:
Des incubations à chaud répétées, à des températures > 80 °C, ou de longue durée
induiront la dégradation de l’ARN carrier et peuvent donc impacter négativement
le rendement d’extraction de l’ARN viral, au risque de fausser les résultats des RTPCR et d’induire des faux négatifs. Ne pas réchauffer le Tampon RAV1 contenant
l’ARN carrier plus de 4 fois!
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
15
Extraction d’ARN / ADN viral
NucleoSpin® 96 Virus
2 x 96 preps
740691.2
4 x 96 preps
740691.4
100 mL
Ajouter 400 mL d’éthanol
2 x 100 mL
Ajouter 400 mL d’éthanol
dans chaque flacon
Protéinase K
(lyophilisée)
2 x 50 mg
Ajouter 2.5 mL de Tampon de
Protéinase PB
dans chaque flacon
3 x 75 mg
Ajouter 3.5 mL de Tampon de
Protéinase PB
dans chaque flacon
ARN carrier
(lyophilisé)
3 x 1 mg
Transférer le contenu de
chaque flacon dans une
bouteille de 40 mL de Tampon
RAV1
6 x 1 mg
Transférer le contenu de
chaque flacon dans une
bouteille de 40 mL de Tampon
RAV1
REF
Tampon de lavage
RAV3 (Concentré)
NucleoSpin® 96 Virus Core Kit
REF
Tampon de lavage
RAV3 (Concentré)
4 x 96 preps
740452.4
2 x 100 mL
Ajouter 400 mL d’éthanol
dans chaque flacon
ARN carrier
(lyophilisé)
6 x 1 mg
Transférer le contenu de chaque flacon dans une bouteille de
40 mL de Tampon RAV1
16
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
Extraction d’ARN / ADN viral
4
Instructions de sécurité
Lors de l’utilisation des kits NucleoSpin® 96 Virus ou NucleoSpin® 96 Virus Core Kit,
portez des équipements de protection adaptés (ex: blouse de laboratoire, gants jetables,
lunettes de protection). Pour plus d’informations, consulter les Fiches de Données de
Sécurité (FDS disponibles en ligne: www.mn‑net.com/msds).
Attention: le thiocyanate de guanidine contenu dans les Tampons RAV1 et le chlorhydrate
de guanidine contenu dans le Tampon RAW peuvent former des composés hautement
réactifs en présence d’eau de Javel! Ne pas ajouter d’eau de Javel ou de solutions
acides dans les déchets liquides issus de la procédure.
L’absence de matériel infectieux résiduel dans les déchets issus de la procédure
NucleoSpin® 96 Virus ou Core Kit n’a pas été testée. Une contamination des déchets
liquides avec des résidus de matériel infectieux est hautement improbable en raison de
l’utilisation d’un tampon de lyse fortement dénaturant et du traitement à la Protéinase K,
mais ne peut être totalement exclue. Ainsi, les déchets liquides doivent être considérés
comme potentiellement infectieux et être manipulés et éliminés conformément à la
réglementation locale.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou le matériel
biologique contaminé de manière conforme à la règlementation en vigueur.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
17
NucleoSpin® 96 Virus – Procédure par centrifugation
5
Protocoles
5.1
NucleoSpin® 96 Virus – procédure par centrifugation
•
Pour les équipements nécessaires, voir le paragraphe 2.3.
•
Pour des informations détaillées à propos de chaque étape, voir page 20.
•
Pour utiliser les kits NucleoSpin® 96 Virus Core Kit (REF 740452.4), voir le
paragraphe 2.4 à propos des accessoires recommandés.
Avant de débuter la préparation:
•
Vérifier que les Tampons RAV1, RAV3 et la Protéinase K ont été préparés selon
les recommandations du chapitre 3.
•
Régler un incubateur ou une étuve à 25 – 70 °C.
•
Préchauffer le Tampon d’élution RE ou l’eau à 70 °C.
