Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems StepOne™ Système Manuel du propriétaire

Applied Biosystems StepOne™
Système de PCR en temps réel
Guide des réactifs
Applied Biosystems StepOne™
Système de PCR en temps réel
Guide des réactifs
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Applera, Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, Primer Express, and VIC are registered trademarks, and FAM, JOE, MultiScribe, NED, ROX,
StepOne, TAMRA, and TET are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other countries.
AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc.
SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.
All other trademarks are the sole property of their respective owners.
Référence 4377720 Rév. B
06/2010
Table des matières
Front Cover
Préface
Utilisation de ce guide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Informations supplémentaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
Comment obtenir une assistance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi
Chapitre 1
Introduction
À propos du système StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2
Configuration des expériences sur le système StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4
Sélection de l’application . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5
Sélection du type de réactif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6
Sélection du type d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7
Chapitre 2
Présentation des réactifs
Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Réactifs TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Réactifs SYBR® Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4
Sélection du type de réactif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-5
Limitation des contaminations d’ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7
Chapitre 3
Expériences de quantification
Section 3.1 : À propos des expériences de quantification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3
Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4
Sélection de la méthode de quantification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5
Sélection de la RT-PCR 1 ou 2 étapes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8
Sélection de la PCR simplex ou multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10
Sélection du type de réactif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12
Sélection du type d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12
Section 3.2 : Instructions de préparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-15
Essais en stock/fabriqués sur commande . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16
Essais TaqMan®Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16
Essais Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
iii
Sélection du master mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-19
Conception de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20
Essais personnalisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20
Création d’amorces et de sondes à l’aide du logiciel Primer Express® . . . . . . . . 3-21
Sélection des réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-24
Utilisation des conditions de thermocyclage recommandées . . . . . . . . . . . . . . . 3-26
Optimisation des concentrations d’amorces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-29
Optimisation de la concentration de sonde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-33
Pour plus d’informations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-35
Chapitre 4
Réactions de génotypage
Section 4.1 : À propos des réactions de génotypage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3
Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4
Sélection du type d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6
Section 4.2 : Instructions de préparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9
Essais préconçus/validés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
Essais TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
Essais TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11
Réactifs Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . 4-12
Sélection du master mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13
Conception de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14
Essais personnalisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15
Essais Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15
Sélection du master mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17
Conception de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17
Chapitre 5
Expériences de présence/absence
Section 5.1 : À propos des expériences de présence/absence . . . . . . . . . . . . . . . . 5-3
Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4
Sélection du type d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-5
Section 5.2 : Instructions de préparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9
Essais en stock/fabriqués sur commande . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
Essais TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
Essais Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12
Réactifs TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents . . . . . . . . . . . . 5-13
Sélection du master mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-14
Conception de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15
Essais personnalisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15
iv
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Annexe A
Formule
Formule pour les expériences de quantification relative par la méthode
de comparaison des valeurs de CT (∆∆CT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-1
Annexe B
Limitation des amorces dans la PCR multiplex
Annexe C
Instructions de préparation des essais
Bibliographie
Glossaire
Index
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
v
vi
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Préface
Utilisation de ce guide
Objectif de ce
guide
Ce guide fournit des informations sur les réactifs compatibles avec le système de
PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™ (le système StepOne™). Contenu
du guide :
• Introduction aux réactifs TaqMan® et SYBR® Green
• Description et instructions pour les applications suivantes :
– Expériences de quantification
– Réactions de génotypage
– Expériences de présence/absence
Public concerné
Prérequis
Ce guide est destiné aux personnels de laboratoire et aux directeurs de recherche qui
effectuent des expériences de PCR en temps réel sur le système StepOne.
Le contenu de ce guide s’appuie sur les prérequis suivants :
• L’utilisateur possède une connaissance pratique du processus de réaction de
polymérisation en chaîne (PCR).
• L’utilisateur sait comment manipuler les échantillons d’ADN/ARN et les
préparer pour la PCR.
Conventions
typographiques
Mises en garde à
l’attention des
utilisateurs
Ce guide utilise les conventions suivantes :
• Le texte en gras indique une action de l’utilisateur. Par exemple :
Taper 0, puis appuyer sur Entrée pour chaque champ restant.
• Le texte en italique est utilisé pour signaler des termes nouveaux ou importants
et pour mettre un élément en valeur. Par exemple :
Avant l’analyse, toujours préparer une matrice fraîche.
• Une flèche vers la droite () sépare des commandes successives à sélectionner
dans un menu déroulant ou un ensemble de raccourcis. Par exemple :
Sélectionner File (Fichier)Open (Ouvrir).
Deux types de mises en garde apparaissent dans la documentation destinée aux
utilisateurs des produits Applied Biosystems. Chaque mention implique un degré de
mise en garde particulier ou l’une des actions décrites ci-dessous :
Remarque : – Fournit des informations potentiellement utiles mais non critiques
pour l’utilisation du produit.
IMPORTANT ! – Fournit des informations nécessaires au bon fonctionnement de
l’instrument, à un usage précis du kit de réactifs ou à la manipulation d’un produit
chimique en toute sécurité.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
vii
Préface
Exemples de mises en garde à l’attention des utilisateurs :
Remarque : La fonction Calibrate (Calibrer) est également disponible dans la
console de commande.
IMPORTANT ! Pour vérifier la connexion client, il est impératif de posséder un ID
utilisateur valide.
Alertes à la
sécurité
Quatre alertes à la sécurité apparaissent dans la documentation destinée aux
utilisateurs des produits Applied Biosystems. Elles sont insérées à des endroits
spécifiques pour attirer l’attention du lecteur sur des risques importants. Chaque
alerte – IMPORTANT, ATTENTION, AVERTISSEMENT, DANGER – implique
un degré de mise en garde ou une action spécifique.
Définition
IMPORTANT ! – Fournit des informations nécessaires au bon fonctionnement de
l’instrument, à un usage précis du kit de réactifs ou à la manipulation d’un produit
chimique en toute sécurité.
– Indique une situation potentiellement dangereuse susceptible
d’entraîner des blessures légères ou mineures si elle n’est pas évitée. Ce message
peut aussi servir de mise en garde contre les pratiques dangereuses.
– Indique une situation potentiellement dangereuse susceptible
d’entraîner des blessures graves voire la mort si elle n’est pas évitée.
– Indique une situation dangereuse imminente qui entraînera des
blessures graves voire la mort si elle n’est pas évitée. Cette mise en garde est limitée
aux situations les plus extrêmes.
À l’exception d’IMPORTANT, chaque alerte à la sécurité présente dans un document
Applied Biosystems est accompagnée d’un panneau triangulaire contenant un
symbole de danger. Ces symboles sont identiques à ceux figurant sur les instruments
Applied Biosystems.
Exemples
IMPORTANT ! Il convient de créer un tableur distinct pour la saisie des échantillons
de chaque plaque de réactions de 96 puits.
DANGER CHIMIQUE. Le réactif TaqMan® Universal PCR
Master Mix peut provoquer une irritation des yeux et de la peau. Toute exposition
peut entraîner un malaise en cas d’ingestion ou d’inhalation. Lire la fiche de données
de sécurité applicable et suivre les consignes de manipulation. Porter des protections
oculaires, des gants et des vêtements appropriés.
DANGER DE BLESSURE CORPORELLE. Lorsque
l’instrument est en fonctionnement, la température du couvercle chauffant et du bloc
peut dépasser 100 °C (212 °F).
DANGER ÉLECTRIQUE. L’usage permanent d’un dispositif de
mise à la terre est crucial pour la sécurité. Ne jamais utiliser le système lorsque le
dispositif de mise à la terre est déconnecté.
viii
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Préface
Informations supplémentaires
Documentation
relative
Le système StepOne est fourni avec les documents suivants :
Document
Réf. EN
Réf. FR
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Getting Started Guide for Genotyping Experiments
4376786
4377727
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments
4376787
4377726
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Getting Started Guide for Relative Standard Curve and
Comparative CT Experiments
4376785
4377744
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Getting Started Guide for Standard Curve Experiments
4376784
4377738
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Installation, Networking, and Maintenance Guide
4376782
4377800
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Installation Quick Reference Card
4376783
4377794
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Site Preparation Guide
4376768
4378361
—
—
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software Help
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
ix
Préface
Les documents suivants sont disponibles auprès de Applied Biosystems :
Document
Réf.
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol
4375575
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation
Performance Verification Protocol
4376791
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation
Qualification-Operation Qualification Protocol
4376790
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Planned Maintenance
Protocol
4376788
Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4334429
Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines
4367671
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol
4334431
Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol
4367218
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol
4312214
Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide
4362460
SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol
4304965
SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol
4310251
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol
4362038
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol
4308335
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol
4351891
TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4333458
TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol
4332856
TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
4304449
User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression
4303859
Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous
Control for Experimental Studies Application Note
127AP08
Remarque : Pour plus de renseignements sur la documentation, voir « Comment
obtenir une assistance » à la page xi.
Obtention
d’informations
dans l’aide du
logiciel
x
Le document Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software Help
(l’aide du logiciel StepOne™) décrit l’utilisation de chaque fonction de l’interface
utilisateur. Pour accéder à l’aide depuis le logiciel StepOne, procéder comme suit :
• Appuyer sur F1.
• Cliquer sur
dans la barre d’outils.
• Sélectionner Help (Aide)StepOne Help (Aide de StepOne) dans le menu.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Préface
Pour localiser un thème dans l’aide :
• Consulter la table des matières.
• Rechercher un thème spécifique.
• Rechercher dans un index alphabétique.
Envoi de
commentaires
Dans le but d’améliorer sa documentation, Applied Biosystems invite les utilisateurs
à lui faire part de leurs commentaires et suggestions. Merci de les envoyer par
courrier électronique à l’adresse :
techpubs@appliedbiosystems.com
IMPORTANT ! Cette adresse électronique est uniquement destinée à l’envoi de
commentaires et de suggestions sur la documentation. Pour commander des
documents, télécharger les fichiers PDF ou obtenir de l’aide sur une question
technique, visiter le site http://www.appliedbiosystems.com et cliquer sur le lien
Support (Assistance). (Voir « Comment obtenir une assistance » ci-dessous.)
Comment obtenir une assistance
Pour obtenir les dernières informations sur les services et le support technique dans
tous les pays, visiter le site http://www.appliedbiosystems.com et cliquer sur le lien
Support (Assistance).
La page Support (Assistance) permet d’effectuer les actions suivantes :
• Rechercher un sujet dans le forum aux questions (FAQ)
• Poser une question directement au support technique
• Commander des documents utilisateur Applied Biosystems, des fiches de
données de sécurité, des certificats d’analyse et d’autres documents relatifs
• Télécharger des documents au format PDF
• Obtenir des informations sur les formations proposées à nos clients
• Télécharger des mises à jour et correctifs de logiciels
La page Support (Assistance) présente également les numéros de téléphone et de
télécopie qui permettent de contacter le support technique et les sites commerciaux
Applied Biosystems partout dans le monde.
IMPORTANT ! Sur instruction de ce guide, ou pour programmer la maintenance de
l’instrument StepOne™ (par exemple les opérations de maintenance planifiée annuelle
ou de contrôle/calibration de la température), contacter le Centre de service clientèle
Applied Biosystems. Pour obtenir un numéro de téléphone ou envoyer un e-mail au
Centre, visiter le site http://www.appliedbiosystems.com/support/contact.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
xi
Préface
xii
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Introduction
1
1
Sommaire du chapitre :
À propos du système StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2
Configuration des expériences sur le système StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4
Sélection de l’application . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5
Sélection du type de réactif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6
Sélection du type d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
1-1
Chapitre 1 Introduction
À propos du système StepOne™
Le système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™ (système
StepOne™) s’appuie sur le principe de la réaction de polymérisation en chaîne
(PCR). Il utilise des réactifs PCR basés sur le principe de la fluorescence pour
assurer :
• La détection quantitative des séquences cible d’acide nucléique (cibles) par une
analyse en temps réel.
• La détection qualitative des séquences cible d’acide nucléique (cibles) par une
analyse en point final et une analyse de la courbe de fusion.
À propos de la
collecte de
données
Pendant la PCR, le système StepOne collecte les données de fluorescence brutes en
plusieurs points selon le type d’application :
Type d’application
Analyses en
temps réel
Quantification
absolue par les
courbes standard
Point de collecte de données
L’instrument collecte les données après chaque
étape d’extension de la PCR.
Quantification
relative par les
courbes standard
Comparaison des
valeurs de CT (∆∆CT)
Analyses en
point final
Génotypage
L’instrument collecte les données avant et après
la PCR. Il peut également collecter les données
pendant la PCR (en temps réel), ce qui s’avère
parfois utile pour corriger les imprécisions.
Présence/absence
L’instrument collecte les données avant et après
la PCR.
Indépendamment du type d’application, chaque point de collecte de données ou
lecture comporte trois phases :
1. Excitation – L’instrument StepOne™ illumine tous les puits de la plaque, ce qui
excite les fluorophores dans chaque réaction.
2. Émission – L’optique de l’instrument StepOne collecte la fluorescence résiduelle
émise par les puits de la plaque de PCR. L’image résultante, recueillie par le
dispositif, est uniquement composée de la lumière correspondant à l’intervalle
des longueurs d’ondes d’émission.
3. Collecte – L’instrument StepOne crée une représentation numérique de la
fluorescence résiduelle recueillie sur une période déterminée. Le logiciel
StepOne™ conserve l’image fluorescente brute en vue de l’analyse.
Après une réaction de PCR, le logiciel StepOne utilise les données de calibration
(spatiale, spectrale et du bruit de fond) pour déterminer l’emplacement et l’intensité
des signaux fluorescents à chaque lecture, le fluorophore associé à chaque signal
fluorescent et l’amplitude du signal.
1-2
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 1 Introduction
Consommables
compatibles
Le système StepOne est compatible avec les consommables et accessoires répertoriés
ci-dessous. Ils peuvent être utilisés avec les protocoles et réactifs standard et Fast.
Consommable
Référence
• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates
• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Cover
• 4375816
• 4375323
• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strips
• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strips
• 4358293
• 4323032
• MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps
• 4358297
• MicroAmp™ Fast 48-Well Trays
• MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor
• MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base
• 4375282
• 4375284
• 4312063
D
F
G
A
E
B
B
A
C
Réf.
C
C
Consommable
A
MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate
B
MicroAmp™ Fast 48-Well Tray
C
MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base
D
MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip
E
MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip
F
MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps
G
MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Cover
Pour plus
d’informations
Pour plus d’informations sur l’un des sujets abordés dans ce guide, consulter l’aide
dans le logiciel du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™ en
appuyant sur F1, en cliquant sur
dans la barre d’outils ou en sélectionnant Help
(Aide)StepOne Help (Aide de StepOne) dans le menu.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
1-3
Chapitre 1 Introduction
Configuration des expériences sur le système StepOne™
Workflow général
Avant de démarrer une expérience sur le système StepOne, elle doit être préparée
comme suit :
1. Sélectionner une application (page 1-5).
2. Sélectionner le type de réactif (page 1-6).
3. Sélectionner le type d’essai (page 1-7).
Contenu du guide
Ce chapitre fournit des informations générales sur les applications, de réactifs et
d’essais compatibles avec le système StepOne.
Les chapitres suivants fournissent des informations spécifiques :
Chapitre
Description
Chapitre 2, Présentation des
réactifs
• Décrit et compare les réactifs TaqMan® et
SYBR® Green.
• Fournit des informations sur la limitation des
contaminations d’ADN.
Chapitre 3, Expériences de
quantification
• Explique le fonctionnement de l’application.
• Fournit un workflow spécifique de l’application.
• Fournit des instructions de préparation pour
chaque type d’essai.
Chapitre 4, Réactions de
génotypage
Chapitre 5, Expériences de
présence/absence
1-4
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 1 Introduction
Sélection de l’application
Il est possible de mettre en œuvre les applications suivantes sur le système StepOne :
• Quantification, notamment :
– Quantification absolue par les courbes standard
– Quantification relative par les courbes standard
– Comparaison des valeurs de CT (∆∆CT)
• Génotypage
• Présence/absence
Remarque : Le système StepOne permet également d’effectuer une analyse de la
courbe de fusion.
Analyses en point
final vs analyses
en temps réel
Comme décrit ci-dessous, les trois applications peuvent être classées selon qu’elles
sont réalisées en temps réel ou en point final.
Catégorie
Propriétés
Application
Temps réel
• L’instrument mesure la progression de la
PCR. ‡
• Les données sont collectées tout au long de
la réaction de PCR.
• Les réactions sont caractérisées par le
moment où l’amplification d’une cible est
détectée pour la première fois pendant le
thermocyclage. §
Quantification
Point final
• Les données sont collectées à la fin du
processus PCR.
• Les réactions sont caractérisées par la
quantité de cible accumulée à la fin de la
PCR.§
• Le point de données est l’intensité normalisée
du reporter ou de la valeur Rn.
Génotypage
Présence/absence
Remarque : Certaines analyses en point final
incluent également des points de données préPCR. Si tel est le cas, le système calcule la
valeur delta Rn (∆Rn) avec la formule suivante :
Rn post-PCR – Rn pré-PCR = ∆Rn
‡ Kwok and Higuchi, 1989.
§ Saiki et al., 1985.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
1-5
Chapitre 1 Introduction
Sélection du type de réactif
Les types de réactifs suivants (chimies) sont compatibles avec le système StepOne :
• Les réactifs TaqMan®
• Les réactifs SYBR® Green
• Les autres réactifs basés sur le principe de la fluorescence
Réactifs TaqMan
Les réactifs TaqMan incluent les essais TaqMan® [mix prêts à l’emploi contenant les
amorces et la/les sonde(s)] et les master mix TaqMan®. Les réactifs TaqMan sont
compatibles avec les applications suivantes :
• Quantification, notamment :
– Quantification absolue par les courbes standard
– Quantification relative par les courbes standard
– Comparaison des valeurs de CT (∆∆CT)
• Génotypage
• Présence/absence
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Réactifs SYBR
Green
Les réactifs SYBR Green incluent des amorces et des master mix contenant le
fluorophore SYBR® Green. Les réactifs SYBR Green sont compatibles avec les
expériences de quantification de type :
• Quantification absolue par les courbes standard
• Quantification relative par les courbes standard
• Comparaison des valeurs de CT (∆∆CT)
Remarque : Il n’est pas possible d’effectuer la PCR multiplex avec les réactifs
SYBR Green. Pour plus d’informations, voir « Sélection de la PCR simplex ou
multiplex » à la page 3-10.
Autres réactifs
Il est possible d’utiliser d’autres réactifs basés sur le principe de la fluorescence sur
le système StepOne, sans toutefois perdre de vue les points suivants :
• Le logiciel StepOne calcule automatiquement les volumes réactionnels pour les
réactifs TaqMan et SYBR Green, mais pas pour les autres réactifs.
• L’expérience doit être créée à l’aide du workflow Advanced Setup
(Configuration avancée), plutôt qu’avec l’assistant de programmation
Design Wizard.
1-6
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 1 Introduction
Sélection du type d’essai
Dans le logiciel StepOne, il est possible de sélectionner les types d’essais suivants
pour les expériences de quantification, de présence/absence et de génotypage :
Application
Quantification ‡
Présence/absence
Génotypage
Type d’essai
Voir...
• En stock/fabriqué sur commande
• Personnalisé
ci-dessous
• Préconçu/validé
• Personnalisé
• Conçu par l’utilisateur
page 1-8
‡ Les expériences de quantification incluent les expériences de quantification absolue par les
courbes standard, de quantification relative par les courbes standard et par la comparaison
des valeurs de CT.
Expériences de
quantification et
de présence/
absence
Essais en stock/fabriqués sur commande
Pour les expériences de quantification ou de présence/absence, sélectionner le type
d’essai Inventoried/Made to Order (En stock/Fabriqué sur commande) dans le
logiciel StepOne si les essais suivants sont utilisés :
• Essais TaqMan® Gene Expression Assays, en stock – Ensembles préconçus
d’amorces et de sondes TaqMan® MGB (ligand du petit sillon) marquées par un
fluorophore FAM™ en stock. Le mix primers-sonde est disponible dans un tube
unique préformulé à 20✕.
• Essais TaqMan® Gene Expression Assays, fabriqués sur commande –
Ensembles préconçus d’amorces et de sondes TaqMan MGB marquées par un
fluorophore FAM, fabriqués au moment de la commande. Le mix primers-sonde
est disponible dans un tube unique préformulé à 20✕.
• Essais Custom TaqMan® Gene Expression Assays – Ensembles d’amorces et
de sondes TaqMan MGB marquées par un fluorophore FAM, conçus,
synthétisés et formulés par le service Custom TaqMan® Genomic Assays
d’après les informations de séquence transmises par l’utilisateur. Le mix
primers-sonde est disponible dans un tube unique, préformulé à 20✕ ou 60✕.
Remarque : Pour sélectionner le type d’essai dans le logiciel StepOne, accéder à
l’écran Reaction Setup (Préparation des réactions) dans le workflow de l’assistant de
programmation Design Wizard ou Advanced Setup (Configuration avancée), puis
sélectionner Inventoried/Made to Order (En stock/Fabriqué sur commande) dans le
menu déroulant Assay Type (Type d’essai).