Résumé du protocole
1
Lyse des échantillons
100 μL d’échantillon
400 μL de Tampon RAV1
(20 μL de Protéinase K)
Mélanger
25 – 70 °C, 10 min
2
Création des conditions
de fixation
3
Transfert des échantillons dans
la plaque NucleoSpin® 96 Virus
4
Fixation de l’ARN et de l’ADN viral
à la membrane de silice de la plaque
NucleoSpin® 96 Virus
18
400 μL d’éthanol (96 – 100 %)
Mélanger
5,600 – 6,000 x g,
2 min
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
NucleoSpin® 96 Virus – Procédure par centrifugation
5
Lavage de la membrane de silice
500 μL RAW
5,600 – 6,000 x g,
2 min
700 μL RAV3
5,600 – 6,000 x g,
2 min
700 μL RAV3
5,600 x g
15 min
6
Elution de l’ARN et de l’ADN viral
100 μL RE (70 °C)
5,600 – 6,000 x g,
2 min
Option: Répéter l’élution une fois
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
19
NucleoSpin® 96 Virus – Procédure par centrifugation
Protocole détaillé
Ce protocole standard est recommandé pour la purification de l’ARN viral, par
exemple HCV ou HIV. Les virus à ADN, comme le CMV peuvent aussi être extraits
mais une étape de digestion à la Protéinase K lors de la lyse est alors recommandée.
Placer la plaque NucleoSpin® 96 Virus sur un bloc 96 puits carrés. L’utilisation de deux
plaques en parallèle permet d’éviter de devoir équilibrer la centrifugeuse à chaque
étape.
•
Pour des informations concernant l’équipement nécessaire, voir le paragraphe
2.3.
•
Pour utiliser les kits NucleoSpin® 96 Virus Core Kit (REF 740452.4), voir le
paragraphe 2.4 pour des informations concernant les accessoires compatibles.
Avant de débuter la procédure:
•
Vérifier que les Tampons RAV1, RAV3 et la protéinase K ont bien été préparés
selon les instructions du chapitre 3.
•
Régler un incubateur ou une étuve à 25 – 70 °C.
•
Préchauffer le Tampon d’élution RE ou l’eau RNase-Free à 70 °C.
1
Lyse des échantillons
Déposer 400 μL de Tampon RAV1 dans les puits des barrettes de tubes ou
dans un bloc à puits ronds. Distribuer le tampon au fond des puits.
Si des échantillons de 150 μL sont traités*, pipeter 600 μL de Tampon RAV1
dans les puits.
L’utilisation d’une pipette électronique 8 canaux munie de cônes longs capables
de transférer plus de 650 µL est recommandée.
Déposer 100 μL d’échantillon dans les puits contenant le Tampon RAV1. Veiller
à bien déposer les échantillons directement dans le Tampon RAV1. Mélanger en
pipetant plusieurs fois le mélange. Ne pas souiller les parois.
Refermer les barrettes de tubes ou les puits des blocs 96 puits ronds avec
les barrettes de bouchons. Incuber le mélange pendant 10 min à température
ambiante (18 – 25 °C).
Option : Ajouter 20 µL de Protéinase K dans chaque échantillon mélangé avec
le Tampon RAV1. Refermer les puits de lyse avec les barrettes de bouchons et
incuber pendant 5 – 10 min à 56 – 70°C. L’ajout de la Protéinase K est nécessaire
pour l’extraction de l’ADN viral et peut s’avérer utile pour la purification de l’ARN
viral à partir de certains échantillons. Pour des détails concernant la durée et la
température d’incubation, voir le paragraphe 2.6.
Centrifuger (30 s ; 1,500 x g) avant d’enlever les barrettes de bouchons.
* La lyse doit être effectuée dans des blocs 96 puits carrés MN si la taille de l’échantillon est de 150 μL. Des blocs
96 puits carrés MN supplémentaires peuvent être nécessaires (voir les informations de commande).
20
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
NucleoSpin® 96 Virus – Procédure par centrifugation
2
Création des conditions de fixation des acides nucléiques
Enlever les barrettes de tubes et ajouter 400 μL d’éthanol (96 – 100 %) dans
chaque lysat. Veiller à ne pas souiller les parois supérieures des tubes lors
de la distribution de l’éthanol. Refermer les puits avec de nouveaux bouchons
(fournis). Retourner le bloc de lyse 10 fois et mélanger par agitation pendant
15 s. Centrifuger (30 s ; 1,500 x g) avant d’enlever les barrettes de bouchons.
Si le volume d’échantillon à traiter est de 150 μL, ajouter 600 μL d’éthanol
(96 – 100 %) dans chaque lysat.
3
Transfert des échantillons dans les plaques NucleoSpin® 96 Virus
Enlever les bouchons et transférer la totalité de l’échantillon dans les puits de
la plaque NucleoSpin® 96 Virus placée sur un bloc 96 puits carrés MN. Ne pas
souiller les parois supérieures des puits lors du dépôt afin d’éviter tout risque de
contaminations croisées lors de la centrifugation. Sceller la plaque NucleoSpin®
96 Virus avec un film adhésif en PE.
4
Fixation des acides nucléiques viraux à la membrane de silice
Placer le bloc et la plaque NucleoSpin® 96 Virus dans la nacelle de la
centrifugeuse. Centrifuger à 5,600 – 6,000 x g pendant 2 min.