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
1-7
Chapitre 1 Introduction
Essais personnalisés
Pour les expériences de quantification et de présence/absence si les essais TaqMan
ou SYBR Green (amorces et sondes) ont été dessinés avec le logiciel Primer
Express®, sélectionner le type d’essai Custom (Personnalisé) dans le logiciel
StepOne. Lors de la préparation des essais personnalisés, suivre les instructions de
préparation des essais d’Applied Biosystems pour optimiser les résultats.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Remarque : Pour sélectionner le type d’essai dans le logiciel StepOne, accéder à
l’écran Reaction Setup (Préparation des réactions) dans le workflow de l’assistant de
programmation Design Wizard ou Advanced Setup (Configuration avancée), puis
sélectionner Custom (Personnalisé) dans le menu déroulant Assay Type (Type
d’essai).
Réactions de
génotypage
Essais préconçus/validés
Pour les réactions de génotypage, le type d’essai préconçu/validé inclut les essais
suivants :
• Essais TaqMan® SNP Genotyping Assays – Ensembles préconçus d’amorces
et de sondes TaqMan® MGB (ligand du petit sillon) marquées par des
fluorophores FAM™ et VIC®, classés en deux catégories :
– Essais TaqMan® Validated & Coding SNP Genotyping Assays en stock.
Le mix primers-sonde est disponible dans un tube unique préformulé à 20✕.
– Essais TaqMan® Pre-Designed SNP Genotyping Assays, fabriqués au
moment de la commande (sur demande). Le mix primers-sonde est
disponible dans un tube unique préformulé à 20✕.
• Essais TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays – Ensembles
préconçus d’amorces et de sondes TaqMan MGB marquées par des
fluorophores FAM et VIC en stock. Le mix primers-sonde est disponible dans
un tube unique préformulé à 20✕.
• Essais Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination
(TaqMan® PDARs for AD) – Ensembles préconçus d’amorces et de sondes
TaqMan MGB marquées par des fluorophores FAM et VIC en stock. Le mix
primers-sonde est disponible dans un tube unique préformulé à 10✕.
Remarque : Pour sélectionner un essai SNP dans le logiciel StepOne, accéder à
l’écran SNP Assays (Essais SNP) dans le workflow de l’assistant de programmation
Design Wizard ou à l’écran Plate Setup (Configuration de la plaque) dans le
workflow Advanced Setup (Configuration avancée). Dans l’écran SNP Assays
(Essais SNP) ou Plate Setup (Configuration de la plaque), il est possible de
sélectionner un essai dans la bibliothèque ou d’en créer un nouveau.
1-8
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 1 Introduction
Essais personnalisés
Pour les réactions de génotypage, le type d’essai Custom (Personnalisé) inclut les
essais Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays. Ces essais sont des ensembles
d’amorces et de sondes TaqMan MGB marquées par des fluorophores FAM et VIC
conçus, synthétisés et formulés par le service Custom TaqMan® Genomic Assays
d’après les informations de séquence transmises par l’utilisateur. Le mix primerssonde est disponible dans un tube unique, préformulé à 40✕ ou 80✕.
Remarque : Pour sélectionner un essai SNP dans le logiciel StepOne, accéder à
l’écran SNP Assays (Essais SNP) dans le workflow de l’assistant de programmation
Design Wizard ou à l’écran Plate Setup (Configuration de la plaque) dans le
workflow Advanced Setup (Configuration avancée). Dans l’écran SNP Assays
(Essais SNP) ou Plate Setup (Configuration de la plaque), il est possible de
sélectionner un essai dans la bibliothèque ou d’en créer un nouveau.
Essais conçus par l’utilisateur
Pour créer des amorces et des sondes personnalisées destinées aux essais SNP, voir le
document Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
1-9
Chapitre 1 Introduction
1-10
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Présentation des réactifs
2
2
Sommaire du chapitre :
Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Réactifs TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Réactifs SYBR® Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4
Sélection du type de réactif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-5
Limitation des contaminations d’ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
2-1
Chapitre 2 Présentation des réactifs
Présentation
Applied Biosystems a développé deux types de réactifs (chimies) compatibles avec
la détection des produits de PCR sur le système de PCR en temps réel Applied
Biosystems StepOne™ :
• Les réactifs TaqMan® (ci-dessous)
• Les réactifs SYBR® Green (page 2-4)
Réactifs TaqMan®
Applications
Les réactifs TaqMan® incluent les essais TaqMan® [mix prêts à l’emploi contenant
les amorces et la/les sonde(s)] et les master mix TaqMan®. Les essais sont
spécifiques de la cible étudiée. Les master mix contiennent les autres composants
nécessaires à la réaction de PCR. Les réactifs TaqMan sont compatibles avec les
applications suivantes :
• Quantification, notamment :
– Quantification absolue par les courbes standard
– Quantification relative par les courbes standard
– Comparaison des valeurs de CT (∆∆CT)
• Génotypage
• Présence/absence
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Développement
des réactifs
TaqMan
Auparavant, des intercalants étaient utilisés pour quantifier les produits de PCR en
temps réel. Cette méthode avait pour inconvénient principal de détecter
l’accumulation des produits de PCR spécifiques et non spécifiques.
Les systèmes de PCR en temps réel ont été améliorés par l’introduction de sondes
marquées par un fluorophore qui utilisent l’activité 5′ nucléase de la Taq polymérase.
Ces sondes ont permis de développer une méthode qui ne détecte en temps réel que
les produits d’amplification spécifiques.
Fonctionnement
des réactifs
TaqMan
Les réactifs TaqMan utilisent une sonde marquée par un fluorophore pour détecter un
produit de PCR spécifique accumulé pendant la PCR. Ils fonctionnent d’après le
principe suivant :
1. Une sonde oligonucléotidique est marquée par un reporter fluorescent lié à
l’extrémité 5′ et un quencher lié à l’extrémité 3′.
Lorsque la sonde est intacte, la proximité du quencher réduit fortement la
fluorescence émise par le reporter du fait d’un transfert d’énergie dans l’espace
(technologie de FRET) (FRET; Förster resonance, Förster, V. T. 1948).
2. Si la séquence cible est présente, la sonde s’hybride entre les amorces, puis elle
est clivée par l’activité 5′ nucléase de la Taq polymérase pendant l’extension.
2-2
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 2 Présentation des réactifs
3. Le clivage de la sonde :
– Sépare le reporter du quencher en augmentant le signal du premier.
– Supprime la sonde du brin cible et permet à l’amorce de poursuivre son
extension jusqu’à la fin du brin modèle. Ainsi, l’ajout de la sonde ne bloque
pas le processus général de PCR.
4. Une quantité croissante des molécules du reporter est libérée à chaque cycle,
ce qui augmente l’intensité de la fluorescence proportionnellement à la quantité
d’amplicon produite. Plus le nombre de copies de la séquence cible est élevé au
départ, plus l’augmentation de la fluorescence est précoce.
La Figure 2-1 illustre ce processus.
DÉPLACEMENT DES BRINS
POLYMÉRISATION
5'
3'
AMORCE
SENS
R
SONDE
Q
3'
R
R = REPORTER
Q = QUENCHER
5'
5'
3'
5'
5'
3'
POLYMÉRISATION TERMINÉE
CLIVAGE
R
Q
R
Q
3'
5'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
Q
3'
5'
3'
5'
5'
3'
5'
AMORCE ANTI-SENS
Étape 1 : Un reporter (R) et
un quencher (Q) sont liés
aux extrémités 5′ et 3′
d’une sonde TaqMan®.
Étape 2 : Lorsque le
reporter et le quencher sont
liés à la sonde, l’émission
de reporter est désactivée.
Figure 2-1
Sondes TaqMan
MGB
Étape 3 : À chaque cycle
d’extension, la Taq
polymérase clive le
reporter de la sonde.
Étape 4 : Une fois séparé
du quencher, le reporter
émet une fluorescence
caractéristique.
Fonctionnement des réactifs TaqMan
D’une manière générale, Applied Biosystems recommande d’utiliser les sondes
TaqMan® MGB, surtout lorsque les sondes TaqMan® classiques dépassent
30 nucléotides. Les sondes TaqMan MGB contiennent :
• Un reporter fluorescent lié à l’extrémité 5′, qui génère un signal lorsqu’il est
clivé par l’activité 5′ nucléase de la Taq polymérase.
• Un quencher non fluorescent (NFQ) lié à l’extrémité 3′, qui permet aux
systèmes PCR en temps réel de mesurer les contributions du reporter de manière
plus précise car le quencher n’émet pas de fluorescence.
• Un ligand du petit sillon (MGB) lié à l’extrémité 3′, qui augmente la
température de fusion (Tm) de la sonde sans accroître sa longueur (Afonina
et al., 1997 ; Kutyavin et al., 1997), ce qui permet de créer des sondes plus
courtes. Par conséquent, les sondes TaqMan MGB présentent de plus grandes
différences de valeurs de Tm entre les sondes spécifiques et non spécifiques,
ce qui permet d’obtenir un génotypage précis.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
2-3
Chapitre 2 Présentation des réactifs
Applied Biosystems propose les sondes TaqMan MGB prédessinées suivantes,
compatibles avec le système StepOne™ :
Fluorophore 5′
Essais TaqMan® (sonde
TaqMan® MGB)
®
Expression génétique
Génotypage des SNP
Fluorophore 3′
Autres
caractéristiques
NFQ
MGB
NFQ
MGB
Fluorophore FAM™
™
®
Fluorophores FAM et VIC
™
Essais TaqMan
personnalisés (sonde
TaqMan ® MGB)
Expression génétique
Fluorophore FAM
NFQ
MGB
Génotypage des SNP
Fluorophores FAM™ et VIC®
NFQ
MGB
Sondes personnalisées
Sonde TaqMan® MGB
personnalisée
Fluorophore FAM™, TET™,
NED™ ou VIC®
NFQ
MGB
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Réactifs SYBR® Green
Applications
Les réactifs SYBR® Green incluent des amorces et des master mix contenant le
fluorophore SYBR® Green. Les réactifs SYBR Green sont compatibles avec les
expériences de quantification de type :
• Quantification absolue par les courbes standard
• Quantification relative par les courbes standard
• Comparaison des valeurs de CT (∆∆CT)
Remarque : Il n’est pas possible d’effectuer la PCR multiplex avec les réactifs
SYBR Green. Pour plus d’informations, voir « Sélection de la PCR simplex ou
multiplex » à la page 3-10.
Développement
des réactifs
SYBR Green
Les petites molécules qui se lient à l’ADN double brin se classent en deux catégories :
celles qui s’intercalent dans l’ADN et celles qui se lient au petit sillon de l’ADN.
Higuchi (Higuchi et al., 1992) utilisait le bromure d’éthidium comme intercalant
pour détecter les produits de PCR en temps réel. Hoechst 33258 est un exemple de
fluorophore ligand du petit sillon dont la fluorescence augmente lorsqu’il est lié à
l’ADN double brin (Higuchi et al., 1993).
Quelle que soit la méthode de liaison, au moins deux conditions sont requises pour
qu’un fluorophore ligand d’ADN mette en évidence les produits de PCR en temps
réel :
• Augmentation de la fluorescence lors de la liaison à l’ADN double brin
• Aucune inhibition de la PCR
Applied Biosystems a développé des conditions qui permettent d’utiliser le
fluorophore SYBR® Green I dans la PCR sans l’inhiber et pour lesquelles la
détection est plus sensible qu’avec le bromure d’éthidium.
2-4
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 2 Présentation des réactifs
Fonctionnement
des réactifs
SYBR Green
Les réactifs SYBR Green utilisent le fluorophore SYBR Green I pour détecter les
produits de PCR en créant une liaison avec l’ADN double brin formé pendant la
PCR. Ils fonctionnent d’après le principe suivant :
1. Lorsque le master mix SYBR® Green PCR est ajouté à un échantillon,
le fluorophore SYBR Green I est immédiatement lié à tous les ADN double brin.
2. Pendant la PCR, la polymérase AmpliTaq Gold® DNA Polymerase amplifie
la cible, ce qui crée le produit de PCR appelé « amplicon ».
3. Le fluorophore SYBR Green I se lie alors à chaque nouvelle copie d’ADN
double brin.
4. À mesure que la PCR progresse, le nombre d’amplicons créé augmente.
Puisque le fluorophore SYBR Green I se lie à tous les ADN double brin,
l’intensité de la fluorescence s’accroît proportionnellement à la quantité
de produit de PCR double brin obtenue.
La Figures 2-2 ci-dessous illustre ce processus.
Étape 1 : Préparation des réactions
Le fluorophore SYBR® Green 1 émet
une fluorescence lorsqu’il est lié à
l’ADN double brin.
Étape 2 : Dénaturation
Lorsque l’ADN est dénaturé,
le fluorophore SYBR® Green 1
est libéré et la fluorescence est
fortement réduite.
AMORCE
SENS
Étape 3 : Polymérisation
Lors de l’extension, les amorces
s’hybrident et le produit de PCR
est généré.
AMORCE
ANTI-SENS
Étape 4 : Polymérisation terminée
Le fluorophore SYBR® Green 1 se
lie au produit de PCR double brin,
entraînant une augmentation de la
fluorescence détectée par l’instrument.
Figure 2-2
Fonctionnement des réactifs SYBR Green
Sélection du type de réactif
Les réactifs TaqMan et SYBR Green sont compatibles avec les applications
indiquées ci-dessous.
Application
Quantification ‡
(chapitre 3)
Génotypage
(chapitre 4)
Présence/absen
ce (chapitre 5)
Réactifs SYBR® Green
Oui
Déconseillé
Déconseillé
Réactifs TaqMan®
Oui
Oui
Oui
Type de réactif
‡ Inclut les expériences de quantification absolue par les courbes standard, de quantification
relative par les courbes standard et par la comparaison des valeurs de CT.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
2-5
Chapitre 2 Présentation des réactifs
Éléments à
prendre en
compte pour les
expériences de
quantification
Les expériences de quantification peuvent être effectuées avec les réactifs TaqMan
ou SYBR Green. Prendre en compte les éléments suivants lors de la sélection du type
de réactif :
Type de réactif
Processus
Réactifs ou kits TaqMan®
PCR et détection de l’ADNc
a. Composants de l’essai
Description
MGB
Amorce anti-sens
Sonde
Les réactifs TaqMan utilisent une sonde
marquée par un fluorophore pour faciliter la
détection d’un produit de PCR spécifique
accumulé pendant les cycles de PCR.
Avantages
F
Amorce sens
3'
Q
5'
Matrice d’ADNc
ADNc
3'
5'
LÉGENDE
b. Matrice dénaturée et hybridation des composants de l’essai
• Augmentent la spécificité avec une
sonde. L’hybridation spécifique entre la
sonde et la cible génère le signal de
fluorescence.
• Permettent l’utilisation de la PCR
multiplex.
• Des essais préformulés et optimisés
pour des conditions de thermocyclage
universelles sont disponibles.
• Compatibles avec la RT-PCR 1 ou 2
étapes.
3'
5'
Amorce anti-sens
MGB
Sonde
F
RP
Amorce aléatoire
F
Fluorophore FAM™
Q
Quencher
Q
Amorce sens
3'
5'
c. Génération du signal
MGB
Ligand du petit
sillon
AmpliTaq Gold ®
DNA Polymerase
3'
5'
Sonde
Amorce anti-sens
Amorce
F
Amorce sens
MGB
5'
Q
3'
3'
5'
Matrice génétique
Extension
d’amorce
Inconvénients
Nécessitent la synthèse d’une sonde
unique
Réactifs SYBR® Green
Étape 1 : Préparation des réactions
Le fluorophore SYBR® Green 1 émet
une fluorescence lorsqu’il est lié à
l’ADN double brin.
Description
Les réactifs SYBR Green utilisent le
fluorophore SYBR® Green I, un fluorophore
de liaison à l’ADN double brin, pour
détecter les produits de PCR accumulés
pendant les cycles de PCR.
Étape 2 : Dénaturation
Lorsque l’ADN est dénaturé,
le fluorophore SYBR® Green 1
est libéré et la fluorescence est
fortement réduite.
Avantages
• Économiques (aucune sonde requise).
• Permettent, grâce à l’analyse de la
courbe de fusion, de mesurer le Tm de
tous les produits de PCR.
• Compatibles avec la RT-PCR 1 ou 2
étapes.
Inconvénients
Se lient de manière non spécifique à toutes
les séquences d’ADN double brin. Pour
éviter les signaux faux positifs, vérifier
qu’aucun produit non spécifique ne se
forme en analysant la courbe de fusion ou
le dépôt sur le gel.
AMORCE
SENS
Étape 3 : Polymérisation
Lors de l’extension, les amorces
s’hybrident et le produit de PCR
est généré.
AMORCE
ANTI-SENS
Étape 4 : Polymérisation terminée
Le fluorophore SYBR® Green 1 se
lie au produit de PCR double brin,
entraînant une augmentation de la
fluorescence détectée par l’instrument.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
2-6
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 2 Présentation des réactifs
Limitation des contaminations d’ADN
Le processus d’amplification d’ADN par PCR impose des pratiques de laboratoires
précises lors de la préparation d’une expérience avec les réactifs TaqMan ou SYBR
Green. Les contaminations peuvent provenir d’échantillons aux concentrations
d’ADN élevées, tels que les échantillons d’ADN contrôle ou les produits de PCR.
En outre, en raison de la nature non spécifique du fluorophore SYBR Green I, tout
ADN double brin sera détecté. Lorsque les réactifs SYBR Green sont utilisés,
vérifier qu’aucun produit non spécifique ne se forme en analysant la courbe de
fusion ou le dépôt sur le gel. Éviter toute contamination par l’ADN cible. Les essais
d’expression génétique ciblant les jonctions exon-exon limitent les effets dus à
l’ADNg (ADN génomique) contaminant.
Utilisation de
l’UNG pour limiter
la réamplification
des produits de
PCR
contaminants
L’AmpErase® uracil-N-glycosylase (UNG) est une enzyme recombinante de 26-kDa
codée par le gène Escherichia coli uracil-N-glycosylase. Ce gène a été inséré dans un
hôte E. coli pour induire l’expression de la forme native de l’enzyme (Kwok and
Higuchi, 1989).
L’UNG agit sur l’ADN simple et double brin qui contient des dUTP. Il hydrolyse les
liaisons uracil-glycosidiques sur les sites d’ADN contenant des dUTP. L’enzyme
libère l’uracile, ce qui crée un site apyrimidique sensible aux alcalins dans l’ADN.
L’enzyme n’a pas d’activité sur l’ARN ou l’ADN contenant des dTTP (Longo et al.,
1990).
Essais TaqMan
Avec les essais TaqMan®, le traitement par l’AmpErase® UNG peut empêcher la
réamplification des produits de PCR contaminants provenant des réactions de PCR
précédentes. Lorsque le dUTP remplace le dTTP durant l’amplification par PCR,
l’AmpErase UNG peut supprimer jusqu’à 200 000 copies d’amplicon par 50-µL de
réaction.
Remarque : Le master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR est disponible avec ou sans
l’enzyme AmpErase UNG. Si l’expérience est réalisée avec le master mix TaqMan®
Fast Universal PCR (2✕), No AmpErase® UNG, l’AmpErase UNG doit être achetée
séparément.
Essais SYBR Green I
Avec les essais SYBR Green I, le traitement par l’AmpErase UNG peut empêcher la
réamplification des produits de PCR contaminants provenant des réactions de PCR
précédentes. Bien que les master mix Power SYBR® Green PCR et SYBR® Green
PCR ne contiennent pas l’enzyme AmpErase UNG, ils contiennent du dUTP et sont
donc compatibles avec l’AmpErase UNG. En cas de suspicion de contamination par
transfert de produits de PCR, utiliser l’AmpErase UNG pour remédier au problème.
Remarque : L’AmpErase UNG peut être achetée séparément ou avec le kit
SYBR® Green PCR Core Reagents Kit.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
2-7
Chapitre 2 Présentation des réactifs
Pratiques
générales de la
PCR
2-8
Respecter les précautions suivantes pour limiter la contamination des échantillons et
le transfert de produits de PCR :
• Porter une blouse de laboratoire propre (non utilisée précédemment pendant la
manipulation de produits de PCR amplifiés ou la préparation des échantillons)
et des gants propres lors de la préparation des échantillons pour l’amplification
par PCR. Changer de gants chaque fois qu’il existe une suspicion de
contamination.
• Utiliser des zones séparées, du matériel dédié et des accessoires distincts pour :
– La préparation des échantillons.
– La préparation de la réaction de PCR. Ne jamais introduire de produit de
PCR dans la zone de préparation de la réaction de PCR.
– L’amplification par PCR.
– L’analyse des produits de PCR.
• Ouvrir et fermer soigneusement tous les tubes d’échantillons. Éviter toute
projection ou émanation des produits de PCR.
• Utiliser des multipipettes à piston ou à air comprimé avec des cônes filtrés.
Changer les cônes après chaque utilisation.
• Maintenir autant que possible les réactions et les composants fermés.
• Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une
solution à 10 % d’eau de javel ou à 70 % d’éthanol.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Expériences de quantification
3
3
Sommaire du chapitre :
Section 3.1 À propos des expériences de quantification . . . . . . 3-3
Section 3.2 Instructions de préparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-15
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-1
Chapitre 3 Expériences de quantification
3-2
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Section 3.1 À propos des expériences de
quantification
Sommaire de la section :
Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4
Sélection de la méthode de quantification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5
Sélection de la RT-PCR 1 ou 2 étapes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8
Sélection de la PCR simplex ou multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10
Sélection du type de réactif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12
Sélection du type d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-3
Chapitre 3 Expériences de quantification
Présentation
Qu’est-ce qu’une
expérience de
quantification ?
Une expérience de quantification est une expérience en temps réel qui mesure la
quantité d’une séquence d’acide nucléique cible (cible) à chaque cycle d’amplification
de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). La cible peut être l’ADN, l’ADNc
ou l’ARN.
Trois applications de quantification sont traitées dans ce guide :
• Quantification absolue par les courbes standard (page 3-5)
• Quantification relative par les courbes standard (page 3-5)
• Comparaison des valeurs de CT (∆∆CT) (page 3-6)
Fonctionnement
d’une expérience
de quantification
Dans les expériences de quantification en temps réel, les réactions sont caractérisées
par le moment du thermocyclage où l’amplification d’un produit de PCR atteint un
niveau de fluorescence défini, plutôt que par la quantité finale de produit de PCR
accumulée après un nombre de cycles défini. Une courbe d’amplification affiche
sous forme graphique la fluorescence détectée en fonction du nombre de cycles
effectués.
Les premiers cycles de PCR ne comportent aucune modification significative du signal
de fluorescence. Cet intervalle de cycles de PCR prédéfini est appelé ligne de base.
Le logiciel commence par générer une courbe d’amplification soustraite de la ligne de
base en calculant la tendance mathématique du signal du reporter fluorescent normalisé
(valeurs Rn pour les cycles définissant la ligne de base). Un algorithme recherche
ensuite le point d’intersection entre la courbe d’amplification représentant le signal du
reporter fluorescent normalisé, corrigé d’après la ligne de base (valeur delta Rn [∆Rn]),
et le seuil. Le nombre de cycles pour lequel la valeur ∆Rn croise le seuil est défini
comme valeur CT.
Workflow
Avant d’effectuer une expérience de quantification sur le système de PCR en temps
réel Applied Biosystems StepOne™, elle doit être préparée comme suit :
1. Sélectionner une méthode de quantification (page 3-5).
2. Sélectionner la RT-PCR 1 ou 2 étapes (page 3-8).
3. Sélectionner des réactions de PCR simplex ou multiplex (page 3-10).
4. Sélectionner le type de réactif (page 3-12).
5. Sélectionner le type d’essai (page 3-12).
6. Consulter les instructions de préparation selon le type d’essai sélectionné
(Section 3.2 à la page 3-15).
3-4
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Sélection de la méthode de quantification
À propos des
expériences de
quantification
absolue par les
courbes standard
Les expériences de quantification absolue par les courbes standard déterminent la
quantité absolue d’une cible dans un échantillon. Une courbe standard créée à partir
d’une gamme de dilutions de quantité connue est utilisée pour obtenir les résultats.
Composants
Les réactions de PCR pour les expériences de quantification absolue par les courbes
standard incluent les composants suivants :
• Échantillon – Échantillon dans lequel la quantité de cible est inconnue.
• Standard – Échantillon de quantité connue.
• Gamme de dilutions standard – Gamme de dilutions du standard (par exemple
1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) utilisé pour établir une courbe standard.
• Réplicats – Réactions identiques contenant des composants et des volumes
identiques.
• Contrôles négatifs – Échantillons qui contiennent de l’eau ou du tampon à la
place de l’échantillon, également appelés contrôles sans échantillon (NTC – No
Template Control). Les contrôles négatifs ne doivent pas être amplifiés.
À propos des
expériences de
quantification
relative par les
courbes standard
Les expériences de quantification relative par les courbes standard déterminent les
variations d’expression d’une cible dans un échantillon comparé à un échantillon de
référence. Une courbe standard créée à partir d’une gamme de dilutions de quantité
connue est utilisée pour obtenir les résultats.
Les expériences de quantification relative par les courbes standard sont couramment
utilisées pour :
• Comparer les niveaux d’expression d’un gène dans différents tissus.
• Comparer les niveaux d’expression d’un gène entre un échantillon traité et un
échantillon non traité.
• Comparer les niveaux d’expression entre des allèles sauvages et des allèles
mutés.
Composants
Les réactions de PCR pour les expériences de quantification relative par les courbes
standard incluent les composants suivants :
• Échantillon – Échantillon dans lequel la quantité de cible est inconnue.
• Échantillon de référence – Échantillon utilisé comme base de comparaison des
résultats. Par exemple, dans une étude relative aux effets des médicaments sur
l’expression génétique, un contrôle non traité peut constituer un bon échantillon
de référence.
• Standard – Échantillon de quantité connue.
• Gamme de dilutions standard – Gamme de dilutions du standard (par exemple
1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) utilisé pour établir une courbe standard. Pour tous les
échantillons, la quantité de cible est déterminée en interpolant la courbe
standard, puis en divisant par la quantité de cible de l’échantillon de référence.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-5
Chapitre 3 Expériences de quantification
L’échantillon de référence étant l’échantillon 1✕, toutes les autres quantités sont
exprimées sous la forme d’une variation d’expression d’un facteur n comparé à
celui-ci. En outre, l’unité de la courbe standard n’est pas prise en compte car la
quantité de l’échantillon est divisée par la quantité de l’échantillon de référence.
Par conséquent, il suffit juste de connaître la dilution relative des standards.
Tout ADNc, ARN ou ADN contenant la cible appropriée peut être utilisé
comme standard.
• Contrôle endogène – Gène présent à un niveau d’expression similaire dans tous
les échantillons. Le contrôle endogène est utilisé pour normaliser les éventuelles
variations, liées à une imprécision de pipetage, de la quantité d’ADNc ajoutée à
chaque réaction.
• Réplicats – Réactions identiques contenant des composants et des volumes
identiques.
• Contrôles négatifs – Échantillons qui contiennent de l’eau ou du tampon à la
place de l’échantillon, également appelés contrôles sans échantillon (NTC – No
Template Control). Les contrôles négatifs ne doivent pas être amplifiés.
À propos des
expériences de
quantification
relative par la
méthode de
comparaison des
valeurs de CT
Les expériences de quantification relative par la méthode de comparaison des valeurs
de CT (∆∆CT) déterminent les variations d’expression d’une cible dans un échantillon
comparé à un échantillon de référence. Une formule arithmétique est utilisée pour
obtenir les résultats (voir « Formule pour les expériences de quantification relative
par la méthode de comparaison des valeurs de CT (∆∆CT) » à la page A-1).
Les expériences de quantification relative par la méthode de comparaison des valeurs
de CT sont couramment utilisées pour :
• Comparer les niveaux d’expression d’un gène dans différents tissus.
• Comparer les niveaux d’expression d’un gène entre un échantillon traité et un
échantillon non traité.
• Comparer les niveaux d’expression entre des allèles sauvages et des allèles
mutés.
Composants
Les réactions de PCR pour les expériences de quantification relative par la méthode
de comparaison des valeurs de CT incluent les composants suivants :
• Échantillon – Échantillon dans lequel la quantité de cible est inconnue.
• Échantillon de référence – Échantillon utilisé comme base de comparaison des
résultats. Par exemple, dans une étude relative aux effets des médicaments sur
l’expression génétique, un contrôle non traité peut constituer un bon échantillon
de référence.
• Contrôle endogène – Gène présent à un niveau d’expression similaire dans tous
les échantillons. Le contrôle endogène est utilisé pour normaliser les éventuelles
variations, liées à une imprécision de pipetage, de la quantité d’ADNc ajoutée à
chaque réaction.
• Réplicats – Réactions identiques contenant des composants et des volumes
identiques.
3-6
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
• Contrôles négatifs – Échantillons qui contiennent de l’eau ou du tampon à la
place de l’échantillon, également appelés contrôles sans échantillon (NTC – No
Template Control). Les contrôles négatifs ne doivent pas être amplifiés.
Comparaison des
méthodes de
quantification
Application
Prendre en compte les éléments suivants lors du choix entre expérience de
quantification absolue par les courbes standard, de quantification relative par les
courbes standard et par la comparaison des valeurs de CT :
Description
Avantages
Inconvénients
Quantification
absolue par les
courbes
standard
Utilise une courbe standard
pour déterminer la quantité
absolue d’une cible dans un
échantillon. Généralement
utilisée pour quantifier la
charge virale.
Permet de comparer avec des
quantités de standard
connues.
Une courbe standard doit être
créée pour chaque cible,
ce qui nécessite davantage de
réactifs et d’espace dans la
plaque de réactions.
Quantification
relative par les
courbes
standard
Utilise une courbe standard
pour déterminer les variations
d’expression d’une cible dans
un échantillon comparé à un
échantillon de référence.
Recommandée pour les essais
dont l’efficacité PCR n’est pas
optimale.
Nécessite le moins d’efforts de
validation car l’efficacité PCR
ne doit pas nécessairement
être équivalente pour la cible et
le contrôle endogène.
Une courbe standard doit
être créée pour chaque cible,
ce qui nécessite davantage de
réactifs et d’espace dans la
plaque de réactions.
Comparaison
des valeurs de
CT (∆∆CT)
Utilise des formules
arithmétiques pour déterminer
les variations d’expression
d’une cible dans un échantillon
comparé à un échantillon de
référence. Recommandée pour
la quantification relative de
l’expression génétique de
plusieurs gènes dans de
nombreux échantillons.
• Les niveaux relatifs de cible
des échantillons peuvent
être déterminés sans utiliser
de courbe standard, sous
réserve que l’efficacité PCR
soit à peu près équivalente
pour la cible et le contrôle
endogène.
• Quantité limitée de réactifs
utilisés.
• Plus d’espace disponible
dans la plaque de réactions.
• Des essais suboptimaux
(efficacité PCR faible)
peuvent donner des
résultats imprécis.
• Avant d’utiliser la méthode
de comparaison des valeurs
de CT, Applied Biosystems
recommande de déterminer
si l’efficacité de la PCR est
à peu près équivalente pour
le gène cible et le gène de
référence endogène.
Pour plus
d’informations
Pour plus d’informations sur les méthodes de quantification, voir le document User
Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-7
Chapitre 3 Expériences de quantification
Sélection de la RT-PCR 1 ou 2 étapes
La RT-PCR (rétro-transcription-réaction de polymérisation en chaîne) est utilisée
pour quantifier l’ARN. La RT-PCR peut être effectuée en 1 ou 2 étapes.
À propos de la
RT-PCR
1 étape
Dans la RT-PCR 1 étape, effectuer la rétro-transcription et la PCR dans un système à
tampon unique (Figure 3-1). La réaction se produit sans ajout de réactifs entre les
étapes RT et PCR. La RT-PCR 1 étape permet de ne préparer qu’un seul tube pour la
RT et l’amplification par PCR. Toutefois, il n’est pas possible d’utiliser l’enzyme de
prévention des contaminations par transfert, l’AmpErase® uracil-N-glycosylase
(UNG), avec la RT-PCR 1 étape. En effet, la présence de l’UNG détruirait l’ADNc à
mesure de sa formation. Pour plus d’informations sur l’UNG, voir « Utilisation de
l’UNG pour limiter la réamplification des produits de PCR contaminants » à la
page 2-7.
Tube
unique
Figure 3-1
À propos de la
RT-PCR
2 étapes
3-8
Représentation schématique de la RT-PCR 1 étape
La RT-PCR 2 étapes est effectuée dans deux réactions distinctes : une pour la RT et
une pour la PCR (Figure 3-2). La RT-PCR 2 étapes permet de détecter plusieurs
transcrits d’une même réaction d’ADNc ou de stocker une partie de l’ADNc pour
une utilisation ultérieure. Lors de la réalisation de la PCR en présence de dUTP, il est
possible d’utiliser l’enzyme AmpErase® UNG pour empêcher la contamination par
transfert. Pour plus d’informations sur l’UNG, voir « Utilisation de l’UNG pour
limiter la réamplification des produits de PCR contaminants » à la page 2-7.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Tube 1
Oligo d(T) ou hexamère aléatoire
Tube 2
Figure 3-2
Amorces utilisées
pour la synthèse
de l’ADNc
Étape PCR
Représentation schématique de la RT-PCR 2 étapes
Dans la RT-PCR 1 étape, les amorces anti-sens spécifiques de la séquence peuvent
être utilisées pour la synthèse de l’ADNc.
Dans la RT-PCR 2 étapes, les amorces suivantes peuvent être utilisées pour la
synthèse de l’ADNc :
• Oligo d(T)16
• Amorces aléatoires
• Amorces anti-sens spécifiques de la séquence
Le choix des amorces pour la rétro-transcription est facilité par l’évaluation
expérimentale des trois systèmes d’amorçage. Pour les séquences ARN courtes sans
structure secondaire, les trois systèmes d’amorçage produisent des résultats
équivalents. Pour les transcrits ARN plus longs ou les séquences présentant des
structures secondaires, voir les instructions suivantes :
Amorces
Instructions de sélection
Oligo d(T)16
• S’utilise pour effectuer une transcriptase inverse des ARNm
eucaryotes et des rétrovirus avec queue poly-A uniquement
• Évite les transcrits ARNm longs ou les amplicons supérieurs à
2 kilobases en amont du site poly-A
Amorces aléatoires
• S’utilisent d’abord avec les transcrits inverses longs ou ceux
qui contiennent des structures secondaires
• S’utilisent pour transcrire tous les ARN (ARNr, ARNm et ARNt)
Amorces anti-sens
spécifiques de la
séquence
• S’utilisent pour effectuer la transcriptase inverse des ARN
contenant les séquences complémentaires uniquement
• S’utilisent dans la RT-PCR 1 étape
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-9
Chapitre 3 Expériences de quantification
Comparaison
des méthodes
de RT-PCR
Méthode
RT-PCR
1 étape
Amorce utilisée pour la synthèse
de l’ADNc
Amorce anti-sens spécifique de la
séquence
Commentaires
Nécessite un seul mélange
réactionnel
L’enzyme AmpErase® UNG ne peut
pas être utilisée
RT-PCR
2 étapes
Hexamères aléatoires
L’ADNc peut être conservé pour une
utilisation ultérieure
Oligo d(T)16
L’enzyme AmpErase® UNG peut
être utilisée
Amorces anti-sens spécifiques de
la séquence
Nécessite deux mélanges
réactionnels
Sélection de la PCR simplex ou multiplex
Il est possible d’effectuer une réaction de PCR sous la forme d’une réaction :
• PCR simplex – Pour les expériences de quantification absolue par les courbes
standard, de quantification relative par les courbes standard et par la
comparaison des valeurs de CT. Dans la PCR simplex, un ensemble d’amorces
unique est présent dans le tube de réaction ou le puits. Une seule cible ou un seul
contrôle endogène peut être amplifié par réaction.
ou
• PCR multiplex – Pour les expériences de quantification relative par la méthode
de comparaison des valeurs de CT. Dans la PCR multiplex, au moins deux
ensembles d’amorces sont présents dans le puits ou le tube de réaction. Chaque
ensemble amplifie spécifiquement une cible ou un contrôle endogène.
Généralement, une sonde marquée par un fluorophore FAM™ détecte la cible et
une sonde marquée par un fluorophore VIC® détecte le contrôle endogène.
IMPORTANT ! Les réactifs SYBR® Green ne sont pas validés pour la PCR
multiplex.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore
TAMRA™ comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
PCR simplex
3-10
PCR multiplex
Couple d’amorces
de la cible
Couple d’amorces du
contrôle endogène
ADNc
GR2331
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
PCR multiplex
pour les
expériences de
quantification
relative par la
méthode de
comparaison des
valeurs de CT
Pour effectuer la PCR multiplex dans les expériences de quantification relative par la
méthode de comparaison des valeurs de CT :
• Vérifier que le contrôle endogène sélectionné est plus abondant (valeur CT
inférieure) que toutes les cibles à quantifier, quelles que soient les conditions.
• Quantifier le contrôle endogène avec un essai limité en amorces. L’essai du
contrôle endogène (pour le modèle le plus abondant) de chaque réaction doit
contenir une quantité d’amorces limitée pour éviter la PCR compétitive qui peut
altérer la valeur CT du gène le moins abondant.
Limitation de l’amorce dans la PCR multiplex
Pour générer une quantification en multiplex précise, il est important que
l’amplification d’une espèce ne domine pas l’autre. Sinon, l’amplification d’une
espèce très abondante peut empêcher celle de l’espèce moins abondante.
Si l’espèce la moins abondante n’est pas amplifiée efficacement, l’expérience peut
produire des résultats imprécis ou, dans les cas extrêmes, la détection de l’espèce la
moins abondante peut être totalement inhibée. Cette situation peut être évitée en
limitant la concentration des amorces utilisées pour amplifier l’espèce la plus
abondante, ce qui « désamorce » l’amplification aussitôt après la détermination de la
valeur CT. Toutefois, un essai limité en amorces peut être plus sensible aux
fluctuations selon les conditions de réaction que l’essai cible non limité en amorces
qu’il normalise. Pour plus d’informations, voir Annexe B, « Limitation des amorces
dans la PCR multiplex. ».
PCR simplex vs PCR multiplex
La limitation des amorces dans la PCR multiplex devient de plus en plus complexe à
mesure que le nombre de cibles à quantifier augmente. Lors de l’analyse de plusieurs
cibles, il est parfois plus simple d’utiliser la PCR simplex pour les raisons suivantes :
• Dans la PCR multiplex, il peut être difficile de trouver un contrôle endogène
adéquat :
– plus abondant que toutes les cibles à quantifier ;
– qui ne modifie pas les niveaux d’expression selon les conditions d’expérience
ou avec différents échantillons.
Il convient d’effectuer d’abord toutes les quantifications de la cible et du
contrôle endogène dans les PCR multiplex et simplex, puis de comparer les
valeurs CT des deux méthodes afin de déterminer les conséquences du
multiplexage sur les valeurs CT.
• Dans la PCR simplex, les cibles qui ne modifient pas les niveaux d’expression
selon les conditions d’expérience ou sur plusieurs échantillons peuvent servir de
contrôle endogène. Par conséquent, plus le nombre de cibles étudiées en
simplex est important, plus la probabilité est élevée d’avoir au moins un
contrôle endogène adéquat pour normaliser les cibles restantes.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-11
Chapitre 3 Expériences de quantification
Prendre en compte les éléments suivants au moment de choisir entre PCR multiplex
et PCR simplex pour les expériences de quantification relative par la méthode de
comparaison des valeurs de CT :
PCR
Description
Avantages
Inconvénients
Simplex
Réaction dans laquelle
une cible ou un contrôle
endogène unique est
amplifié dans le puits
ou le tube de réaction.
• Ne requiert pas d’optimisation
pour les essais TaqMan®.
• Les cibles qui ne modifient pas les
niveaux d’expression selon les
conditions d’expérience ou sur
plusieurs échantillons peuvent
servir de contrôle endogène.
• Possibilité d’utiliser des réactifs
TaqMan® ou SYBR® Green.
• Requiert un échantillon pour la
cible et un pour le contrôle
endogène.
Multiplex
Réaction dans laquelle
plusieurs cibles ou
contrôles endogènes
sont amplifiés dans le
puits ou le tube de
réaction.
• Réduit les coûts et la nécessité
d’un pipetage précis lors de la
séparation d’un échantillon dans
deux tubes distincts.
• La quantification du contrôle
endogène doit être exécutée sous
la forme d’un essai limité en
quantité d’amorces.
• Requiert une validation et une
optimisation.
• Peut s’avérer moins simple que la
PCR simplex lors de l’analyse de
plusieurs cibles.
• Les réactifs SYBR® Green ne sont
pas compatibles.
Sélection du type de réactif
Réactifs TaqMan
vs réactifs SYBR
Green
Les expériences de quantification sont possibles sur le système StepOne avec :
• Les réactifs TaqMan®
• Les réactifs SYBR® Green
Pour plus d’informations sur le choix entre réactif TaqMan ou SYBR Green, voir
« Éléments à prendre en compte pour les expériences de quantification » à la
page 2-6.
Sélection du type d’essai
Lors de la création d’une expérience avec le logiciel StepOne, il est possible de
sélectionner les types d’essais suivants pour les expériences de quantification :
• En stock/fabriqués sur commande (page 3-13)
• Personnalisés (page 3-14)
Cette section répertorie les produits disponibles pour chaque type d’essai.
Remarque : Les essais sont spécifiques de la cible étudiée. Les master mix
contiennent les autres composants nécessaires à la réaction de PCR.
3-12
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Essais en
stock/fabriqués
sur commande
Produit
Attributs
Essais TaqMan® Gene
Expression Assays
• Ensembles préconçus d’amorces et de sondes
spécifiques pour les gènes de l’homme, de la souris,
du rat, de Arabidopsis, Drosophila, C. elegans,
C. familiares (chien) et Rhésus.
• Format prêt à l’emploi en un seul tube, disponible sous la
forme d’essais en stock ou fabriqués sur commande.
Essais TaqMan®
Endogenous Control
Assays
• Essais de contrôle endogène optimisés, préformulés et
prêts à l’emploi.
• Quantification économique de l’expression génétique
pour l’homme, la souris, le rat, les espèces Arabidopsis,
Drosophila et toutes les espèces eucaryotes.
• Choix entre les fluorophores FAM™ et VIC® (limité en
amorces).
Remarque : Les essais
TaqMan Endogenous
Control Assays existent
sous la forme d’essais
TaqMan Gene Expression
en stock.
Essais Custom TaqMan®
Gene Expression Assays
• Tous les organismes ou espèces.
• Choix de la cible.
• Format prêt à l’emploi en un seul tube.