En général, les échantillons passent totalement à travers la membrane de silice
en ≤ 1 min.
Optionnel : Si le volume d’échantillon à traiter est de 150 μL, déposer les
échantillons successivement dans la plaque NucleoSpin® 96 Virus comme
indiqué à l’étape 3. Dans ce cas, utiliser un nouveau bloc 96 puits carrés pour les
étapes de lavages, le volume maximal des puits du bloc pouvant être dépassé
(des blocs supplémentaires sont disponibles séparément, voir ’Informations de
commande’).
5
Lavages de la membrane de silice
1er lavage
Enlever le film adhésif en PE et déposer 500 μL de Tampon RAW dans les
puits de la plaque NucleoSpin® 96 Virus. Sceller la plaque NucleoSpin® 96 Virus
avec un nouveau film adhésif en PE. Centrifuger à 5,600 – 6,000 x g pendant
1 – 2 min.
Enlever le film adhésif en PE et placer la plaque NucleoSpin® 96 Virus sur un
nouveau bloc 96 puits carrés.
2ème lavage
Déposer 700 µL de Tampon RAV3 dans chaque puits de la plaque NucleoSpin®
96 Virus. Sceller la plaque avec un nouveau film adhésif en PE. Centrifuger à
5,600 – 6,000 x g pendant 1 – 2 min.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
21
NucleoSpin® 96 Virus – Procédure par centrifugation
3ème lavage
Répéter le deuxième lavage. Prolonger la centrifugation pendant 15 min afin
d’éliminer l’éthanol provenant du Tampon RAV3
Alternative : enlever le film adhésif en PE et placer la plaque NucleoSpin® 96
Virus dans un incubateur à 37°C pendant 20 min pour permettre l’évaporation
de l’éthanol.
L’élimination de l’éthanol par évaporation à 37 °C est plus efficace qu’une étape
supplémentaire de centrifugation prolongée (15 min, 6,000 x g).
6
Elution de l’ARN et de l’ADN viral
Placer la plaque NucleoSpin® 96 Virus sur un bloc de barrettes de tubes.
Déposer 75 – 100 μL d’eau RNase-free ou de Tampon RE (préchauffé à
70 °C) dans chacun des puits de la plaque NucleoSpin® 96 Virus. Déposer le
tampon directement sur la membrane de silice. Incuber à température ambiante
pendant 1 min. Sceller avec un nouveau film adhésif en PE. Centrifuger à
5,600 – 6,000 x g pendant 2 – 3 min.
Les barrettes de tubes contenant l’ARN/ADN purifié peuvent être refermés avec
les barrettes de bouchons pour le stockage.
Le rendement sera accru de 10 – 15 % en utilisant 100 – 200 μL de tampon
d’élution. La concentration en acides nucléiques, cependant, sera diminuée.
Pour les applications de RT-PCR /PCR, la concentration est généralement à
privilégier. Si seul l’ADN viral est à purifier, l’élution sera effectuée en utilisant le
Tampon d’élution RE, optimisé pour l’élution et le stockage de l’ADN.
22
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
NucleoSpin® 96 Virus – Procédure avec système sous vide
5.2
NucleoSpin® 96 Virus (Core Kit) – procédure sur
système d’aspiration
•
Pour les équipements nécessaires, voir le paragraphe 2.3.
•
Pour des informations détaillées à propos de chaque étape, voir page 26.
•
Pour des informations concernant la chambre à vide et son montage, voir page
25.
•
Pour utiliser le kit NucleoSpin® 96 Virus Core Kit (REF 740452.4), voir le
paragraphe 2.4 à propos des accessoires recommandés.
Avant de débuter la préparation:
•
Vérifier si les Tampons RAV1, RAV3 et la Protéinase K ont été préparés selon les
instructions du chapitre 3.
•
Régler un incubateur ou une étuve à 25 – 70 °C.
•
Préchauffer le Tampon d’élution RE ou l’eau à 70 °C.