Master mix TaqMan® 2✕
Universal PCR (avec ou
sans AmpErase® UNG)
• Performances optimales pour les quantifications en
TaqMan® à partir d’échantillons d’ADNc ou d’ADN.
• Contient des composants qui assurent d’excellentes
performances aux essais.
• L’utilisation d’un seul réactif pour tous les essais simplifie
le processus expérimental.
Master mix TaqMan® Fast
Universal PCR (2✕),
No AmpErase® UNG
• Mêmes attributs que le master mix TaqMan® 2✕ Universal
PCR (voir ci-dessus).
• Permet d’effectuer une expérience de quantification sur le
système StepOne™ en 35 min environ.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Pour obtenir des instructions de préparation des expériences avec des essais en
stock/fabriqués sur commande, voir page 3-16.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-13
Chapitre 3 Expériences de quantification
Essais
personnalisés
Produit
Attributs
Sondes et amorces
TaqMan® personnalisées
• Tous les organismes ou espèces.
• Choix des fluorophores, quenchers et échelles de
synthèse.
• Compatibles avec le logiciel Primer Express® et les
instructions de préparation des essais d’Applied
Biosystems.
Logiciel Primer Express®
Logiciel de dessin d’amorces et de sondes pour la PCR en
temps réel.
Master mix TaqMan® 2✕
Universal PCR (avec ou
sans AmpErase® UNG)
• Performances optimales pour les quantifications en
TaqMan® à partir d’échantillons d’ADNc ou d’ADN.
• Contient des composants qui assurent d’excellentes
performances aux essais.
• L’utilisation d’un seul réactif pour tous les essais simplifie
le processus expérimental.
Master mix TaqMan® Fast
Universal PCR (2✕),
No AmpErase® UNG
• Mêmes attributs que le master mix TaqMan® 2✕ Universal
PCR (voir ci-dessus).
• Permet d’effectuer une expérience de quantification sur le
système StepOne™ en 35 min environ.
Power SYBR® Green
PCR Master Mix
• Quantification particulièrement sensible permettant la
détection d’un faible nombre de copies (à partir de deux
copies d’un gène cible).
• Détecte l’ADN double brin, une sonde spécifique n’est
donc pas requise.
• Contient la polymérase AmpliTaq Gold® DNA Polymerase
LD hautement purifiée pour limiter la formation de produit
non spécifique (notamment les dimères d’amorces).
• Compatible avec le logiciel Primer Express® et les
instructions de préparation des essais d’Applied
Biosystems.
SYBR® Green PCR
Master Mix
• Détecte l’ADN double brin, une sonde spécifique n’est
donc pas requise.
• Pour les applications standard qui ne requièrent pas de
sensibilité élevée.
• Contient la polymérase AmpliTaq Gold® DNA Polymerase
pour limiter la formation de produit non spécifique
(notamment les dimères d’amorces).
• Compatible avec le logiciel Primer Express® et les
instructions de préparation des essais d’Applied
Biosystems.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Pour obtenir des instructions de préparation des expériences avec des essais
personnalisés, voir page 3-20.
3-14
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Section 3.2 Instructions de préparation
Sommaire de la section :
Essais en stock/fabriqués sur commande . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16
Essais TaqMan®Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16
Essais Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
Sélection du master mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-19
Conception de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20
Essais personnalisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20
Création d’amorces et de sondes à l’aide du logiciel Primer Express® . . . .
Sélection des réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Utilisation des conditions de thermocyclage recommandées . . . . . . . . . . .
Optimisation des concentrations d’amorces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Optimisation de la concentration de sonde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Pour plus d’informations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-21
3-24
3-26
3-29
3-33
3-35
3-15
Chapitre 3 Expériences de quantification
Essais en stock/fabriqués sur commande
Workflow
Si le type d’essai sélectionné dans le logiciel StepOne™ est Inventoried/Made to
Order (En stock/Fabriqué sur commande), Applied Biosystems recommande de
suivre le workflow ci-dessous :
1. Sélectionner l’essai :
• Essais TaqMan® Gene Expression Assays (ci-dessous).
• Essais Custom TaqMan® Gene Expression Assays (page 3-18).
2. Sélectionner le master mix (page 3-19).
3. Créer l’expérience à l’aide du logiciel StepOne (page 3-20).
Essais TaqMan®Gene Expression Assays
Description des
produits
Les essais TaqMan® Gene Expression Assays comprennent une gamme complète
d’ensembles d’amorces et de sondes en stock et fabriqués sur commande pour
effectuer des expériences de quantification sur les gènes de l’homme, de la souris,
du rat, de Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (chien) et Rhésus.
Chaque essai est créé à l’aide d’un processus automatisé soumis à des contrôles
qualité. Les essais en stock sont fabriqués et intégrés aux réserves. Les essais
fabriqués sur commande sont préconçus et fabriqués lors de la commande.
Propriétés des
produits
3-16
Tous les essais TaqMan Gene Expression Assays :
• Nécessitent trois composants :
– 1 à 100 ng d’échantillon d’ADNc (converti à partir d’ARN) par puits, avec la
même quantité d’ADNc dans chaque puits de l’étude.
– Mélange 20✕ Gene Expression Assay Mix (spécifique de chaque cible).
Chaque mix primers-sonde contient deux amorces PCR non marquées et une
sonde TaqMan® MGB (ligand du petit sillon) marquée par le fluorophore
FAM™ dans un mix prêt à l’emploi à 20✕. Les concentrations finales à 1✕
sont de 250 nM pour la sonde et de 900 nM pour chaque amorce.
– Master mix TaqMan® Universal PCR (avec ou sans AmpErase® UNG) ou
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG.
• Sont conçus et optimisés pour fonctionner avec un master mix TaqMan®, dans
des conditions de thermocyclage universelles.
• Requièrent une seule étape d’amplification par PCR et une lecture simultanée
en temps réel pour obtenir des résultats.
• Si possible, amplifier l’ADNc cible sans amplifier l’ADN génomique (suffixe
m dans l’ID de l’essai) en créant des sondes spécifiques des jonctions exonexon.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Essais
disponibles
Les essais TaqMan Gene Expression Assays sont disponibles pour les gènes de
l’homme, de la souris, du rat, de Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares
(chien) et Rhésus. Numéros de référence :
• Réf. 4331182 pour les essais en stock
• Réf. 4351372 pour les essais fabriqués sur commande
Le préfixe du nom de l’essai indique l’espèce pour laquelle il a été conçu : Hs pour
Homo sapiens (homme), Mm pour Mus musculus (souris), Rn pour Rattus norvegicus
(rat), At pour Arabidopsis thaliana, Dm pour Drosophila melanogaster, Ce pour
C. elegans, Cf pour C. familiares (chien) et Rh pour Rhésus.
Le suffixe du nom de l’essai indique sa position, comme décrit dans le tableau cidessous.
Suffixe
Description
_m
La sonde de l’essai porte sur une jonction d’exons, l’essai ne détecte pas
l’ADN génomique.
_s
Les amorces et les sondes de l’essai sont définies dans un exon unique,
l’essai détecte l’ADN génomique.
_g
Il est possible que les amorces et les sondes de l’essai se situent dans un
exon unique, l’essai peut détecter l’ADN génomique.
_mH
_sH
_gH
_u
L’essai a été conçu pour un transcrit d’une famille de gènes présentant une
homologie de séquence élevée. L’essai prévoit une différence de 10 CT à
15 CT entre le gène cible et le gène ayant l’homologie de séquence la plus
proche. Par conséquent, l’essai détecte le transcrit cible avec une
discrimination (sensibilité) 1 000 à 3 000 fois supérieure au transcrit
homologue le plus proche s’ils présentent le même nombre de copies dans
l’échantillon.
L’amplicon de l’essai porte sur une jonction d’exons et la sonde se situe
entièrement dans l’un des exons concernés.
Essais TaqMan® Endogenous Control Assays
Les essais TaqMan® Endogenous Control Assays existent sous la forme d’essais
TaqMan Gene Expression Assays en stock (réf. 4331182). Les essais TaqMan
Endogenous Control Assays sont :
• Disponibles sous la forme d’un essai TaqMan Gene Expression Assay avec une
sonde TaqMan MGB marquée par le fluorophore FAM™ dans un tube unique,
préformulé à 20✕.
• Disponibles pour l’homme, la souris et le rat, avec des sondes TaqMan MGB
marquées par le fluorophore VIC® ou FAM™. Les contrôles endogènes TaqMan
marqués par le fluorophore VIC sont limités en amorces.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-17
Chapitre 3 Expériences de quantification
Pour plus
d’informations
• Pour plus d’informations sur les derniers produits disponibles et sur leurs
recommandations d’utilisation, consulter le site Internet d’Applied Biosystems :
http://www.appliedbiosystems.com/
a. Sur la page d’accueil, sous TaqMan® Products (Produits TaqMan),
sélectionner TaqMan® Gene Expression Assays (Essais TaqMan Gene
Expression Assays).
b. Sur la page Gene Expression Assays & Arrays (Essais et puces Gene
Expression Assays & Arrays), sélectionner TaqMan® Gene Expression
Assays (Essais TaqMan Gene Expression Assays) sous Individual Assays
(Essais individuels).
• Pour plus d’informations sur les essais Custom TaqMan Endogenous Control
Assays, voir le document Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select
an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note.
• Pour plus d’informations sur la préparation des réactions de PCR en utilisant les
essais TaqMan Gene Expression Assays, voir le document TaqMan® Gene
Expression Assays Protocol.
Essais Custom TaqMan® Gene Expression Assays
Description des
produits
Les essais Custom TaqMan® Gene Expression Assays sont des ensembles d’amorces
et de sondes TaqMan conçus, synthétisés et formulés par le service Custom TaqMan®
Genomic Assays d’après les informations de séquence transmises par l’utilisateur. Ils
permettent d’effectuer des expériences de quantification sur tous les gènes ou
variants d’épissage dans n’importe quel organisme.
Les essais utilisent des réactifs TaqMan pour amplifier et détecter la cible dans les
échantillons d’ADNc. Tous les essais sont développés au moyen d’un logiciel de
création exclusif.
Propriétés des
produits
3-18
Tous les essais Custom TaqMan Gene Expression Assays :
• Requièrent la création d’un fichier de soumission (à l’aide du logiciel gratuit
File Builder) avec la séquence cible et l’envoi du fichier au service Custom
TaqMan Genomic Assays.
• Nécessitent trois composants :
– 1 à 100 ng d’échantillon d’ADNc (converti à partir d’ARN) par puits, avec la
même quantité d’ADNc dans chaque puits de l’étude.
– Mélange 20✕ ou 60✕ d’essai Gene Expression Assay (spécifique de chaque
cible). Chaque essai contient deux amorces spécifiques de la cible et une
sonde TaqMan MGB marquée par le fluorophore FAM™ dans un mis prêt à
l’emploi à 20✕ ou à 60✕. Les concentrations finales à 1✕ sont de 250 nM
pour la sonde et de 900 nM pour chaque amorce.
– Master mix TaqMan® Universal PCR (avec ou sans AmpErase® UNG) ou
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG.
• Sont conçus et optimisés pour fonctionner avec un master mix TaqMan, dans
des conditions de thermocyclage universelles.
• Requièrent une seule étape d’amplification par PCR et une lecture simultanée
en temps réel pour obtenir des résultats.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Pour plus
d’informations
• Pour plus d’informations sur les derniers produits disponibles et sur leurs
recommandations d’utilisation, consulter le site Internet d’Applied Biosystems :
http://www.appliedbiosystems.com/
a. Sur la page d’accueil, sous TaqMan® Products (Produits TaqMan),
sélectionner TaqMan® Gene Expression Assays (Essais TaqMan Gene
Expression Assays).
b. Sur la page Gene Expression Assays & Arrays (Essais et puces Gene
Expression Assays & Arrays), sélectionner Custom TaqMan® Gene
Expression Assays (Essais Custom TaqMan Gene Expression Assays)
sous Individual Assays (Essais individuels).
• Pour plus d’informations sur la commande d’essais Custom TaqMan Gene
Expression Assays, voir le document Custom TaqMan® Genomic Assays
Protocol: Submission Guidelines.
• Pour plus d’informations sur la préparation des réactions de PCR en utilisant les
essais Custom TaqMan Gene Expression Assays, voir le document Custom
TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.
Sélection du master mix
Master mix
disponibles
Les essais en stock/fabriqués sur commande d’Applied Biosystems pour les
expériences de quantification sont conçus pour fonctionner avec les master mix
TaqMan® suivants :
Master mix
Pour plus
d’informations
Référence
Master mix TaqMan® Fast Universal PCR (2✕), No AmpErase® UNG,
250 réactions
4352042
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, 200 réactions
4304437
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, 2 000 réactions
4326708
Boîte de 10, master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR
4305719
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, No AmpErase® UNG,
200 réactions
4324018
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, No AmpErase® UNG,
2 000 réactions
4326614
Boîte de 10, master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, No AmpErase® UNG
4324020
Pour plus d’informations sur l’utilisation des réactifs TaqMan, voir les documents :
• TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol
• TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-19
Chapitre 3 Expériences de quantification
Conception de l’expérience
Utilisation du
logiciel StepOne
Pour les essais en stock/fabriqués sur commande d’Applied Biosystems, utiliser le
logiciel StepOne afin de créer l’expérience de quantification. Il calcule
automatiquement les volumes pour les :
• Composants du mélange réactionnel
• Dilutions d’échantillons
• Gammes de dilutions standard (expériences de quantification absolue et de
quantification relative par les courbes standard uniquement)
Remarque : Pour sélectionner le type d’essai (en stock/fabriqué sur commande) dans
le logiciel StepOne, accéder à l’écran Reaction Setup (Préparation des réactions)
dans le workflow de l’assistant de programmation Design Wizard ou Advanced
Setup (Configuration avancée), puis sélectionner Inventoried/Made to Order (En
stock/Fabriqué sur commande) dans le menu déroulant Assay Type (Type d’essai).
Pour plus
d’informations
Pour plus d’informations sur la création et la réalisation des expériences de
quantification sur le système StepOne, voir les documents :
• Guide de mise en route pour les expériences de quantification absolue par les
courbes standard sur le système de PCR en temps réel Applied Biosystems
StepOne™
• Guide de mise en route pour les expériences de quantification relative par les
courbes standard et par la comparaison des valeurs de CT sur le système de
PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Essais personnalisés
Workflow
Si le type d’essai Custom (Personnalisé) est sélectionné dans le logiciel StepOne™
pour une expérience de quantification (c’est-à-dire pour créer des amorces et des
sondes personnalisées), il est recommandé de suivre le workflow des instructions de
préparation des essais d’Applied Biosystems :
1. Créer des amorces et des sondes à l’aide du logiciel Primer Express®
(ci-dessous).
2. Sélectionner les réactifs adéquats (page 3-24).
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore
TAMRA™ comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
3. Utiliser les conditions de thermocyclage recommandées (page 3-26).
4. Commencer avec les concentrations d’amorce et de sonde par défaut.
Si nécessaire, optimiser les concentrations d’amorce (page 3-29) et de
sonde (page 3-33).
IMPORTANT ! Ces étapes permettent de concevoir et d’optimiser les essais de
manière fiable et rapide uniquement lorsqu’elles sont utilisées dans leur globalité.
Respecter l’ensemble du processus pour atteindre des résultats optimaux. Pour
obtenir une description plus détaillée des instructions de préparation des essais
d’Applied Biosystems, voir l’Annexe C.
3-20
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Remarque : Pour sélectionner le type d’essai Custom (Personnalisé) dans le logiciel
StepOne, accéder à l’écran Reaction Setup (Préparation des réactions) dans le
workflow de l’assistant de programmation Design Wizard ou Advanced Setup
(Configuration avancée), puis sélectionner Custom (Personnalisé) dans le menu
déroulant Assay Type (Type d’essai).
Création d’amorces et de sondes à l’aide du logiciel Primer Express®
Le logiciel Primer Express® utilise les paramètres recommandés pour sélectionner
les amorces et les sondes en fonction de la séquence ADN fournie.
Si un essai personnalisé est créé, suivre le résumé des instructions de préparation
d’amorces et de sondes pour les expériences de quantification à la page 3-23. Pour
obtenir une explication détaillée de ces instructions, voir « À propos des instructions
de préparation d’amorces et de sondes » à la page 3-22.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Remarque : Même si aucune sonde n’est requise pour la détection du fluorophore
SYBR® Green I, il est préférable d’utiliser le logiciel Primer Express pour
sélectionner un ensemble d’amorces et de sondes lors de la création d’un essai pour
les réactifs SYBR® Green. Aucune sonde n’est utilisée, mais les amorces seront
conformes à tous les critères requis. Si l’essai doit être adapté aux réactifs TaqMan
pour obtenir une spécificité supérieure, le fichier d’origine du logiciel Primer
Express permet de trouver immédiatement la sonde adéquate.
Sélection d’une
région
d’amplification
pour les essais
de quantification
La sélection d’une région d’amplification appropriée garantit l’amplification de
l’ARNm/ADNc cible sans coamplification de la séquence génomique, des
pseudogènes et des autres gènes associés. Les réactifs SYBR Green peuvent s’avérer
utiles lors de la recherche de sites d’amplicon pour l’expression génétique.
Instructions
• L’amplicon doit couvrir un ou plusieurs introns pour éviter d’amplifier le gène
cible dans l’ADN génomique.
• La paire d’amorces doit être spécifique du gène cible pour éviter d’amplifier les
pseudogènes ou d’autres gènes associés.
• Lors de la création des amorces, suivre les instructions du logiciel Primer
Express.
• Si aucune séquence convenable n’est trouvée, il peut être nécessaire d’examiner la
séquence et de redéfinir l’amplicon ou simplement de rechercher plus de sites.
Si le gène étudié ne possède pas d’intron, il n’est pas possible de créer un amplicon
qui amplifiera la séquence ARNm sans amplifier la séquence génomique. Dans ce
cas, contrôler l’échantillon d’ARN qui n’a pas subi de rétro-transcription (contrôles
sans RT).
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-21
Chapitre 3 Expériences de quantification
À propos des
instructions de
préparation
d’amorces et de
sondes
Sélection de petits amplicons
La sélection d’amplicons compris dans un intervalle de 50 à 150 paires de bases est
un paramètre par défaut important dulogiciel Primer Express. Les petits amplicons
sont préférables car ils favorisent une amplification hautement efficace.
En outre, les essais hautement efficaces permettent d’effectuer une quantification
relative en utilisant la comparaison des valeurs de CT (∆∆CT) (Livak and Schmittgen,
2001). Cette méthode augmente le débit expérimental car il n’est pas nécessaire
d’utiliser des courbes standard lors de l’étude des niveaux d’expression d’une cible
comparé à un échantillon de référence.
Contenu G/C
Dans la mesure du possible, sélectionner des amorces et des sondes dans une zone
où le contenu G/C est de 30 à 80 %. Il est possible que les zones ayant un contenu
G/C >80 % ne soient pas correctement dénaturées pendant le thermocyclage, ce qui
peut nuire à l’efficacité de la réaction. Les séquences riches en G/C sont sensibles
aux interactions non spécifiques, lesquelles peuvent réduire l’efficacité de la réaction
et produire un signal non spécifique dans les essais utilisant des réactifs SYBR
Green. Éviter d’utiliser des séquences d’amorces et de sondes qui contiennent
des séries d’au moins quatre bases G.
Température de fusion
Lors de la sélection d’amorces et de sondes avec la température de fusion (Tm)
recommandée, les conditions de thermocyclage universelles peuvent être utilisées.
Applied Biosystems recommande d’utiliser pour la sonde un Tm de 10 °C supérieur
à celui des amorces.
Extrémité 5′ des sondes
Le logiciel Primer Express ne sélectionne pas les sondes avec une base G à l’extrémité
5′. L’effet quencher d’une base G à cette position persiste même après le clivage de la
sonde, ce qui peut limiter les niveaux de fluorescence produits (∆Rn) et nuire aux
performances de l’essai. Il n’a pas été démontré que des bases G situées à proximité
de l’extrémité 5′, mais pas directement dessus, avaient une influence négative sur les
performances de l’essai.
Extrémité 3′ des amorces
Pour réduire la formation éventuelle de produit non spécifique, vérifier que les cinq
dernières bases sur l’extrémité 3′ des amorces ne contiennent pas plus de deux bases
C et/ou G. Dans certaines circonstances, telles qu’une séquence de cible riche en
G/C, il est possible d’ignorer cette recommandation pour que la longueur de
l’amplicon ne dépasse pas 150 paires de bases. D’une manière générale, éviter
d’utiliser les extrémités 3′ de l’amorce extrêmement riches en bases G et/ou C.
3-22
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Résumé des
instructions de
préparation
d’amorces et de
sondes MGB
Instructions pour les sondes
Instructions pour les amorces
Sélectionner d’abord la sonde, puis créer les amorces aussi près que possible de la sonde
sans la chevaucher (des amplicons de 50 à 150 paires de bases sont fortement
recommandés).
Le contenu G/C doit se situer dans un intervalle de 30 à 80 %.
Éviter les répétitions d’un même nucléotide, en particulier la guanine, les séries d’au moins
quatre G devant être proscrites.
Lors de l’utilisation du logiciel Primer
Express®, le Tm doit être compris entre
68 et 70 °C (154,4 et 158 °F).
Lors de l’utilisation du logiciel Primer
Express®, le Tm doit être compris entre
58 et 60 °C (136,4 et 140 °F).
Aucune base G à l’extrémité 5′.
Les cinq nucléotides de l’extrémité 3′
doivent avoir au maximum deux bases
G et/ou C.
Créer des sondes TaqMan® MGB aussi
courtes que possible, avec un minimum de
13 nucléotides.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-23
Chapitre 3 Expériences de quantification
Sélection des réactifs
Plusieurs réactifs TaqMan et SYBR Green sont disponibles pour les expériences de
quantification. Les réactifs utilisés dépendent de la cible :
• ADN ou ADNc (ci-dessous).
• ARN avec RT-PCR 1 étape (page 3-25).
• ARN avec RT-PCR 2 étapes (page 3-25).
Remarque : Si des réactifs SYBR Green sont utilisés, Applied Biosystems
recommande vivement les réactifs Power SYBR Green.
Quantification de
l’ADN ou de
l’ADNc
Réactif
Réactifs TaqMan®
Réactifs SYBR®
Green
3-24
Kit
Référence
Master mix TaqMan® Fast Universal PCR (2✕),
No AmpErase® UNG, 250 réactions
4352042
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR,
200 réactions
4304437
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR,
2 000 réactions
4326708
Boîte de 10, master mix TaqMan® 2✕ Universal
PCR
4305719
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR,
No AmpErase® UNG, 200 réactions
4324018
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR,
No AmpErase® UNG, 2 000 réactions
4326614
Boîte de 10, master mix TaqMan® 2✕ Universal
PCR, No AmpErase® UNG
4324020
TaqMan® PCR Core Reagents Kit, 200 réactions
N808-0228
Master mix Power SYBR® Green PCR (1 mL),
40 réactions
4368577
Master mix Power SYBR® Green PCR (5 mL),
200 réactions
4367659
Master mix Power SYBR® Green PCR
(10 × 5 mL), 2 000 réactions
4368708
Master mix Power SYBR® Green PCR (50 mL),
2 000 réactions
4367660
Master mix SYBR® Green PCR (1 mL),
40 réactions
4344463
Master mix SYBR® Green PCR (5 mL),
200 réactions
4309155
Master mix SYBR® Green PCR (50 mL),
2 000 réactions
4334973
Réactifs SYBR® Green PCR Core Reagents,
200 réactions
4304886
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Quantification de
l’ARN avec la
RT-PCR
1 étape
Réactif
Kit
Référence
Réactifs TaqMan®
TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagents
Kit
4309169
TaqMan® EZ RT-PCR Core Reagents
N808-0236
TaqMan®
Remarque : Utiliser les
EZ RT-PCR
Core Reagents lorsqu’une étape RT à température
élevée est requise.
Réactifs SYBR®
Green
Quantification de
l’ARN avec la
RT-PCR
2 étapes
Réactif
Réactifs
TaqMan®
Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit
4368711
SYBR® Green RT-PCR Reagents
4310179
Étape
Référence
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master
Mix
4304437
TaqMan® Fast Universal PCR Master
Mix (2✕), No AmpErase® UNG
4352042
High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit
4374966
TaqMan® Reverse Transcription
Reagents
N808-234
Étapes RT et
PCR
TaqMan® Gold RT PCR Kit
N808-232
Étape PCR
uniquement
Master mix Power SYBR® Green
PCR
4367659
Master mix SYBR® Green PCR
4309155
High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit
4374966
TaqMan® Reverse Transcription
Reagents
N808-234
Power SYBR® Green RT-PCR
Reagents Kit
4368711
SYBR® Green RT-PCR Reagents
4310179
Étape PCR
uniquement
Étape RT
uniquement
Réactifs
SYBR® Green
Kit
Étape RT
uniquement
Étapes RT et
PCR
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-25
Chapitre 3 Expériences de quantification
À propos de la
polymérase
AmpliTaq Gold
DNA Polymerase
L’utilisation de l’enzyme d’amorçage à température élevée AmpliTaq Gold® DNA
Polymerase pour les réactifs TaqMan et SYBR Green est traitée en intégralité dans
les instructions de préparation des essais d’Applied Biosystems. L’enzyme AmpliTaq
Gold DNA Polymerase garantit une réaction fiable. Elle peut réduire de manière
significative la formation de produits non spécifiques. En outre, elle simplifie la
préparation de la réaction, qui peut être effectuée à température ambiante.
Remarque : L’ADN polymérase inclus dans le master mix TaqMan Fast Universal
PCR (2✕), No AmpErase UNG peut, à haute température, amorcer très rapidement
la PCR. Les performances sont identiques à celles de l’enzyme AmpliTaq Gold DNA
Polymerase.
À propos de la
transcriptase
inverse
MultiScribe
La transcriptase inverse MultiScribe™ est une transcriptase inverse du virus
recombinant de la leucémie murine de Moloney (MuLV), qui rétro-transcrit l’ARN
en ADN complémentaire (ADNc).
Utilisation des conditions de thermocyclage recommandées
Utiliser les conditions de thermocyclage recommandées pour l’échantillon :
• ADN ou ADNc (ci-dessous).
• ARN avec RT-PCR 1 étape (page 3-27).
• ARN avec RT-PCR 2 étapes (page 3-28).
Remarque : Les réactifs Fast et standard nécessitent des conditions de
thermocyclage différentes.
Quantification de
l’ADN ou de
l’ADNc
Pour le master mix TaqMan Fast Universal PCR (2✕), No AmpErase UNG, utiliser
les conditions suivantes :
Durée et température
Étapes initiales
Activation de
l’AmpErase® UNG ‡
Activation
MAINTIEN
MAINTIEN
2 min à 50 °C
20 s à 95 °C
PCR (40 cycles)
Hybridation/
extension
Dénaturation
CYCLE
3 s à 95 °C
30 s à 60 °C
‡ Requise uniquement si l’AmpErase® UNG est ajoutée aux réactions.
3-26
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Pour les master mix TaqMan 2✕ Universal PCR et Power SYBR Green PCR,
utiliser les conditions suivantes :
Durée et température
Étapes initiales
PCR (40 cycles)
Activation de
l’AmpErase® UNG ‡
Activation de
l’AmpliTaq Gold®
DNA Polymerase
MAINTIEN
MAINTIEN
2 min à 50 °C
10 min à 95 °C
Hybridation/
extension
Dénaturation
CYCLE
15 s à 95 °C
1 min à 60 °C
‡ Requise uniquement si l’AmpErase® UNG est ajoutée aux réactions ou incluse dans le
master mix.
Quantification de
l’ARN avec la
RT-PCR
1 étape
Pour le TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit ou Power SYBR
Green RT-PCR Reagents Kit, utiliser les conditions suivantes :
Durée et température
Étapes initiales
Rétrotranscription
Activation de
l’AmpliTaq Gold®
DNA Polymerase
MAINTIEN
MAINTIEN
30 min à 48 °C
10 min à 95 °C
PCR (40 cycles)
Dénaturation
Hybridation/
extension
40 CYCLES
15 s à 95 °C
1 min à 60 °C
Remarque : Ces conditions ne s’appliquent pas au TaqMan EZ RT-PCR Kit. Voir le
document TaqMan® EZ RT-PCR Kit Protocol pour connaître les conditions
adéquates.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-27
Chapitre 3 Expériences de quantification
Quantification de
l’ARN avec la
RT-PCR
2 étapes
Pour le High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, utiliser les conditions
suivantes :
Étape
1. Étape RT
Durée et température
Étape 1
Étape 2
MAINTIEN
MAINTIEN
10 min à 25 °C
120 min à 37 °C
Après la transcriptase inverse de l’ARN en ADNc (étape RT), les échantillons peuvent être
conservés ou utilisés pour l’étape PCR suivante décrite ci-dessous.
IMPORTANT ! Pour la majorité des applications, et lorsque de grandes quantités
d’ADNc sont requises, Applied Biosystems recommande une rétro-transcription de
120 min à 37 °C pour obtenir une conversion optimale.
Pour les master mix TaqMan 2✕ Universal PCR (avec AmpErase UNG) ou Power
SYBR Green PCR, utiliser les conditions suivantes :
Étape
Durée et température
Étapes initiales
2. Étape PCR
Activation de
l’AmpErase®
UNG
Activation de
l’AmpliTaq
Gold® DNA
Polymerase
MAINTIEN
MAINTIEN
2 min à 50 °C
10 min à 95 °C
PCR (40 cycles)
Dénaturation
Hybridation/
extension
CYCLE
15 s à 95 °C
1 min à 60 °C
Pour le master mix TaqMan Fast Universal PCR (2✕), No AmpErase UNG, utiliser
les conditions suivantes :
Étape
Durée et température
Étapes initiales
2. Étape PCR
Activation de
l’AmpErase®
UNG ‡
Activation de
l’AmpliTaq
Gold® DNA
Polymerase
MAINTIEN
MAINTIEN
2 min à 50 °C
20 s à 95 °C
PCR (40 cycles)
Dénaturation
Hybridation/
extension
CYCLE
3 s à 95 °C
30 s à 60 °C
‡ Requise uniquement si l’AmpErase® UNG est ajoutée aux réactions.
3-28
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Optimisation des concentrations d’amorces
En faisant varier indépendamment les concentrations d’amorces sens et anti-sens,
il est possible d’identifier celles qui offrent aux essais des performances optimales.
Les amorces sont toujours présentes en excès de quantité au cours de la phase
exponentielle de l’amplification par PCR.
Lorsque le master mix TaqMan 2✕ Universal PCR est utilisé, Applied Biosystems
recommande les concentrations d’amorces répertoriées dans le paragraphe
« Concentrations d’amorces par défaut » ci-dessous. Ce guide contient des
explications détaillées pour :
• La matrice d’optimisation des amorces (ci-dessous)
• Les réactifs TaqMan (ci-dessous)
• Les réactifs SYBR Green (à la page 3-31)
Concentrations
d’amorces par
défaut
Les concentrations d’amorces initiales recommandées, indiquées dans le tableau
ci-dessous, sont destinées aux essais de quantification de l’ADN et de l’ADNc.
Concentrations (nM)
Réactif
Matrice
d’optimisation
des amorces
Amorce sens
Amorce anti-sens
Réactifs TaqMan®
900
900
Réactifs SYBR® Green
50
50
Une matrice d’optimisation des amorces permet de déterminer la concentration
d’amorce minimale qui produira la valeur CT la plus basse et la valeur ∆Rn la plus
haute.
Elle peut aider à compenser la l’hybridation non spécifique des amorces, ce qui peut
réduire la quantité d’amorce disponible pour l’hybridation au site spécifique.
Réactifs TaqMan
Pour obtenir des performances optimales avec les essais de quantification qui
utilisent les réactifs TaqMan, sélectionner les concentrations d’amorces qui
produisent la valeur CT la plus faible et la valeur ∆Rn la plus élevée pour une quantité
fixe de séquence cible.
Remarque : Bien que les valeurs CT soient le paramètre qui permet d’affecter les
valeurs quantitatives lors d’une expérience de quantification en temps réel, les
valeurs ∆Rn sont également importantes pour obtenir une sensibilité et une
reproductibilité maximales.
La Figure 3-3 à la page 3-30 montre les résultats d’une expérience standard de
matrice d’optimisation des amorces avec un réactif TaqMan :
• La Figure 3-3a montre les courbes d’amplification de toutes les combinaisons
de concentrations d’amorces dans un graphique linéaire.
• La Figure 3-3b montre les mêmes données dans un graphique de type log.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-29
Chapitre 3 Expériences de quantification
La combinaison d’amorces anti-sens et sens à 50 nM (courbe du groupe C) produit la
valeur ∆Rn la plus faible et la valeur CT la plus élevée. Toutes les combinaisons
d’amorces qui contiennent une concentration à 150 nM de l’amorce sens ou anti-sens
(courbe du groupe B) produisent une valeur ∆Rn réduite. Toutes les combinaisons
d’amorces qui contiennent des amorces sens et anti-sens à 300 nM minimum (courbe
du groupe A) produisent la valeur ∆Rn la plus élevée et la valeur CT la plus faible.
Par conséquent, les combinaisons représentées par les courbes de groupe A et B
produisent des performances optimales.
a) Graphique linéaire
b) Graphique log
Figure 3-3 Résultats de l’expérience d’optimisation des amorces montrant les
courbes d’amplification (graphiques linéaire et log) des combinaisons d’amorces
Légende :
A : Combinaisons qui contiennent des amorces sens et anti-sens à 300 nM minimum
B : Combinaisons qui contiennent des amorces sens et anti-sens à 150 nM minimum
C : Combinaisons qui contiennent des amorces sens et anti-sens à 50 nM minimum
3-30
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Réactifs SYBR
Green
L’optimisation des concentrations d’amorces est légèrement plus complexe pour
les essais de quantification qui utilisent les réactifs SYBR Green. Il est possible
d’employer la même matrice d’optimisation des amorces qu’avec les réactifs
TaqMan. Toutefois, il est nécessaire d’ajouter des contrôles négatifs pour les réactifs
SYBR Green. Les concentrations d’amorces sélectionnées doivent produire une
valeur CT faible et une valeur ∆Rn élevée lorsqu’elles sont en présence de la
séquence cible, mais elles ne doivent pas générer de produit non spécifique dans les
contrôles négatifs.
L’analyse de la courbe de fusion ou du dépôt sur gel peut s’avérer très utile lors
de la détermination des concentrations d’amorces optimales pour les essais de
quantification utilisant des réactifs SYBR Green. La Figure 3-4 à la page 3-32
montre les résultats d’une matrice d’optimisation des amorces avec des
concentrations d’amorces sens et anti-sens à 900 nM :
• La Figure 3-4a montre une forte amplification dans les puits de contrôle négatif,
ce qui témoigne d’une amplification non spécifique importante.
• La Figure 3-4b montre que la température de fusion du produit généré en
l’absence d’échantillon est inférieure à celle du produit spécifique généré en
présence d’échantillon, ce qui témoigne d’une amplification non spécifique
importante.
Les résultats affichés dans la Figure 3-4 sont typiques d’une formation de dimères
d’amorces. Ils attestent que les concentrations d’amorces inférieures peuvent fournir
de meilleurs résultats. En outre, il est possible de redéfinir un autre ensemble
d’amorces pour la cible concernée.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-31
Chapitre 3 Expériences de quantification
a) Courbe d’amplification, graphique linéaire
Amplification de la
cible
NC (amplification
non spécifique)
b) Analyse de la courbe de fusion
NC
(amplification
non spécifique)
Cible
Amplification
Figure 3-4 Données d’amplification avec les réactifs SYBR® Green
(a) Courbe d’amplification (graphique linéaire) montrant une suspicion
d’amplification non spécifique dans les puits de contrôle négatif (NC).
(b) Analyse de la courbe de fusion confirmant que les puits NC et le produit
spécifique ont une température de fusion différente.
3-32
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Optimisation de la concentration de sonde
Lors d’une détection à l’aide de sondes TaqMan®, la concentration de sonde
recommandée (250 nM) garantit d’excellentes performances aux essais. Toutefois,
selon les besoins de l’essai, une expérience d’optimisation de la sonde peut s’avérer
utile.
Remarque : Aucune sonde n’est requise pour la détection du fluorophore SYBR
Green I.
Concentrations
de sonde
recommandées
La concentration de sonde recommandée pour les essais de quantification de l’ADN
et de l’ADNc avec les réactifs TaqMan est de 250 nM. La Figure 3-5 montre les
résultats d’une expérience d’optimisation de sonde dans laquelle la concentration de
sonde varie de 50 à 250 nM :
• La Figure 3-5a montre un accroissement de la valeur ∆Rn à mesure que la
concentration de sonde augmente.
• La Figure 3-5b montre que la valeur CT varie selon les concentrations de sonde.
Pour garantir une reproductibilité optimale, en particulier pour détecter un faible
nombre de copies d’une cible, éviter les concentrations limitant la sonde. Réaliser
l’expérience à une concentration de sonde de 250 nM. L’utilisation d’une
concentration à 250 nM évite de limiter la sonde et garantit des valeurs ∆Rn
importantes. Des valeurs ∆Rn élevées indiquent un essai robuste à efficacité élevée,
ce qui permet d’obtenir beaucoup de produit et d’effectuer des mesures de pics
précises.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-33
Chapitre 3 Expériences de quantification
a) Graphique linéaire
b) Graphique log
Figure 3-5 Courbe d’amplification (graphiques linéaire et log) du titrage de
concentration de la sonde entre 50 et 250 nM
3-34
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 3 Expériences de quantification
Pour plus d’informations
Pour plus d’informations sur :
• L’utilisation des réactifs TaqMan, voir les documents :
– TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol
– TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
• L’utilisation des réactifs SYBR Green, voir les documents :
– Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol
– SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol
– SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol
• La réalisation d’expériences de quantification sur le système StepOne, voir les
documents :
– Guide de mise en route pour les expériences de quantification absolue par les
courbes standard sur le système de PCR en temps réel Applied Biosystems
StepOne™
– Guide de mise en route pour les expériences de quantification relative par les
courbes standard et par la comparaison des valeurs de CT sur le système de
PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
• La réalisation d’expériences de présence/absence sur le système StepOne, voir
le document Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting
Started Guide for Presence/Absence Experiments.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
3-35
Chapitre 3 Expériences de quantification
3-36
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Réactions de génotypage
4
4
Sommaire du chapitre :
Section 4.1 À propos des réactions de génotypage. . . . . . . . . . 4-3
Section 4.2 Instructions de préparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
4-1
Chapitre 4 Réactions de génotypage
4-2
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Section 4.1 À propos des réactions de génotypage
Sommaire de la section :
Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4
Sélection du type d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
4-3
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Présentation
Qu’est-ce qu’une
réaction de
génotypage ?
Une réaction de génotypage est réalisée en point final pour déterminer le génotype
d’échantillons inconnus. Avec cette application, il est possible de différencier un
polymorphisme de nucléotide unique (SNP).
Une réaction de génotypage détermine si les échantillons inconnus sont :
• Homozygotes (échantillons avec l’allèle 1 uniquement)
• Homozygotes (échantillons avec l’allèle 2 uniquement)
• Hétérozygotes (échantillons avec l’allèle 1 et l’allèle 2)
Composants
Les réactions de PCR pour les réactions de génotypage incluent les composants
suivants :
• Échantillon – Échantillon dans lequel le génotype de la cible est inconnu.
• (Facultatif) Réplicats – Réactions identiques contenant des composants et des
volumes identiques.
• Contrôles négatifs – Échantillons qui contiennent de l’eau ou du tampon à la
place de l’échantillon, également appelés contrôles sans échantillon (NTC – No
Template Control). Les contrôles négatifs ne doivent pas être amplifiés.
• (Facultatif) Contrôles positifs – Échantillons qui contiennent des génotypes
connus (homozygotes pour l’allèle 1, homozygotes pour l’allèle 2 et
hétérozygotes pour les allèles 1 et 2).
Instruments
Les réactions de génotypage requièrent deux étapes : le thermocyclage
(amplification par PCR) et la détection en point final des signaux fluorescents
produits. L’étape de thermocyclage (amplification par PCR) peut être effectuée sur le
système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™ ou sur un
thermocycleur autonome.
Sur le système StepOne™ :
• Il est possible d’analyser la PCR, ce qui peut s’avérer utile pour corriger les
imprécisions.
• Effectuer la lecture en point final de la plaque séparément.
Fonctionnement
d’une réaction de
génotypage
Dans une réaction de génotypage, la PCR inclut une sonde spécifique marquée par
un fluorophore particulier pour chaque allèle. Les sondes contiennent des reporters
différents pour discriminer chaque allèle.
Les sondes TaqMan® MGB (ligand du petit sillon) sont compatibles avec le système
StepOne. Chaque sonde TaqMan® MGB contient :
• Un reporter à l’extrémité 5′ de chaque sonde
– Le fluorophore VIC® est lié à l’extrémité 5′ de la sonde pour l’allèle 1
– Le fluorophore FAM™ est lié à l’extrémité 5′ de la sonde pour l’allèle 2
4-4
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 4 Réactions de génotypage
• Un ligand du petit sillon (MGB)
Cette modification augmente la température de fusion (Tm) des sondes sans
augmenter leur longueur (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997) ce qui
permet de créer des sondes plus courtes. Par conséquent, les sondes TaqMan
MGB présentent de plus grandes différences de valeurs de Tm entre les sondes
spécifiques et non spécifiques, ce qui permet d’obtenir un génotypage précis.
• Un quencher non fluorescent (NFQ) à l’extrémité 3′ de la sonde
Puisque le quencher n’émet pas de fluorescence, les systèmes PCR en temps
réel peuvent mesurer plus précisément les contributions du reporter.
Pendant la PCR, chaque sonde s’hybride spécifiquement sur sa séquence
complémentaire entre les sites d’amorces sens et anti-sens. La polymérase AmpliTaq
Gold ® DNA Polymerase ne peut cliver que les sondes qui s’hybrident sur la séquence
allélique (spécificité). Le clivage sépare le reporter du quencher, ce qui augmente la
fluorescence du reporter. Ainsi, les signaux de fluorescence générés pendant
l’amplification par PCR indiquent les allèles présents dans l’échantillon.
Non-spécificités entre les séquences de sonde et d’allèle
Les non-spécificités entre une sonde et un allèle (Figure 4-1) réduisent l’efficacité de
l’hybridation de la sonde. En outre, la polymérase AmpliTaq Gold DNA Polymerase
peut déplacer la sonde non spécifique plutôt que de la cliver afin de libérer le
reporter.