Résumé du protocole
1
Lyse des échantillons
100 μL d’échantillon
400 μL de Tampon RAV1
(20 μL Protéinase K)
Mélanger
25 – 70 °C, 10 min
2
Création des conditions de
fixation
3
Transfert de l’échantillon sur
la plaque NucleoSpin® 96 Virus
4
Fixation des acides nucléiques
sur la plaque NucleoSpin® 96
Virus
400 μL d’éthanol (96 – 100 %)
Mélanger
-0.2 bar*,
5 min
* Réduction de la pression atmosphérique.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
23
NucleoSpin® 96 Virus – Procédure avec système sous vide
5
Lavage et séchage de la
membrane de silice
500 μL RAW
- 0.2 bar*
5 min
700 μL RAV3 – 0.2 bar*
2 min
700 μL RAV3 – 0.2 bar*
5 min
Enlever la plaque ’MN Wash Plate’
- 0.6 bar*
15 min
6
Elution de l’ARN et de l’ADN
viral
100 μL RE (70 °C)
- 0.4 bar*
2 min
Option: Répéter l’élution une fois
Note: l’élution par centrifugation
est recommandée.
24
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
NucleoSpin® 96 Virus – Procédure avec système sous vide
Montage de la chambre à vide:
Etapes de fixation et de lavage
Etape d’élution
Etape 4
Placer la plaque de
fixation NucleoSpin®
Binding Plate sur le dessus
du couvercle de la cuve
NucleoVac.
Etape 4
Placer la plaque de
fixation ‘NucleoSpin®
Binding Plate’ sur le
dessus du couvercle
de la cuve NucleoVac.
Etape 3
Placer le couvercle
sur la cuve du NucleoVac.
Etape 3
Placer le couvercle sur
la cuve du NucleoVac.
Etape 2
Placer la plaque
‘MN Wash Plate’
dans la cuve NucleoVac.
Etape 2
Placer le rack de tubes
dans la cuve NucleoVac.
MICR
OT
UB
E RA
CK
Etape 1
Insérer les adaptateurs
‘MTP/MULTI-96 PLATE’
et le conteneur à déchets
dans la cuve du NucleoVac.
MICR
OT
Etape 1
Insérer les adaptateurs
‘MICROTUBE RACK’
dans la cuve du
NucleoVac
UB
E RA
CK
Configuration finale
Configuration finale
MICR
OT
UB
E RA
CK
MICR
OT
UB
E RA
CK
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
25
NucleoSpin® 96 Virus – Procédure avec système sous vide
Protocole détaillé
Alors que pour les kits NucleoSpin® 96 Virus, la procédure par centrifugation
détermine les consommables à utiliser (barrettes de tubes, blocs 96 puits carrés,
etc.) la procédure sur système d’aspiration permet plus de flexibilité au niveau des
consommables.
Lorsque de nombreux échantillons sont traités en parallèle selon la procédure par
aspiration, la prévention des contaminations croisées potentielles, liées à la création
d’aérosols, est cruciale. L’utilisation de la plaque de lavage ’MN Wash Plate’ permet de
minimiser ce risque. Cet accessoire efficace est donc vivement recommandé lors de la
procédure par aspiration.
L’utilisation des kits NucleoSpin® 96 Virus et du Core Kit par aspiration nécessite la
chambre à vide ’NucleoVac 96 Vacuum Manifold’ (voir ’Informations de commande’).
Placer la plaque NucleoSpin® 96 Virus sur la chambre à vide NucleoVac. Si le nombre
d’échantillons à traiter est inférieur à 96, sceller les puits vides avec un film adhésif en
PE afin de garantir un vide adéquat lors des étapes de filtration.
Ce protocole standard est recommandé pour la purification de l’ARN viral, par exemple
HCV ou HIV. Les virus à ADN comme CMV peuvent également être extraits, la digestion
à la protéinase K est alors recommandée (non fournie dans les kits ’core kit’)
•
Pour les équipements nécessaires, voir le paragraphe 2.3.
•
Pour des informations détaillées à propos du montage de la chambre à vide, voir
page 25.
•
Pour utiliser le kit NucleoSpin® 96 Virus Core Kit (REF 740452.4), voir le
paragraphe 2.4 à propos des accessoires recommandés.
Avant de débuter la préparation:
•
Vérifier que les Tampons RAV1, RAV3 et la Protéinase K ont bien été préparés
selon les recommandations du chapitre 3.
•
Régler un bloc chauffant ou une étuve à 25 – 70 °C.
•
Réchauffer le Tampon d’élution RE ou l’eau RNase-Free à 70 °C.
1
Lyse des échantillons
Pipeter 400 μL de Tampon RAV1 dans les puits d’un contenant adapté pour la
lyse. Distribuer la solution au fond des puits.
Si le volume d’échantillon à traiter est de 150 μL*, déposer 600 μL de Tampon
RAV1 dans les puits.