Allèle
1
F
V
Légende
Q
Q
Spécificité
Allèle
2
Non-spécificité
V
Fluorophore
VIC
F
Fluorophore
FAM
Q
Quencher
V
F
Q
Q
Spécificité
Non-spécificité
AmpliTaq
Gold DNA
Polymerase
GR1556
Figure 4-1 Résultats de spécificité et de non-spécificité entre les séquences
d’allèle et de sonde dans une réaction de génotypage
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
4-5
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Le Tableau 4-1 résume les résultats possibles de l’exemple de réaction de génotypage
indiqué ci-dessus.
Tableau 4-1
Résultats de la réaction de génotypage
Une augmentation importante…
Workflow
Indique…
De la fluorescence du fluorophore VIC®
uniquement
Une homozygotie pour l’allèle 1
De la fluorescence du fluorophore FAM™
uniquement
Une homozygotie pour l’allèle 2
Des deux signaux fluorescents
Une hétérozygotie
Avant de démarrer une réaction de génotypage sur le système StepOne, elle doit être
préparée comme suit :
1. Sélectionner le type d’essai (ci-dessous).
2. Consulter les instructions de préparation selon le type d’essai sélectionné
(Section 4.2 à la page 4-9).
Sélection du type d’essai
Lors de la création d’une expérience avec le logiciel StepOne, il est possible de
sélectionner les types d’essais suivants pour les réactions de génotypage :
• Préconçus/validés (ci-dessous)
• Personnalisés (page 4-7)
Cette section répertorie les produits disponibles pour chaque type d’essai.
Remarque : Les essais sont spécifiques de la cible étudiée. Les master mix
contiennent les autres composants nécessaires à la réaction de PCR.
Remarque : Les réactifs TaqMan® Fast et SYBR® Green ne sont pas validés pour les
réactions de génotypage.
4-6
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Essais
préconçus/
validés
Produit
Attributs
Essais TaqMan® SNP
Genotyping Assays
• Essais préconçus pour la couverture des reporters haute
densité à l’échelle du génome.
• Pour les études de dépistage, d’association, de zone
candidate, de gène candidat ou de cartographie fine.
• Format prêt à l’emploi en un seul tube.
Essais TaqMan® Drug
Metabolism Genotyping
Assays
• Détectent les polymorphismes dans 220 gènes qui codent
divers enzymes du métabolisme des médicaments et
transporteurs de médicaments.
• Pour l’étude des polymorphismes de nucléotides simples
(SNP), des insertions/délétions (in/del) et des
polymorphismes de multinucléotides (MNP).
Réactifs Pre-Developed
TaqMan® Assay
Reagents for Allelic
Discrimination
• Génotypent les échantillons d’ADN purifié pour des
mutations spécifiques. La plupart des essais distinguent
deux allèles de polymorphismes de nucléotides simples
(SNP).
• Ligand du petit sillon (MGB) ajouté pour un meilleur
génotypage.
• ADN de contrôle des allèles 1 et 2 inclus pour faciliter la
génération de chaque signal homozygote à chaque
réaction.
• Le système en tube fermé ne nécessite pas de
manipulation ou de gel après la PCR.
Master mix TaqMan® 2✕
Universal PCR (avec ou
sans AmpErase® UNG)
• Performances optimales pour les quantifications en
TaqMan® à partir d’échantillons d’ADNc ou d’ADN.
• Contient des composants qui assurent d’excellentes
performances aux essais.
• L’utilisation d’un seul réactif pour tous les essais simplifie
le processus expérimental.
Pour obtenir des instructions de préparation des expériences avec des essais
préconçus/validés, voir page 4-10.
Essais
personnalisés
Produit
Attributs
Essais Custom TaqMan®
SNP Genotyping Assays
• Tous les polymorphismes de nucléotides simples (SNP)
possibles dans n’importe quel organisme.
• Détectent les insertions/délétions (in/del) de six bases
maximum.
• Détectent les polymorphismes de nucléotides multiples
(MNP) jusqu’à six bases maximum.
• Format prêt à l’emploi en un seul tube.
Master mix TaqMan® 2✕
Universal PCR (avec ou
sans AmpErase® UNG)
• Performances optimales pour les quantifications en
TaqMan® à partir d’échantillons d’ADNc ou d’ADN.
• Contient des composants qui assurent d’excellentes
performances aux essais.
• L’utilisation d’un seul réactif pour tous les essais simplifie
le processus expérimental.
Pour obtenir des instructions de préparation des expériences avec des essais
personnalisés, voir page 4-15.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
4-7
Chapitre 4 Réactions de génotypage
4-8
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Section 4.2 Instructions de préparation
Sommaire de la section :
Essais préconçus/validés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
Essais TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
Essais TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . 4-11
Réactifs Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination. . . 4-12
Sélection du master mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13
Conception de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14
Essais personnalisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15
Essais Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15
Sélection du master mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17
Conception de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
4-9
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Essais préconçus/validés
Workflow
Si une réaction de génotypage est créée avec les essais préconçus/validés d’Applied
Biosystems, il est recommandé de suivre le workflow ci-dessous :
1. Sélectionner l’essai :
• Essais TaqMan® SNP Genotyping Assays (ci-dessous).
• Essais TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays (page 4-11).
• Réactifs Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic
Discrimination (page 4-12).
2. Sélectionner le master mix (page 4-13).
3. Créer l’expérience à l’aide du logiciel StepOne™ (page 4-14).
Essais TaqMan® SNP Genotyping Assays
Description des
produits
Les essais TaqMan® SNP Genotyping Assays comprennent une gamme complète
d’ensembles d’amorces et de sondes destinés au génotypage des polymorphismes de
nucléotides simples (SNP) dans des études sur l’homme.
Ils utilisent les réactifs TaqMan® pour amplifier et détecter les allèles SNP
spécifiques dans les échantillons d’ADN génomique purifié. Tous les essais sont
conçus au moyen des processus et logiciels bioinformatiques d’Applied Biosystems,
ainsi qu’avec les données génomiques de Celera Genomics et des bases de données
publiques.
Propriétés des
produits
4-10
Tous les essais TaqMan SNP Genotyping Assays :
• Nécessitent trois composants :
– 1 à 20 ng d’échantillon d’ADN génomique purifié
– Mélange 20✕, 40✕ ou 80✕ d’essai SNP Genotyping Assay Mix (spécifique
de chaque polymorphisme). Chaque essai est composé d’amorces sens et
anti-sens spécifiques de la séquence pour amplifier le SNP concerné et de
deux sondes TaqMan MGB : une sonde marquée avec le fluorophore VIC®
détecte la séquence d’allèle 1, une sonde marquée avec le fluorophore FAM™
détecte la séquence d’allèle 2.
– Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR (avec ou sans AmpErase® UNG).
• Sont conçus et optimisés pour fonctionner avec le master mix TaqMan 2✕
Universal PCR (avec ou sans AmpErase UNG) dans des conditions de
thermocyclage universelles.
• Requièrent l’amplification par PCR et une lecture en point final pour obtenir
des résultats.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Essais
disponibles
Les essais TaqMan SNP Genotyping Assays sont disponibles en deux catégories :
Catégorie
Pour plus
d’informations
Description
Essais TaqMan®
Validated & Coding SNP
Genotyping Assays
• Environ 5 000 essais SNP à petite échelle, dont 2 000
environ sont des essais SNP codants.
• En stock.
Essais TaqMan® PreDesigned SNP
Genotyping Assays
• Plus de 4,5 millions d’essais SNP préconçus, dont 3,5
millions d’essais HapMap et environ 68 000 essais SNP
codants.
• Disponibles à petite, moyenne et grande échelle.
• Fabriqués sur commande (c’est-à-dire au moment de la
commande).
• Pour plus d’informations sur les derniers produits disponibles et sur leurs
recommandations d’utilisation, consulter le site Internet d’Applied Biosystems :
http://www.appliedbiosystems.com/
a. Sur la page d’accueil, sous TaqMan® Products (Produits TaqMan),
sélectionner TaqMan® SNP Genotyping Assays (Essais TaqMan SNP
Genotyping Assays).
b. Sur la page SNP Genotyping Assays (Essais SNP Genotyping Assays),
sous Pre-Designed/Validated Assays (Essais préconçus/validés),
sélectionner TaqMan® SNP Genotyping Assays (Essais TaqMan SNP
Genotyping Assays).
• Pour plus d’informations sur la préparation des réactions de PCR avec les essais
TaqMan SNP Genotyping Assays, voir le document TaqMan® SNP Genotyping
Assays Protocol.
Essais TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays
Description des
produits
Les essais TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays comprennent une gamme
complète d’ensembles d’amorces et de sondes en stock destinés au génotypage des
SNP, des insertions et délétions (in/del) et des polymorphismes de nucléotides
multiples (MNP) dans les gènes associés au métabolisme des médicaments.
Les essais utilisent les réactifs TaqMan pour amplifier et détecter les
polymorphismes spécifiques dans les échantillons d’ADN génomique purifié. Tous
les essais sont conçus au moyen des processus et logiciels bioinformatiques
d’Applied Biosystems, ainsi qu’avec les données génomiques des bases de données
SNP publiques et des assemblages de génome publics.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
4-11
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Propriétés des
produits
Pour plus
d’informations
Tous les essais TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays :
• Nécessitent trois composants :
– 3 à 30 ng d’échantillon d’ADN génomique purifié
– Mélange 20✕ d’essai Drug Metabolism Genotyping Assay Mix (spécifique
de chaque polymorphisme). Chaque essai est composé d’amorces sens et
anti-sens spécifiques de la séquence pour amplifier la séquence
polymorphique concernée et de deux sondes TaqMan MGB : une sonde
marquée avec le fluorophore VIC détecte la séquence d’allèle 1, une sonde
marquée avec le fluorophore FAM détecte la séquence d’allèle 2.
– Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR (avec ou sans AmpErase® UNG).
• Sont conçus et optimisés pour fonctionner avec le master mix TaqMan 2✕
Universal PCR (avec ou sans AmpErase UNG) dans des conditions de
thermocyclage universelles.
• Requièrent l’amplification par PCR et une lecture en point final pour obtenir
des résultats.
• Pour plus d’informations sur les derniers produits disponibles et sur leurs
recommandations d’utilisation, consulter le site Internet d’Applied Biosystems :
http://www.appliedbiosystems.com/
a. Sur la page d’accueil, sous TaqMan® Products (Produits TaqMan),
sélectionner TaqMan® SNP Genotyping Assays (Essais TaqMan SNP
Genotyping Assays).
b. Sur la page SNP Genotyping Assays (Essais SNP Genotyping Assays),
sous Pre-Designed/Validated Assays (Essais préconçus/validés),
sélectionner TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays (Essais
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays).
• Pour plus d’informations sur la préparation des réactions de PCR avec les essais
TaqMan SNP Genotyping Assays, voir le document TaqMan® Drug Metabolism
Genotyping Assays Protocol.
Réactifs Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination
Description des
produits
Propriétés des
produits
Les réactifs Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination
(TaqMan® PDARs for AD) sont des essais en stock optimisés pour la discrimination
d’allèles spécifiques.
Les réactifs TaqMan PDARs for AD requièrent trois composants :
• 2 à 20 ng d’échantillon d’ADN génomique purifié
• Mélange 10✕ d’essai Allelic Discrimination Assay Mix (spécifique de chaque
polymorphisme). Chaque essai est composé d’amorces sens et anti-sens
spécifiques de la séquence pour amplifier la séquence polymorphique
concernée et de deux sondes TaqMan MGB : une sonde marquée avec le
fluorophore VIC détecte la séquence d’allèle 1, une sonde marquée avec le
fluorophore FAM détecte la séquence d’allèle 2.
• Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR (avec AmpErase® UNG)
Remarque : ADN de contrôle des allèles 1 et 2 inclus avec chaque essai pour faciliter
la génération de tous les signaux homozygotes à chaque réaction.
4-12
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Pour plus
d’informations
• Pour plus d’informations sur les derniers produits disponibles et sur leurs
recommandations d’utilisation, consulter le site Internet d’Applied Biosystems :
http://www.appliedbiosystems.com/
a. Sur la page d’accueil, sous TaqMan® Products (Produits TaqMan),
sélectionner TaqMan® SNP Genotyping Assays (Essais TaqMan SNP
Genotyping Assays).
b. Sur la page SNP Genotyping Assays (Essais SNP Genotyping Assays),
sous Pre-Designed/Validated Assays (Essais préconçus/validés),
sélectionner TaqMan® Pre-Developed Assay Reagents for Allelic
Discrimination (TaqMan® PDARs for AD).
• Pour plus d’informations sur la préparation des réactions de PCR avec les
réactifs TaqMan PDARs for Allelic Discrimination, voir le document PreDeveloped TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol.
Sélection du master mix
Master mix
disponibles
Les essais préconçus/validés d’Applied Biosystems pour les réactions de génotypage
sont conçus pour fonctionner avec les master mix TaqMan® suivants :
• Les réactifs TaqMan PDARs for AD contiennent le master mix TaqMan® 2✕
Universal PCR (avec AmpErase® UNG).
• Les essais TaqMan SNP Genotyping Assays et Custom TaqMan SNP
Genotyping Assays sont compatibles avec :
Master mix
Référence
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, 200 réactions
4304437
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, 2 000 réactions
4326708
Boîte de 10, master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR
4305719
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, No AmpErase®
UNG, 200 réactions
4324018
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, No AmpErase®
UNG, 2 000 réactions
4326614
Boîte de 10, master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR,
No AmpErase® UNG
4324020
Remarque : Les réactions de génotypage ne sont pas validées avec le master mix
TaqMan® Fast Universal PCR.
Pour plus
d’informations
Pour plus d’informations sur l’utilisation des master mix TaqMan, voir le document
TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
4-13
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Conception de l’expérience
Utilisation du
logiciel StepOne
Pour les essais préconçus/validés d’Applied Biosystems, utiliser le logiciel StepOne
afin de créer la réaction de génotypage. Il calcule automatiquement les volumes
pour les :
• Composants du mélange réactionnel
• Dilutions d’échantillons
Remarque : Pour sélectionner un essai SNP dans le logiciel StepOne, accéder à
l’écran SNP Assays (Essais SNP) dans le workflow de l’assistant de programmation
Design Wizard ou à l’écran Plate Setup (Configuration de la plaque) dans le
workflow Advanced Setup (Configuration avancée). Dans l’écran SNP Assays
(Essais SNP) ou Plate Setup (Configuration de la plaque), il est possible de
sélectionner un essai dans la bibliothèque ou d’en créer un nouveau.
Pour plus
d’informations
4-14
Pour plus d’informations sur la création et la réalisation de réactions de génotypage
sur le système StepOne, voir le Guide de mise en route pour les réactions de
génotypage sur le système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Essais personnalisés
Workflow
Si une réaction de génotypage est créée avec les essais personnalisés d’Applied
Biosystems, il est recommandé de suivre le workflow ci-dessous :
1. Commander l’essai : Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays (ci-dessous).
2. Sélectionner le master mix (page 4-17).
3. Créer l’expérience à l’aide du logiciel StepOne (page 4-17).
Essais Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays
Description des
produits
Les essais Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays sont des ensembles d’amorces
et de sondes TaqMan conçus, synthétisés et formulés par le service Custom TaqMan®
Genomic Assays d’après les informations de séquence transmises par l’utilisateur. Ils
servent à :
Action
Exemple
Effectuer des études de génotypage
concernant tous les polymorphismes de
nucléotides simples (SNP) possibles dans
tous les organismes
AGTTCATCCATGGTCA -->
AGTTCATACATGGTCA
Détecter les insertions/délétions (in/del) de
six bases maximum pour les études de
génotypage
AGTTCATCCATGGTCA -->
AGTTCATGGTCA
Détecter les polymorphismes de
nucléotides multiples (MNP) jusqu’à six
bases maximum pour les études de
génotypage
AGTTCATCCGGTCA -->
AGTTCATATGGTCA
Annoté : AGTTCAT[C/A]CATGGTCA
Annoté : AGTTCAT[CCAT/*]GGTCA
Annoté : AGTTCAT[CC/AT]GGTCA
Les essais utilisent les réactifs TaqMan pour amplifier et détecter les
polymorphismes spécifiques dans l’ADN génomique purifié (ADNg). Tous les
essais sont développés au moyen d’un logiciel de dessin exclusif.
Propriétés des
produits
Tous les essais Custom TaqMan SNP Genotyping Assays :
• Requièrent la création d’un fichier de soumission (à l’aide du logiciel gratuit
File Builder) avec la séquence SNP cible et l’envoi du fichier au service Custom
TaqMan® Genomic Assays.
• Nécessitent trois composants :
– 1 à 20 ng d’échantillon d’ADNg purifié par puits.
Remarque : Il est possible d’utiliser des échantillons d’ADNc. Toutefois,
Applied Biosystems ne recommande actuellement pas d’utiliser l’ADNc avec
les essais Custom TaqMan SNP Genotyping Assays.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
4-15
Chapitre 4 Réactions de génotypage
– Essai 40✕ ou 80✕ SNP Genotyping Assay (spécifique de chaque
polymorphisme). Chaque essai est composé d’amorces sens et anti-sens
spécifiques de la séquence pour amplifier le SNP concerné et de deux sondes
TaqMan MGB : une sonde marquée avec le fluorophore VIC détecte la
séquence d’allèle 1, une sonde marquée avec le fluorophore FAM détecte la
séquence d’allèle 2.
– Master mix TaqMan® Universal PCR (avec ou sans AmpErase® UNG).
• Sont conçus et optimisés pour fonctionner avec le master mix TaqMan
Universal PCR (avec ou sans AmpErase UNG), dans des conditions de
thermocyclage universelles.
• Requièrent l’amplification par PCR et une lecture en point final pour obtenir
des résultats.
Pour plus
d’informations
• Pour plus d’informations sur les derniers produits disponibles et sur leurs
recommandations d’utilisation, consulter le site Internet d’Applied Biosystems :
http://www.appliedbiosystems.com/
a. Sur la page d’accueil, sous TaqMan® Products (Produits TaqMan),
sélectionner TaqMan® SNP Genotyping Assays (Essais TaqMan SNP
Genotyping Assays).
b. Sur la page SNP Genotyping Assays (Essais SNP Genotyping Assays),
sous Custom Assays (Essais personnalisés), sélectionner Custom
TaqMan® SNP Genotyping Assays (Essais Custom TaqMan SNP
Genotyping Assays).
• Pour plus d’informations sur la commande d’essais Custom TaqMan SNP
Genotyping Assays, voir le document Custom TaqMan® Genomic Assays
Protocol: Submission Guidelines.
• Pour plus d’informations sur la préparation des réactions de PCR avec les essais
Custom TaqMan SNP Genotyping Assays, voir le document Custom TaqMan®
SNP Genotyping Assays Protocol.
4-16
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 4 Réactions de génotypage
Sélection du master mix
Master mix
disponibles
Les essais fabriqués sur commande d’Applied Biosystems pour les réactions de
génotypage sont conçus pour fonctionner avec les master mix TaqMan suivants :
Master mix
Référence
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, 200 réactions
4304437
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, 2 000 réactions
4326708
Boîte de 10, master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR
4305719
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, No AmpErase® UNG,
200 réactions
4324018
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, No AmpErase® UNG,
2 000 réactions
4326614
Boîte de 10, master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, No AmpErase® UNG
4324020
Remarque : Les réactions de génotypage ne sont pas validées avec le master mix
TaqMan® Fast Universal PCR.
Pour plus
d’informations
Pour plus d’informations sur l’utilisation des master mix TaqMan, voir le document
TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol.
Conception de l’expérience
Utilisation du
logiciel StepOne
Pour les essais personnalisés d’Applied Biosystems, utiliser le logiciel StepOne afin
de créer la réaction de génotypage. Il calcule automatiquement les volumes pour les :
• Composants du mélange réactionnel
• Dilutions d’échantillons
Remarque : Pour sélectionner un essai SNP dans le logiciel StepOne, accéder à
l’écran SNP Assays (Essais SNP) dans le workflow de l’assistant de programmation
Design Wizard ou à l’écran Plate Setup (Configuration de la plaque) dans le
workflow Advanced Setup (Configuration avancée). Dans l’écran SNP Assays
(Essais SNP) ou Plate Setup (Configuration de la plaque), il est possible de
sélectionner un essai dans la bibliothèque ou d’en créer un nouveau.
Pour plus
d’informations
Pour plus d’informations sur la création et la réalisation de réactions de génotypage
sur le système StepOne, voir le Guide de mise en route pour les réactions de
génotypage sur le système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
4-17
Chapitre 4 Réactions de génotypage
4-18
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Expériences de présence/absence 5
5
Sommaire du chapitre :
Section 5.1 À propos des expériences de présence/absence . . . 5-3
Section 5.2 Instructions de préparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
5-1
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
5-2
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Section 5.1 À propos des expériences de
présence/absence
Sommaire de la section :
Présentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4
Sélection du type d’essai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-5
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
5-3
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Présentation
Qu’est-ce qu’une
expérience de
présence/
absence ?
Une expérience de présence/absence est réalisée en point final pour indiquer la
présence ou l’absence d’une séquence d’acide nucléique spécifique (cible) dans un
échantillon. La quantité réelle de cible n’est pas déterminée.
Les expériences de présence/absence sont couramment utilisées pour détecter la
présence ou l’absence d’un pathogène, notamment de type viral ou bactérien. Par
exemple, une expérience de présence/absence peut être utilisée pour déterminer si la
bactérie Salmonella est présente dans la viande d’un hamburger. Les résultats
montrent si la bactérie Salmonella est présente ou non, mais la quantité n’est pas
déterminée.
Composants
Les réactions de PCR pour les expériences de présence/absence incluent les
composants suivants :
• Échantillon – Échantillon dans lequel la présence de la cible est inconnue.
• Réplicats – Réactions identiques contenant des composants et des volumes
identiques.
• Contrôle positif interne (IPC) – Échantillon d’ADN synthétique court ajouté
aux réactions de PCR. L’IPC peut être utilisé pour distinguer les vrais résultats
négatifs et les réactions affectées par les inhibiteurs de PCR, une préparation
incorrecte de l’expérience ou une défaillance du réactif ou de l’instrument.
• Puits de contrôle négatif avec IPC bloqué – Puits qui contient un agent de
blocage de l’IPC à la place de l’échantillon dans la réaction de PCR. Aucune
amplification ne doit se produire dans les puits de contrôle négatif avec IPC
bloqué car la réaction ne contient pas d’échantillon et l’amplification de l’IPC
est bloquée.
• Puits IPC à contrôle négatif – Puits qui contient un échantillon d’IPC et du
tampon ou de l’eau à la place de l’échantillon dans la réaction de PCR. Seul
l’échantillon d’IPC doit être amplifié dans les puits IPC à contrôle négatif car la
réaction ne contient pas d’échantillon.
Remarque : Les expériences de présence/absence peuvent être effectuées sans IPC.
Toutefois, celui-ci garantit qu’une PCR erronée n’est pas considérée comme un
résultat de test négatif.
Détection en
point final et
lecture de plaque
post-PCR
5-4
Les expériences de présence/absence sont réalisées en point final pour collecter les
données de fluorescence une fois la PCR terminée.
Pour faciliter l’identification des causes d’erreurs dans les expériences de
présence/absence, il est possible d’utiliser le système de PCR en temps réel Applied
Biosystems StepOne™ afin de réaliser une PCR en temps réel. Si le système
StepOne™ est utilisé pour l’amplification par PCR, effectuer séparément les lectures
pré-PCR et post-PCR.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Fonctionnement
des expériences
de présence/
absence
Pendant la PCR, les sondes marquées par un fluorophore s’hybrident spécifiquement
sur la cible complémentaire entre les sites d’amorces sens et anti-sens de
l’échantillon d’ADN. Pendant l’extension, la polymérase AmpliTaq Gold® DNA
Polymerase clive les sondes hybridées dans chaque échantillon contenant la cible.
Le clivage de chaque sonde spécifique sépare le reporter du quencher, ce qui
augmente la fluorescence du reporter.
Après la réaction de PCR, l’instrument StepOne™ lit la fluorescence générée pendant
l’amplification par PCR. Les signaux fluorescents sont utilisés pour déterminer la
présence ou l’absence de la cible dans chaque échantillon. Les signaux du reporter
sont normalisés sur l’émission d’une référence passive, comme suit :
Rn (TT)
=
Intensité de l’émission de la séquence du gène cible
Intensité de l’émission de la référence passive
Rn (IPC) =
Intensité de l’émission du contrôle positif interne
Intensité de l’émission de la référence passive
Incorporation d’un IPC
Un IPC est un deuxième ensemble d’amorces et de sondes TaqMan® ajouté à la
plaque de réactions pour détecter un acide nucléique constitutif présentant un faible
nombre de copies. L’IPC et la cible sont amplifiés simultanément dans le même puits
de réaction. Si un puits ne présente pas d’amplification, le logiciel StepOne™ utilise
le signal positif de l’IPC pour confirmer l’amplification nulle du puits par absence de
séquence cible, et non à cause d’une imprécision de pipetage ou d’une inhibition.
Remarque : Les expériences de présence/absence peuvent être effectuées sans IPC.
Toutefois, celui-ci garantit qu’une PCR erronée n’est pas considérée comme un
résultat de test négatif.
Workflow
Avant de démarrer une expérience de présence/absence sur le système StepOne, elle
doit être préparée comme suit :
1. Sélectionner le type d’essai (ci-dessous).
2. Consulter les instructions de préparation selon le type d’essai sélectionné
(Section 5.2 à la page 5-9).
Sélection du type d’essai
Lors de la création d’une expérience avec le logiciel StepOne, il est possible de
sélectionner les types d’essais suivants pour les expériences de présence/absence :
• En stock/fabriqués sur commande (page 5-6)
• Personnalisés (page 5-7)
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
5-5
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Cette section répertorie les produits disponibles pour chaque type d’essai.
Remarque : Les essais sont spécifiques de la cible étudiée. Les master mix
contiennent les autres composants nécessaires à la réaction de PCR.
Remarque : Les réactifs TaqMan® Fast et SYBR® Green ne sont pas validés pour les
expériences de présence/absence.
Essais en
stock/fabriqués
sur commande
Produit
Attributs
Essais TaqMan® Gene
Expression Assays
• Ensembles préconçus d’amorces et de sondes
spécifiques pour les gènes de l’homme, de la souris,
du rat, de Arabidopsis, Drosophila, C. elegans,
C. familiares (chien) et Rhésus.
• Format prêt à l’emploi en un seul tube, disponible sous la
forme d’essais en stock ou fabriqués sur commande.
Essais TaqMan®
Endogenous Control
Assays
• Essais de contrôle endogène optimisés, préformulés et
prêts à l’emploi.
• Quantification économique de l’expression génétique pour
l’homme, la souris, le rat, les espèces Arabidopsis,
Drosophila et toutes les espèces eucaryotes.
• Choix entre les fluorophores FAM™ et VIC® (limité en
amorces).
Remarque : Les essais
TaqMan Endogenous
Control Assays existent
sous la forme d’essais
TaqMan Gene Expression
en stock.
Essais Custom TaqMan®
Gene Expression Assays
• Tous les organismes ou espèces.
• Choix de la cible.
• Format prêt à l’emploi en un seul tube.
Master mix TaqMan® 2✕
Universal PCR (avec ou
sans AmpErase® UNG)
• Performances optimales pour les quantifications en
TaqMan® à partir d’échantillons d’ADNc ou d’ADN.
• Contient des composants qui assurent d’excellentes
performances aux essais.
• L’utilisation d’un seul réactif pour tous les essais simplifie
le processus expérimental.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Pour obtenir des instructions de préparation des expériences avec des essais en
stock/fabriqués sur commande, voir page 5-10.
5-6
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Essais
personnalisés
Produit
Attributs
Sondes et amorces
TaqMan® personnalisées
• Tous les organismes ou espèces.
• Choix des fluorophores, quenchers et échelles de
synthèse.
• Compatibles avec le logiciel Primer Express® et les
recommandations de préparation des essais d’Applied
Biosystems.
Logiciel Primer Express®
Logiciel de dessin d’amorces et de sondes pour la PCR en
temps réel.
Master mix TaqMan® 2✕
Universal PCR (avec ou
sans AmpErase® UNG)
• Performances optimales pour les quantifications en
TaqMan® à partir d’échantillons d’ADNc ou d’ADN.
• Contient des composants qui assurent d’excellentes
performances aux essais.
• L’utilisation d’un seul réactif pour tous les essais simplifie
le processus expérimental.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Pour obtenir des instructions de préparation des expériences avec des essais
personnalisés, voir page 5-15.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
5-7
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
5-8
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Section 5.2 Instructions de préparation
Sommaire de la section :
Essais en stock/fabriqués sur commande . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
Essais TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
Essais Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12
Réactifs TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents . . . . . . . 5-13
Sélection du master mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-14
Conception de l’expérience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15
Essais personnalisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
5-9
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Essais en stock/fabriqués sur commande
Workflow
Si le type d’essai sélectionné dans le logiciel StepOne™ est Inventoried/Made to
Order (En stock/Fabriqué sur commande), Applied Biosystems recommande de
suivre le workflow ci-dessous :
1. Sélectionner l’essai :
• Essais TaqMan® Gene Expression Assays (ci-dessous).
• Essais Custom TaqMan® Gene Expression Assays (page 5-12).
2. Utiliser les réactifs TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents
(page 5-13).
Remarque : Les expériences de présence/absence peuvent être effectuées sans
IPC. Toutefois, celui-ci garantit qu’une PCR erronée n’est pas considérée
comme un résultat de test négatif.
3. Sélectionner le master mix (page 5-14).
4. Créer l’expérience à l’aide du logiciel StepOne (page 5-15).
Essais TaqMan® Gene Expression Assays
Description des
produits
Les essais TaqMan® Gene Expression Assays comprennent une gamme complète
d’ensembles d’amorces et de sondes en stock et fabriqués sur commande
compatibles avec les expériences de présence/absence sur les gènes de l’homme,
de la souris, du rat, de Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (chien) et
Rhésus.
Chaque essai est créé à l’aide d’un processus automatisé soumis à des contrôles
qualité. Les essais en stock sont fabriqués et intégrés aux réserves. Les essais
fabriqués sur commande sont préconçus et fabriqués lors de la commande.
Propriétés des
produits
5-10
Tous les essais TaqMan Gene Expression Assays :
• Nécessitent trois composants :
– 1 à 100 ng d’échantillon d’ADNc (converti à partir d’ARN) par puits, avec la
même quantité d’ADNc dans chaque puits de l’étude.
– Mélange 20✕ d’essai Gene Expression Assay Mix (spécifique de chaque
cible). Chaque mix primers-sonde contient deux amorces PCR non marquées
et une sonde TaqMan® MGB (ligand du petit sillon) marquée par le
fluorophore FAM™ dans un mix prêt à l’emploi à 20✕. Les concentrations
finales à 1✕ sont de 250 nM pour la sonde et de 900 nM pour chaque
amorce.
– Master mix TaqMan® Universal PCR (avec ou sans AmpErase® UNG).
• Sont conçus et optimisés pour fonctionner avec le master mix TaqMan
Universal PCR (avec ou sans AmpErase UNG), dans des conditions de
thermocyclage universelles.
• Si possible, amplifier l’ADNc cible sans amplifier l’ADN génomique (suffixe
m dans l’ID de l’essai) en créant des sondes spécifiques des jonctions exonexon.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Essais
disponibles
Les essais TaqMan Gene Expression Assays sont disponibles pour les gènes de
l’homme, de la souris, du rat, de Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares
(chien) et Rhésus. Numéros de référence :
• Réf. 4331182 pour les essais en stock
• Réf. 4351372 pour les essais fabriqués sur commande
Le préfixe du nom de l’essai indique l’espèce pour laquelle il a été conçu : Hs pour
Homo sapiens (homme), Mm pour Mus musculus (souris), Rn pour Rattus norvegicus
(rat), At pour Arabidopsis thaliana, Dm pour Drosophila melanogaster, Ce pour
C. elegans, Cf pour C. familiares (chien) et Rh pour Rhésus.
Le suffixe du nom de l’essai indique sa position, comme décrit dans le tableau cidessous.
Suffixe
Description
_m
La sonde de l’essai porte sur une jonction d’exons, l’essai ne détecte pas
l’ADN génomique.
_s
Les amorces et les sondes de l’essai sont définies dans un exon unique,
l’essai détecte l’ADN génomique.
_g
Il est possible que les amorces et les sondes de l’essai se situent dans un
exon unique, l’essai peut détecter l’ADN génomique.
_mH
_sH
_gH
_u
L’essai a été conçu pour un transcrit d’une famille de gènes présentant une
homologie de séquence élevée. L’essai prévoit une différence de 10 CT à
15 CT entre le gène cible et le gène ayant l’homologie de séquence la plus
proche. Par conséquent, l’essai détecte le transcrit cible avec une
discrimination (sensibilité) 1 000 à 3 000 fois supérieure au transcrit
homologue le plus proche s’ils présentent le même nombre de copies dans
l’échantillon.
L’amplicon de l’essai porte sur une jonction d’exons et la sonde se situe
entièrement dans l’un des exons concernés.
Essais TaqMan® Endogenous Control Assays
Les essais TaqMan® Endogenous Control Assays existent sous la forme d’essais
TaqMan Gene Expression Assays en stock (réf. 4331182). Les essais TaqMan
Endogenous Control Assays sont :
• Disponibles sous la forme d’un essai TaqMan Gene Expression Assay avec une
sonde TaqMan MGB marquée par le fluorophore FAM™ dans un tube unique,
préformulé à 20✕.
• Disponibles pour l’homme, la souris et le rat, avec des sondes TaqMan MGB
marquées par le fluorophore VIC® ou FAM™. Les contrôles endogènes TaqMan
marqués par le fluorophore VIC sont limités en amorces.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
5-11
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Pour plus
d’informations
• Pour plus d’informations sur les derniers produits disponibles et sur leurs
recommandations d’utilisation, consulter le site Internet d’Applied Biosystems :
http://www.appliedbiosystems.com/
a. Sur la page d’accueil, sous TaqMan® Products (Produits TaqMan),
sélectionner TaqMan® Gene Expression Assays (Essais TaqMan Gene
Expression Assays).
b. Sur la page Gene Expression Assays & Arrays (Essais et puces Gene
Expression Assays & Arrays), sélectionner TaqMan® Gene Expression
Assays (Essais TaqMan Gene Expression Assays) sous Individual Assays
(Essais individuels).
• Pour plus d’informations sur les essais Custom TaqMan Endogenous Control
Assays, voir le document Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select
an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note.
• Pour plus d’informations sur la préparation des réactions de PCR en utilisant les
essais TaqMan Gene Expression Assays, voir le document TaqMan® Gene
Expression Assays Protocol.
Essais Custom TaqMan® Gene Expression Assays
Description des
produits
Les essais Custom TaqMan® Gene Expression Assays sont des ensembles d’amorces
et de sondes TaqMan conçus, synthétisés et formulés par le service Custom TaqMan®
Genomic Assays d’après les informations de séquence transmises par l’utilisateur. Ils
permettent d’effectuer des expériences de présence/absence sur tous les gènes ou
variants d’épissage dans n’importe quel organisme.
Les essais utilisent des réactifs TaqMan pour amplifier et détecter la cible dans les
échantillons d’ADNc. Tous les essais sont développés au moyen d’un logiciel de
dessin exclusif.
Propriétés des
produits
5-12
Tous les essais Custom TaqMan Gene Expression Assays :
• Requièrent la création d’un fichier de soumission (à l’aide du logiciel gratuit
File Builder) avec la séquence cible et l’envoi du fichier au service Custom
TaqMan Genomic Assays.
• Nécessitent trois composants :
– 1 à 100 ng d’échantillon d’ADNc (converti à partir d’ARN) par puits, avec la
même quantité d’ADNc dans chaque puits de l’étude.
– Essai 20✕ Gene Expression Assay ou 60✕ Gene Expression Assay
(spécifique de chaque cible). Chaque essai contient deux amorces
spécifiques de la cible et une sonde TaqMan MGB marquée par le
fluorophore FAM™ dans un mix prêt à l’emploi à 20✕ ou à 60✕. Les
concentrations finales à 1✕ sont de 250 nM pour la sonde et de 900 nM pour
chaque amorce.
– Master mix TaqMan® Universal PCR (avec ou sans AmpErase® UNG).
• Sont conçus et optimisés pour fonctionner avec le master mix TaqMan
Universal PCR (avec ou sans AmpErase UNG), dans des conditions de
thermocyclage universelles.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Pour plus
d’informations
• Pour plus d’informations sur les derniers produits disponibles et sur leurs
recommandations d’utilisation, consulter le site Internet d’Applied Biosystems :
http://www.appliedbiosystems.com/
a. Sur la page d’accueil, sous TaqMan® Products (Produits TaqMan),
sélectionner TaqMan® Gene Expression Assays (Essais TaqMan Gene
Expression Assays).
b. Sur la page Gene Expression Assays & Arrays (Essais et puces Gene
Expression Assays & Arrays), sélectionner Custom TaqMan® Gene
Expression Assays (Essais Custom TaqMan Gene Expression Assays)
sous Individual Assays (Essais individuels).
• Pour plus d’informations sur la commande d’essais Custom TaqMan Gene
Expression Assays, voir le document Custom TaqMan® Genomic Assays
Protocol: Submission Guidelines.
• Pour plus d’informations sur la préparation des réactions de PCR en utilisant les
essais Custom TaqMan Gene Expression Assays, voir le document Custom
TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.
Réactifs TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents
Description des
produits
Les réactifs Applied Biosystems TaqMan® Exogenous Internal Positive Control
Reagents contiennent :
• Un contrôle positif interne (IPC) avec des amorces et sondes préconçues
• Un échantillon d’ADN pour l’IPC
• Un contrôle de blocage pour l’IPC
Les réactifs sont conçus pour :
• Distinguer les différents types de résultats négatifs :
– Une assignation négative pour la cible et une assignation positive pour l’IPC
indiquent qu’aucune cible n’est présente.
– Une assignation négative pour la cible et pour l’IPC suggère l’inhibition de la
PCR.
• Remplacer les contrôles endogènes.
• Permettre la coamplification de l’IPC et de la cible sans compromettre
l’amplification de la cible.
• Détecter l’IPC en utilisant une sonde marquée par le fluorophore VIC®.
• Détecter la cible en utilisant une sonde marquée par le fluorophore FAM™.
Propriétés des
produits
Les TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents Kits :
• Nécessitent les composants suivants :
– Échantillon d’ADN.
– Essai TaqMan pour la cible concernée.
– Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR.
• Sont conçus et optimisés pour fonctionner avec le master mix TaqMan 2✕
Universal PCR, dans des conditions de thermocyclage universelles.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
5-13
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Kits disponibles
Les TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents Kits suivants sont
disponibles auprès d’Applied Biosystems :
Kit
Référence
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents with
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (with VIC® dye)
4308320
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents
4308323
®
Remarque : Si ce kit est utilisé, un de ces réactifs TaqMan doit être
acheté séparément :
• TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (réf. 4304437)
• TaqMan® PCR Core Reagents Kit (réf. N808-0228)
Pour plus
d’informations
Pour plus d’informations sur la préparation des réactions de PCR avec les réactifs
TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents, voir le document TaqMan®
Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol.
Sélection du master mix
Master mix
disponibles
Les essais en stock/fabriqués sur commande d’Applied Biosystems pour les
expériences de présence/absence sont conçus pour fonctionner avec les master mix
TaqMan® suivants :
Master mix
Référence
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, 200 réactions
4304437
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, 2 000 réactions
4326708
Boîte de 10, master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR
4305719
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, No AmpErase® UNG,
200 réactions
4324018
Master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, No AmpErase® UNG,
2 000 réactions
4326614
Boîte de 10, master mix TaqMan® 2✕ Universal PCR, No AmpErase® UNG
4324020
TaqMan® PCR Core Reagents Kit
N808-0228
Remarque : En cas d’achat du TaqMan® Exogenous Internal Positive Control
Reagents with TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (réf. 4308320), il n’est pas
nécessaire de se procurer le master mix séparément.
Remarque : Les expériences de présence/absence ne sont pas validées avec le master
mix TaqMan® Fast Universal PCR.
Pour plus
d’informations
5-14
Pour plus d’informations sur l’utilisation des réactifs TaqMan, voir le document
TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
Conception de l’expérience
Utilisation du
logiciel StepOne
Pour les essais en stock/fabriqués sur commande d’Applied Biosystems, utiliser le
logiciel StepOne afin de créer l’expérience de présence/absence. Il calcule
automatiquement les volumes pour les :
• Composants du mélange réactionnel
• Contrôles et échantillons
• Dilutions d’échantillons
Remarque : Pour sélectionner le type d’essai (en stock/fabriqué sur commande) dans
le logiciel StepOne, accéder à l’écran Reaction Setup (Préparation des réactions)
dans le workflow de l’assistant de programmation Design Wizard ou Advanced
Setup (Configuration avancée), puis sélectionner Inventoried/Made to Order (En
stock/Fabriqué sur commande) dans le menu déroulant Assay Type (Type d’essai).
Pour plus
d’informations
Pour plus d’informations sur la création et la réalisation des expériences de
présence/absence sur le système StepOne, voir le document Applied Biosystems
StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence
Experiments.
Essais personnalisés
Workflow
Si le type d’essai Custom (Personnalisé) est sélectionné dans le logiciel StepOne™
pour une expérience de présence/absence (c’est-à-dire pour créer des amorces et des
sondes personnalisées), il est recommandé de suivre le workflow des instructions de
préparation des essais d’Applied Biosystems :
1. Créer des amorces et des sondes à l’aide du logiciel Primer Express®
(page 3-21).
2. Sélectionner les réactifs adéquats (page 3-24).
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore
TAMRA™ comme reporter ou quencher avec le système StepOne.
Remarque : Les réactifs TaqMan® Fast et SYBR® Green ne sont pas validés
pour les expériences de présence/absence.
3. Utiliser les conditions de thermocyclage recommandées (page 3-26).
4. Commencer avec les concentrations d’amorce et de sonde par défaut.
Si nécessaire, optimiser les concentrations d’amorce (page 3-29) et de
sonde (page 3-33).
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
5-15
Chapitre 5 Expériences de présence/absence
IMPORTANT ! Ces étapes permettent de concevoir et d’optimiser les essais de
manière fiable et rapide uniquement lorsqu’elles sont utilisées dans leur globalité.
Respecter l’ensemble du processus pour atteindre des résultats optimaux. Pour
obtenir une description plus détaillée des instructions de préparation des essais
d’Applied Biosystems, voir l’Annexe C.