Nous recommandons l’utilisation d’une pipette 8 canaux, dotée de cônes extralongs et capable de transférer plus de 650 µL.
Déposer 100 μL d’échantillon dans les puits contenant le Tampon RAV1.
Veiller à déposer les échantillons directement dans le Tampon RAV1.
* La lyse doit être effectuée dans des blocs 96 puits carrés MN si la taille de l’échantillon est de 150 μL. Des blocs
96 puits carrés MN supplémentaires peuvent être nécessaires (voir les informations de commande).
26
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
NucleoSpin® 96 Virus – Procédure avec système sous vide
Mélanger par pipetages répétés plusieurs fois. Ne pas contaminer la partie
supérieure des puits.
Refermer les puits et incuber le mélange pendant 10 min à température
ambiante (18 – 25 °C).
Optionnel : Ajouter 20 µL de Protéinase K (20 mg/mL) dans chaque échantillon
mélangé au Tampon RAV1. Fermer les puits et incuber pendant 5 – 10 min à
56 – 70 °C. L’ajout de Protéinase K est nécessaire pour l’extraction de l’ADN
viral et peut s’avérer utile pour l’extraction de l’ARN viral à partir de certains
types d’échantillons. Pour des détails concernant la durée et la température
d’incubation, voir le paragraphe 2.6.
Centrifuger brièvement (30 s, 1,500 x g) pour collecter les gouttes, si
nécessaire, avant d’ouvrir les puits.
2
Création des conditions de fixation
Ouvrir les puits et distribuer 400 μL d’éthanol (96 – 100 %) dans chaque
échantillon. Veiller à ne pas souiller la partie supérieure des puits lors du
pipetage. Refermer les puits avec de nouveaux bouchons, retourner le bloc de
lyse 10 x, et mélanger en agitant pendant 15 s. Centrifuger brièvement (30 s,
1,500 x g) pour collecter les gouttes d’échantillons au niveau des bouchons.
Si le volume d’échantillon à traiter est de 150 μL, ajouter 600 μL d’éthanol
(96 – 100 %) dans chaque lysat.
3
Transfert des échantillons dans la plaque NucleoSpin® 96 Virus
Placer la poubelle pour les déchets liquides dans la cuve de la chambre à
vide. Des blocs 96 puits peuvent être également utilisés pour la collecte des
déchets. Insérer les cales ’’MTP/MULTI-96 PLATE’, échancrure vers le haut
dans les fentes latérales de la cuve et placer dessus la plaque ’MN Wash Plate’.
Refermer la chambre à vide et placer la plaque NucleoSpin® 96 Virus sur le
couvercle.
Transférer les échantillons dans les puits de la plaque en veillant à ne pas
souiller le haut des puits.
4
Fixation des acides nucléiques viraux à la membrane de silice
Appliquer un vide de - 0.2 à - 0.4 bar * pour permettre la filtration des échantillons
à travers la membrane (2 – 5 min). Le débit de filtration idéal est d’environ 1 – 2
gouttes par seconde. Régler le vide de manière à obtenir ce flux.
* Réduction de la pression atmosphérique.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
27
NucleoSpin® 96 Virus – Procédure avec système sous vide
5
Lavage et séchage de la membrane de silice
1er lavage
Déposer 500 μL de Tampon RAW dans les puits de la plaque NucleoSpin®
96 Virus. Appliquer le vide (- 0.2 à - 0.4 bar*) jusqu’au passage complet du
tampon à travers les membranes de silice de la plaque NucleoSpin® 96 Virus
(2 – 5 min). Rompre le vide.
2ème lavage
Déposer 700 μL de Tampon RAV3 dans les puits de la plaque NucleoSpin®
96 Virus. Appliquer le vide (- 0.2 à - 0.4 bar*) jusqu’au passage complet du
tampon à travers les membranes de silice de la plaque NucleoSpin® 96 Virus
(2 – 5 min). Rompre le vide.
3ème lavage
Déposer 700 μL de Tampon RAV3 dans les puits de la plaque NucleoSpin®
96 Virus. Appliquer le vide (- 0.2 à - 0.4 bar*) jusqu’au passage complet du
tampon à travers les membranes de silice de la plaque NucleoSpin® 96 Virus
(2 – 5 min). Rompre le vide.
Enlever la plaque ’MN Wash Plate’
Après le dernier lavage, fermer la valve, rompre le vide et enlever la plaque
NucleoSpin® 96 Virus. Déposer le couvercle et retirer la plaque ’MN Wash
Plate’, ainsi que la poubelle de déchets liquides.
Optionnel : si nécessaire, tapoter la plaque NucleoSpin® 96 Virus sur un papier
absorbant propre (inclus avec la ’MN Wash Plate) pour éliminer les gouttelettes
de tampon de lavage des embouts des puits
Réassembler la chambre à vide et sécher la membrane en appliquant le vide
maximal (ex : - 0.6 bar* ) pendant 15 minutes.
6
Elution de l’ARN et de l’ADN viral
Placer un bloc d’élution adapté sur les cales correspondantes (ex :
’MICROTUBE RACK’) dans la cuve. Refermer la chambre à vide et placer la
plaque NucleoSpin® 96 Virus sur le couvercle. Déposer 100 μL d’eau RNasefree ou de Tampon RE (préchauffé à 70 °C) dans chacun des puits. Distribuer
l’eau ou le tampon d’élution directement sur la membrane de silice. Incuber
à température ambiante pendant 2 – 3 min et appliquer un vide de -0.4 bar*
jusqu’au passage complet de l’éluat.
Si seul l’ADN viral est extrait, l’élution sera effectuée dans le Tampon d’élution
RE, optimisé pour favoriser l’élution et le stockage de l’ADN.
Optionnel : Répéter l’élution une fois (l’incubation n’est alors pas nécessaire).
Note : l’élution par aspiration peut induire des contaminations croisées liées à la
formation d’aérosols. Si possible, utiliser la centrifugation pour l’étape d’élution.
* Réduction de la pression atmosphérique.
28
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
Extraction d’ARN / ADN viral
6
Annexes
6.1
Optimisation des performances
Problème
Causes possibles et suggestions
Problèmes avec l’ARN carrier
•
Omission de l’ARN carrier.
•
Voir les remarques concernant la conservation du Tampon RAV1
contenant l’ARN carrier (paragraphe 2.7).
Digestion avec la Protéinase K
•
Rendement
faible ou nul
Pour certains types d’échantillons et pour l’extraction de l’ADN
viral, l’utilisation de la Protéinase K est requise lors de la lyse.
Comparer les résultats obtenus avec et sans digestion à la
Protéinase K.
Acides nucléiques viraux dégradés
•
Les échantillons doivent être extraits rapidement. Si nécessaire,
ajouter un inhibiteur de RNases aux échantillons. Créer un
environnement de travail exempt de nucléases. Utiliser des cônes
et réservoirs de tampons appropriés.
•
Vérifier la préparation et les conditions de stockage de tous les
tampons. En cas de doute, utiliser de nouveaux aliquotes de
Tampon RAV1 et de Tampon d’élution.
Sensibilité réduite
•
Problèmes
de
détection
des acides
nucléiques
viraux
L’ARN carrier peut interférer avec les systèmes de PCR / RTPCR utilisés. Changer le volume d’ADN/ARN viral utilisé pour
la PCR / RT-PCR. Diluer les éluats afin de réduire les inhibitions.
Réduire la concentration en ARN carrier dans le tampon RAV1.
La détermination de la concentration optimale d’ARN carrier peut
nécessiter quelques tests préliminaires
Contamination par de l’éthanol
•
Prolonger la centrifugation de manière à totalement éliminer le
Tampon RAV3.
Inhibition de la PCR
•
Problèmes
généraux
Ajouter une étape de lavage supplémentaire avec l’éthanol
96 – 100 % après le dernier lavage avec RAV3.
Membrane colmatée
•
Centrifuger les lysats avant l’ajout de l’éthanol et le chargement
de la plaque NucleoSpin® 96 Virus.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
29
Extraction d’ARN / ADN viral
6.2
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoSpin 96 Virus
740691.2
740691.4
2 x 96 preps
4 x 96 preps
NucleoSpin® 96 Virus Core Kit
740452.4
4 x 96 preps
NucleoSpin® 8 Virus
740643
740643.5
12 x 8 preps
60 x 8 preps
NucleoSpin® 8 Virus Core Kit
740451.4
48 x 8 preps
Protéinase K
740506
100 mg
Blocs 96 puits carrés ’MN’
740476
4
Blocs 96 puits carrés
740481
4
Blocs 96 puits ronds avec barrettes de bouchons
(1 set comprend 1 bloc 96 puits ronds et 12
barrettes de bouchons)
740475
4
Rack de barrettes de tubes avec barrettes
de bouchons (1 set comprend 1 support, 12
barrettes de 8 tubes 1,2 mL et 12 barrettes de
bouchons)
740477
4
Barrettes de bouchons
740478
48
Plaques ’MN Wash Plates’
740479
4
Film adhésif en PE
740676
50
Adaptateur ’MN Frame’
(pour l’utilisation des kits sur les chambres à
vide des automates BioRobot® 9600, 9604, and
3000 (Qiagen), MultiPROBE® II (PerkinElmer),
Biomek® 2000, and FX (Beckman Coulter)
740680
1
Accessoires ’Starter Set A’
(pour l’utilisation du format NucleoSpin 8 sur la
chambre à NucleoVac 96 ou sur automate)
740682
1
Accessoires ’Starter Set C’
(pour l’utilisation du format NucleoSpin 8 par
centrifugation)
740684
1
Chambre à vide NucleoVac 96
740681
1
Manomètre NucleoVac
740641
1
®
30
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
Extraction d’ARN / ADN viral
Produit
REF
Conditionnement
Adaptateur pour colonnes ’Column Holder A’
740480
1
6.3
Restriction d’utilisation / garantie
Les composants du kit NucleoSpin® 96 Virus (Core Kit) ont été développés, conçus
et vendus UNIQUEMENT À DES FINS DE RECHERCHE, à l’exception, toutefois, de
toute autre fonction du produit qui est expressément décrite dans les notices originales
des produits MACHEREY‑NAGEL.
Les produits MACHEREY‑NAGEL sont destinés à une utilisation GÉNÉRALE
en LABORATOIRE UNIQUEMENT ! Les produits MACHEREY‑NAGEL sont
EXCLUSIVEMENT destinés à un PERSONNEL QUALIFIÉ ! Lorsqu’ils manipulent des
produits MACHEREY‑NAGEL, les utilisateurs doivent toujours porter des VÊTEMENTS
DE PROTECTION adéquats. Pour des informations détaillées, veuillez-vous référer
à la fiche de données de sécurité du produit ! Les produits MACHEREY‑NAGEL
doivent être utilisés exclusivement dans un ENVIRONNEMENT DE TEST ADÉQUAT.
MACHEREY‑NAGEL décline toute responsabilité pour les dommages dus à une
utilisation incorrecte de ses produits dans tous autres domaines d’application.
L’application sur le corps humain est STRICTEMENT INTERDITE. L’utilisateur est
responsable de tous les dommages résultant d’une telle application.
Les produits de purification d’ADN/ARN/PROTÉINES de MACHEREY‑NAGEL
conviennent UNIQUEMENT aux UTILISATIONS IN VITRO !
SEULS les produits MACHEREY‑NAGEL portant la mention « IVD » peuvent également
être utilisés pour le diagnostic IN VITRO. Veuillez prêter attention à l’emballage du
produit. La mention « IVD » doit figurer expressément sur l’emballage des produits de
diagnostic IN-VITRO.
S’IL N’Y A PAS LA MENTION « IVD », LE PRODUIT NE PEUT PAS ÊTRE UTILISÉ
POUR LE DIAGNOSTIC IN-VITRO !
TOUS LES AUTRES PRODUITS NE PORTANT PAS LA MENTION « IVD » NE SONT
PAS ADAPTÉS À UN USAGE CLINIQUE (Y COMPRIS, MAIS SANS S’Y LIMITER, À
UN USAGE DIAGNOSTIQUE, THÉRAPEUTIQUE ET/OU PRONOSTIQUE).
Aucune revendication ni déclaration n’est prévue concernant son utilisation pour
identifier un organisme spécifique ou pour un usage clinique (y compris, mais sans s’y
limiter, à des fins diagnostiques, pronostiques, thérapeutiques ou dans les banques du
sang). Il incombe plutôt à l’utilisateur ou – dans tous les cas de revente des produits
– au revendeur de contrôler et de veiller à ce que les produits de purification d’ADN/
ARN/protéines de MACHEREY‑NAGEL soient utilisés pour une application bien définie
et spécifique.
MACHEREY‑NAGEL est responsable uniquement des spécifications et des
performances des produits MN conformément aux spécifications de contrôle qualité
interne, de la documentation du produit et du matériel de marketing.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL est livré avec une documentation précisant les
spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
31
Extraction d’ARN / ADN viral
la conformité du produit aux spécifications déclarées. La seule obligation de
MACHEREY‑NAGEL et le seul recours du client se limitent au remplacement gratuit
des produits qui n’offriraient pas les performances garanties. Il est également fait
référence aux conditions générales de vente MACHEREY‑NAGEL, qui sont imprimées
sur la liste tarifaire et dont un exemplaire sera remis sur simple demande.
MACHEREY‑NAGEL ne saurait être tenu responsable : des dommages ou défauts se
produisant pendant le transport et la manipulation (hors assurance expédition du client),
ou par suite d’un accident ou d’une utilisation impropre ou anormale du présent produit ;
des défauts des produits ou des composants non fabriqués par MACHEREY‑NAGEL ;
ni des dommages résultant de tels produits et composants de fabricants autres que
MACHEREY‑NAGEL ; pour lesquels il n’existe aucune garantie.
MACHEREY‑NAGEL n’accorde aucune autre garantie d’aucune sorte, et DÉCLINE
ET EXCLUT SPÉCIFIQUEMENT TOUTE AUTRE GARANTIE DE TOUTE SORTE
OU NATURE QUE CE SOIT, DIRECTEMENT OU INDIRECTEMENT, EXPRESSE
OU IMPLICITE, Y COMPRIS, SANS S’Y LIMITER, RELATIVE AU CARACTÈRE
APPROPRIÉ, À LA REPRODUCTIBILITÉ, LA DURABILITÉ, L’ADAPTATION À UN
BUT OU UN USAGE PARTICULIER, LA QUALITÉ MARCHANDE, L’ÉTAT OU TOUT
AUTRE SUJET EN CE QUI CONCERNE LES PRODUITS MACHEREY‑NAGEL.
MACHEREY‑NAGEL ne saurait en aucun cas être tenue pour responsable en cas de
réclamations pour tout autre dommage, qu’il soit direct, indirect, fortuit, compensatoire,
prévisible, consécutif ou particulier (y compris, mais sans s’y limiter, la perte d’utilisation,
de revenus ou de profits), que ce soit sur la base d’une garantie, d’un contrat, d’un
délit civil (y compris la négligence) ou d’une responsabilité stricte découlant de la
vente ou du défaut d’exécution d’un produit MACHEREY‑NAGEL conformément aux
spécifications énoncées. La garantie est exclusive et MACHEREY‑NAGEL ne donne
aucune autre garantie expresse ou implicite.
La garantie fournie dans le présent document et les données, spécifications et
descriptions de ce produit MACHEREY‑NAGEL figurant dans les catalogues publiés et
la documentation sur le produit de MACHEREY‑NAGEL sont les seules représentations
de MACHEREY‑NAGEL concernant le produit et la garantie. Aucune autre déclaration
ou représentation, écrite ou orale, par des employés, agents ou représentants de
MACHEREY‑NAGEL, à l’exception des déclarations écrites signées par un agent
dûment agréé par MACHEREY‑NAGEL, n’est autorisée ; le client ne doit pas se fier à
de telles déclarations ou représentations, lesquelles ne font pas partie du contrat de
vente ou de la présente garantie.
Les allégations relatives au produit sont susceptibles d’être modifiées. Nous vous
invitons par conséquent à contacter notre service d’assistance technique pour obtenir
les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez
également contacter votre revendeur habituel, pour obtenir des informations scientifiques
à caractère général. Les applications mentionnées dans la documentation fournie
par MACHEREY‑NAGEL le sont uniquement à titre informatif. MACHEREY‑NAGEL
ne garantit pas que toutes les applications ont été testées dans les laboratoires de
MACHEREY‑NAGEL, avec les produits MACHEREY‑NAGEL. MACHEREY‑NAGEL ne
garantit en aucun cas le caractère correct de ces applications.
Dernière mise à jour : 07/2010, Rév. 03
32
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
Extraction d’ARN / ADN viral
Veuillez contacter :
MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG
Tel.: +49 24 21 969‑270
tech-bio@mn‑net.com
Marques déposées :
Biomek® est une marque déposée de Beckman Coulter Inc.
BioRobot® est une marque déposée du groupe Qiagen.
MultiPROBE® est une marque déposée de Perkin Elmer Inc.
NucleoSpin® est une marque déposée de MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques
enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention
de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et
aux marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce
qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur
efficacité ou leur fonctionnement.
MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 08
33
www.mn-net.com
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Valencienner Str. 11
52355 Düren · Germany
DE
CH
FR
US
Tel.: +49 24 21 969-0
Tel.: +41 62 388 55 00
Tel.: +33 388 68 22 68
Tel.: +1 888 321 62 24
info@mn-net.com
sales-ch@mn-net.com
sales-fr@mn-net.com
sales-us@mn-net.com
Axxxxx
">