Remarque : Pour sélectionner le type d’essai Custom (Personnalisé) dans le logiciel
StepOne, accéder à l’écran Reaction Setup (Préparation des réactions) dans le
workflow de l’assistant de programmation Design Wizard ou Advanced Setup
(Configuration avancée), puis sélectionner Custom (Personnalisé) dans le menu
déroulant Assay Type (Type d’essai).
5-16
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Formule
A
A
Formule pour les expériences de quantification relative par
la méthode de comparaison des valeurs de CT (∆∆CT)
Formule
La quantité de cible, normalisée sur un contrôle endogène et par rapport un
échantillon de référence, est calculée par la formule suivante :
2 –∆∆CT
Dérivée de la
formule
L’équation qui décrit l’amplification exponentielle de la PCR est :
Xn = Xo × ( 1 + EX )n
où :
•
•
•
•
•
xn = nombre de molécules de cible au cycle n
xo = nombre initial des molécules de cible
Ex = efficacité de l’amplification de la cible
n = nombre de cycles
Xo = nombre initial des molécules de cible
Le cycle seuil (CT) indique le nombre de cycles où la quantité de cible amplifiée
atteint un seuil défini. Ainsi,
X T = X o × ( 1 + E X ) C T, X = K X
où :
• xT = nombre seuil de molécules de cible
• CT, X = cycle seuil pour l’amplification de la cible
• KX = constantes
Une équation identique est utilisée pour la réaction du contrôle endogène :
R T = R o × ( 1 + E R ) CT, R = K R
où :
• RT = nombre seuil des molécules de référence
• Ro = nombre initial des molécules de référence
• ER = efficacité de l’amplification de la référence
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
A-1
Annexe A Formule
• CT, R = cycle seuil pour l’amplification de la référence
• KR = constantes
La division de XT par RT produit l’expression suivante :
C
X o × ( 1 + E X ) T, X K X
X
= ------ = K
-----T- = ---------------------------------------C
RT
R o × ( 1 + E R ) T, R K R
Les valeurs exactes de XT et RT dépendent de plusieurs facteurs, notamment :
• Le reporter utilisé dans la sonde
• Les effets contextuels de la séquence sur les propriétés de fluorescence de la
sonde
• L’efficacité du clivage de la sonde
• La pureté de la sonde
• Le paramétrage du seuil de fluorescence
Par conséquent, la constante K ne doit pas nécessairement être égale à 1.
Les efficacités supposées de la cible et de la référence sont les mêmes :
E X = ER = E
C –C
X
-----o × ( 1 + E ) T, X T, R= K
Ro
Ou
XN × ( 1 + E )
∆C T
=K
où :
• XN = XO/RO, quantité de cible normalisée
• ∆CT = CT, X – CT, R, différence de cycle seuil pour la cible et la référence
La réorganisation produit l’expression suivante :
XN = K × ( 1 + E )
A-2
– ∆C T
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Annexe A Formule
L’étape finale consiste à diviser la valeur XN d’un échantillon (q) par la valeur XN de
l’échantillon de référence (cb) :
– ∆C
X N, q
– ∆ ∆C T
K × ( 1 + E ) T, q
- == ( 1 + E )
----------- = ----------------------------------------– ∆C T, cb
X N, cb
K × (1 + E )
où :
• ∆∆CT = ∆CT, q – ∆CT, cb
Pour les amplicons générés et optimisés selon les instructions de préparation des
essais d’Applied Biosystems (taille d’amplicon <150 pb), l’efficacité est proche de 1.
Par conséquent, la quantité de cible, normalisée sur un contrôle endogène et par
rapport à un échantillon de référence, est calculée par la formule :
2 –∆∆CT
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
A-3
Annexe A Formule
A-4
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Limitation des amorces dans la PCR multiplexB
B
Pour générer une quantification en multiplex précise, il est important que
l’amplification d’une espèce ne domine pas l’autre. Sinon, l’amplification d’une
espèce très abondante peut empêcher celle de l’espèce moins abondante. Si l’espèce
la moins abondante n’est pas amplifiée correctement, l’expérience peut produire
des résultats imprécis. Dans les cas extrêmes, la détection de l’espèce la moins
abondante peut être totalement inhibée. Cette situation peut être évitée en limitant
la concentration des amorces utilisées pour amplifier l’espèce la plus abondante,
ce qui « désamorce » l’amplification aussitôt après la détermination de la valeur CT.
La limitation des amorces n’épuise pas les composants de la réaction communs aux
deux essais, ce qui permet à l’amplification de l’espèce la moins abondante de se
poursuivre très efficacement. Si l’espèce la plus abondante n’est pas choisie,
il convient de la déterminer avant d’effectuer la PCR multiplex en séparant les deux
cibles dans des tubes distincts. Les deux amplifications doivent être limitées en
amorces si aucune des espèces n’est constamment plus abondante que l’autre.
Prise en compte
de l’abondance
relative de la
cible et de la
référence
Matrice de
limitation des
amorces
En appliquant la limitation des amorces aux amplifications de la cible et du contrôle
endogène, l’abondance relative des deux espèces doit être prise en compte. Pour les
expériences de quantification, il est possible d’utiliser l’ARNr comme contrôle
endogène. La concentration d’ARNr dans l’ARN total est toujours supérieure à celle
de l’ARNm cible. Par conséquent, dans les réactions multiplex qui amplifient la cible
et l’ARNr, seule la concentration des amorces d’ARNr doit être limitée.
Pour définir les concentrations de limites des amorces, réaliser une matrice
des concentrations d’amorces sens et anti-sens. L’objectif est d’identifier les
concentrations d’amorces qui réduisent la valeur ∆Rn de l’essai sans affecter la
valeur CT. Le tableau ci-dessous montre une matrice recommandée pour les
amorces sens et anti-sens dont les concentrations varient de 20 à 100 nM.
Remarque : Bien que le respect de tous les critères de conception facilite
l’identification des concentrations limites des amorces, ce n’est pas forcément
applicable à tous les essais. Si une expérience de matrice de limitation des amorces
ne permet pas d’identifier les concentrations requises, il est nécessaire de redéfinir
au moins une amorce ou d’effectuer les réactions dans des tubes distincts.
Amorce sens :
Amorce anti-sens :
100 nM
100 nM
100 nM
80 nM
100 nM
60 nM
100 nM
40 nM
100 nM
20 nM
Amorce sens :
Amorce anti-sens :
80 nM
100 nM
80 nM
80 nM
80 nM
60 nM
80 nM
40 nM
80 nM
20 nM
Amorce sens :
Amorce anti-sens :
60 nM
100 nM
60 nM
80 nM
60 nM
60 nM
60 nM
40 nM
60 nM
20 nM
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
B-1
Annexe B Limitation des amorces dans la PCR multiplex
Amorce sens :
Amorce anti-sens :
40 nM
100 nM
40 nM
80 nM
40 nM
60 nM
40 nM
40 nM
40 nM
20 nM
Amorce sens :
Amorce anti-sens :
20 nM
100 nM
20 nM
80 nM
20 nM
60 nM
20 nM
40 nM
20 nM
20 nM
Exemple
Les résultats d’une expérience de matrice de limitation des amorces sont indiqués
dans la Figure B-1 à la page B-3 :
• La Figure B-1a montre que la valeur CT n’est notablement affectée que si la
concentration des amorces est réduite sous la barre des 50 nM environ. La zone
de plateau montre la région dans laquelle la concentration limite des amorces
adéquate est possible. Dans cette zone, la valeur CT (et par conséquent la valeur
de quantification correspondante) reste inchangée, tandis que la valeur ∆Rn et
le rendement du produit correspondant sont considérablement réduits.
• La Figure B-1b montre la relation entre la concentration des amorces et la
valeur ∆Rn. La figure démontre qu’il est possible d’atteindre des rendements de
produit inférieurs en diminuant la concentration des amorces sens et anti-sens.
Dans cet exemple, la concentration des amorces limitées doit être d’au moins
50 nM pour les amorces sens et anti-sens afin de produire les meilleurs résultats.
La concentration de sonde doit rester à un niveau optimal même lorsque l’essai est
limité en amorces afin de garantir un signal suffisant pour que le logiciel obtienne
des données multicomponentielles précises.
B-2
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Annexe B
Limitation des amorces dans la PCR multiplex
Figure B-1 Résultats de l’expérience de matrice de limitation des amorces
(a) Montre dans quelle mesure la valeur CT est affectée par l’écart de
concentration des amorces sens et anti-sens. La zone de plateau montre la
région où la valeur CT reste constante.
(b) Montre la réduction des valeurs de ∆Rn lorsque la concentration des amorces
diminue.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
B-3
Annexe B Limitation des amorces dans la PCR multiplex
B-4
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Instructions de préparation des essais C
À propos des
instructions de
préparation des
essais
C
Si des essais (amorces et sondes) personnalisés sont créés, il est recommandé de
suivre les instructions de préparation des essais d’Applied Biosystems. Les
instructions de préparation des essais expliquent la marche à suivre :
1. Créer des amorces et des sondes à l’aide du logiciel Primer Express® –
Le logiciel Primer Express utilise une série de paramètres par défaut permettant
la sélection automatique des ensembles d’amorces et de sondes.
2. Sélectionner les réactifs appropriés – Plusieurs réactifs TaqMan® et SYBR®
Green sont disponibles. Les réactifs utilisés dépendent du type d’essai.
3. Utiliser les conditions de thermocyclage recommandées – Appliquer ces
conditions selon l’échantillon (ADN/ADNc, ARN avec PCR 1 étape et ARN
avec PCR 2 étapes).
Remarque : Les réactifs Fast et standard nécessitent des conditions de
thermocyclage différentes.
4. Utiliser les concentrations d’amorces et de sonde par défaut ou les
optimiser – D’après les instructions de préparation des essais
d’Applied Biosystems, il est possible d’utiliser les concentrations d’amorces
et de sonde par défaut pour les essais optimisés en simplex ou d’optimiser les
concentrations d’amorces et de sonde.
IMPORTANT ! Ces étapes permettent de concevoir et d’optimiser les essais de
manière fiable et rapide uniquement lorsqu’elles sont utilisées dans leur globalité.
Respecter l’ensemble du processus pour atteindre des résultats optimaux.
Remarque : Les instructions de préparation des essais d’Applied Biosystems ne
garantissent pas les mêmes niveaux de performances et de sensibilité pour tous les
essais. Même les critères de conception les plus scrupuleux ne peuvent pas anticiper
toutes les éventuelles variations entre deux systèmes d’essai.
Conclusions pour
les expériences
de quantification
En règle générale, l’utilisation des instructions de préparation des essais pour les
expériences de quantification permet d’arriver aux conclusions suivantes :
• Avec la plupart des essais TaqMan, des concentrations de 900 nM pour les
amorces et de 250-nM pour la sonde permettent d’obtenir un essai à
reproductibilité et à sensibilité très fortes lorsque l’ADN ou l’ADNc est utilisé
comme matrice génétique.
• Du fait d’une détection non spécifique, l’utilisation du fluorophore SYBR®
Green I nécessite souvent une étape d’optimisation de la concentration en
amorces. Toutefois, si les instructions sont suivies en intégralité, la concentration
des amorces sens et anti-sens à 50 nM produisent généralement une forte
amplification avec un bon niveau de spécificité lorsque l’ADN ou l’ADNc est
utilisé comme matrice génétique. Vérifier ce résultat en analysant la courbe de
fusion ou le dépôt sur gel pour contrôler si un produit non spécifique se forme.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
C-1
Annexe C Instructions de préparation des essais
• La plupart des essais TaqMan doivent permettre la détection et la quantification
précise de <50 copies d’une cible, avec la plus grande sensibilité possible.
• Les essais SYBR Green fournissent des performances similaires. Toutefois,
il est possible que la formation de produit non spécifique augmente la limite
de détection minimale.
Conclusions pour
les réactions de
génotypage
C-2
En règle générale, l’utilisation des instructions de préparation des essais pour les
réactions de génotypage permet d’arriver à la conclusion suivante :
Des amorces à 900 nM, des sondes à 200 nM et de 1 à 20 ng d’ADN génomique
permettent d’obtenir des essais aux résultats reproductibles et sensibles.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Bibliographie
Afonina, I., Zivarts, M., Kutyavin, I., et al. 1997. Efficient priming of PCR with
short oligonucleotides conjugated to a minor groove binder. Nucleic Acids Res.
25:2657–2660.
Förster, V. T. 1948. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.
Physics (Leipzig) 2:55–75.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous
amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10:413–417.
Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. 1993. Kinetic PCR:Real time
monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11:1026–1030.
Kutyavin, I.V., Lukhtanov, E.A., Gamper, H.B., and Meyer, R.B. 1997.
Oligonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole tripeptides: base
composition and backbone effects on hybridization. Nucleic Acids Res.
25:3718–3723.
Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature
339:237–238.
Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data
Using Real-Time Quantitative PCR and the 2–∆∆CT Method. Methods 25:402–408.
Longo, M.C., Berninger, M.S., and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene
93:125–128.
Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin
genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230:1350–1354.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Bibliographie-1
Bibliographie
Bibliographie-2
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire
Advanced Setup
(Configuration avancée) Fonction du logiciel StepOne™ qui permet de configurer
l’expérience selon le modèle expérimental établi.
Agent de blocage
d’IPC
Réactif ajouté aux réactions de PCR pour bloquer l’amplification du contrôle positif
interne (IPC).
AIF
Acronyme de « assay information file » (fichier d’informations sur l’essai).
Allèles
Pour une cible donnée, toutes les séquences différentes présentes dans une population.
Amorce anti-sens
Oligonucléotide homologue à l’extrémité 3′ de la cible. L’amorce anti-sens et l’amorce
sens sont utilisées simultanément dans les réactions de PCR pour amplifier la cible.
Amorce sens
Oligonucléotide homologue à l’extrémité 5′ de la cible. L’amorce anti-sens et l’amorce
sens sont utilisées simultanément dans les réactions de PCR pour amplifier la cible.
Amplicon
Segment d’ADN amplifié pendant la PCR.
Amplification
Période d’activité de l’instrument pendant laquelle la PCR est en phase d’élongation
de la cible. Dans les expériences de quantification, les données de fluorescence
collectées durant l’amplification sont affichées dans une courbe d’amplification et
utilisées pour calculer les résultats. Si l’amplification est incluse dans les réactions de
génotypage ou les expériences de présence/absence réalisées sur l’instrument
StepOne™, les données de fluorescence collectées pendant l’amplification sont
affichées dans une courbe d’amplification et peuvent être utilisées pour identifier les
causes des erreurs.
Amplification non
conforme
Pour un ensemble de données, point de données de valeur considérablement inférieure
ou supérieure aux autres.
Analyse en point
final
Expérience dans laquelle les données de fluorescence collectées dans une lecture postPCR sont utilisées pour calculer le résultat des réactions de génotypage ou des
expériences de présence/absence.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire-1
Glossaire
Application
Fait référence au processus complet de l’activité du système StepOne™, notamment la
configuration, la réalisation et l’analyse. Le système StepOne™ peut réaliser plusieurs
applications :
•
•
•
•
•
•
Application
Quantification absolue par les courbes standard
Quantification relative par les courbes standard
Quantification – Comparaison des valeurs de CT (∆∆CT)
Courbe de fusion
Génotypage
Présence/absence
Le système StepOne™ peut réaliser plusieurs applications :
•
•
•
•
Quantification absolue par les courbes standard
Comparaison des valeurs de CT (∆∆CT)
Quantification relative par les courbes standard
Courbe de fusion (non disponible dans l’assistant de programmation Design
Wizard)
• Génotypage
• Présence/absence
L’application sélectionnée détermine le contenu des écrans Setup (Configuration),
Run (Démarrer) et Analysis (Analyse).
Auto∆
Réglage qui sert à augmenter ou à diminuer la température et/ou la durée de chaque
cycle postérieur dans une phase de thermocyclage. Lorsque le réglage Auto∆ est
activé, les paramètres sont indiqués par une icône dans le profil thermique :
• Auto∆ activé :
• Auto∆ désactivé :
Bibliothèque
d’échantillons
Ensemble des échantillons enregistrés dans le logiciel StepOne™. La bibliothèque
contient le nom et la couleur de chaque échantillon.
Bibliothèque
d’essais SNP
Ensemble des essais SNP enregistrés dans le logiciel StepOne™.
Bibliothèque
de cibles
Ensemble des cibles enregistrées dans le logiciel StepOne™.
Calibrateur
Voir échantillon de référence.
Calibration spatiale
Type de calibration du système StepOne™ dans lequel le système analyse les positions
des puits sur le bloc. Les données de calibration spatiale sont utilisées pour que le
logiciel puisse associer les augmentations de fluorescence pendant une réaction de
PCR à des puits spécifiques de la plaque de réactions.
Chimie
Voir réactif.
Cible
Séquence d’acide nucléique à amplifier et à détecter.
Glossaire-2
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire
Coefficient de
régression
Valeur calculée à partir de la droite de régression dans les courbes standard,
notamment la valeur R2, la pente et l’intersection avec l’axe Y. Les valeurs du
coefficient de régression permettent notamment d’évaluer la qualité des résultats par
rapport aux standards. Voir aussi courbe standard.
Collecte des
données
Pendant la réaction de PCR, processus au cours duquel un des composants recueille
les données de fluorescence dans chaque puits de la plaque de réactions. L’instrument
transforme le signal en données électroniques, lesquelles sont enregistrées dans le
fichier de l’expérience. Un point de collecte des données est indiqué par une icône
dans le profil thermique :
• Collecte des données activée :
• Collecte des données désactivée :
Comparaison des
valeurs de CT (∆∆CT)
Une des méthodes utilisées pour les expériences de quantification. Avec la
comparaison des valeurs de CT (∆∆CT), les résultats par rapport à un échantillon de
référence et à un contrôle endogène sont utilisés pour déterminer les quantités
relatives d’une cible dans les échantillons.
Configuration
autonome
Disposition du système dans laquelle l’instrument StepOne™ n’est pas connecté à un
ordinateur par le câble jaune du système StepOne™. À la place, une clé USB ( ) est
utilisée pour transférer les données entre les composants du système StepOne™. Dans
cette disposition, l’instrument StepOne™ est contrôlé par l’écran tactile de
l’instrument.
Configuration colocalisée
Disposition du système dans laquelle l’instrument StepOne™ est directement
connecté à un ordinateur co-localisé par le câble jaune du système StepOne™. Dans
cette disposition, l’instrument StepOne™ est contrôlé par l’intermédiaire du logiciel
StepOne™ installé sur l’ordinateur co-localisé.
Contrôle endogène
Cible qui doit exister à des niveaux identiques dans tous les échantillons testés.
Ce contrôle est utilisé dans les expériences de quantification relative par les courbes
standard et par la comparaison des valeurs de CT (∆∆CT) pour normaliser les signaux
de fluorescence de la cible quantifiée. Également appelé « gène de ménage ».
Contrôle négatif
(NC)
Dans les expériences du système StepOne™, fonction attribuée aux cibles ou aux
essais SNP dans les puits qui contiennent de l’eau ou du tampon à la place de
l’échantillon. Aucune amplification de la cible ne doit se produire dans les puits de
contrôle négatif.
Contrôle positif
Dans les réactions de génotypage, fonction attribuée à l’essai SNP dans les puits qui
contiennent un échantillon de génotype connu.
Contrôle positif
interne (IPC)
Dans les expériences de présence/absence, échantillon d’ADN synthétique court
ajouté aux réactions de PCR. L’IPC peut être utilisé pour distinguer les vrais résultats
négatifs et les réactions affectées par les inhibiteurs de PCR, une configuration d’essai
incorrecte ou une défaillance du réactif ou de l’instrument.
Contrôle sans
amplification (NAC)
Voir puits de contrôle négatif avec IPC bloqué.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire-3
Glossaire
Contrôle sans
échantillon (NTC)
Voir contrôle négatif (NC).
Couleur de la cible
Couleur attribuée à une cible pour l’identifier dans le plan de plaque et dans les
courbes d’analyse.
Courbe
d’amplification
Affichage des données collectées pendant la phase de thermocyclage de
l’amplification par PCR. La courbe peut représenter :
• Le reporter normalisé corrigé d’après la ligne de base (∆Rn) en fonction des
cycles
• Le reporter normalisé (Rn) en fonction des cycles
• Le cycle seuil (CT) en fonction des puits
Courbe de
dissociation
Voir courbe de fusion.
Courbe de fusion
Affichage des données collectées pendant la phase de courbe de fusion. Les pics de la
courbe de fusion peuvent indiquer la température de fusion (Tm) de la cible ou
identifier une amplification par PCR non spécifique. Il est possible d’afficher la
courbe de fusion comme un marqueur normalisé (Rn) par rapport à la température ou
comme un marqueur dérivatif (−Rn′) toujours par rapport à la température.
Courbe des
données brutes
Affichage de l’amplitude de fluorescence des puits sélectionnés pour tous les filtres.
Montre l’amplitude de fluorescence de tous les points de collecte des données pendant
la réaction.
Courbe des
multicomposantes
Affichage des données collectées pendant la phase de thermocyclage de la PCR en
temps réel. La courbe des multicomposantes montre la fluorescence pour tous les
cycles de la réaction.
Courbe des
températures
Affichage des températures de l’échantillon, du couvercle de l’instrument et du bloc
pendant la réaction.
Courbe standard
Dans les expériences de quantification absolue et de quantification relative par les
courbes standard :
• Droite moyenne sur un graphique représentant les valeurs de CT des échantillons
standard en fonction de leur quantité. Voir aussi droite de régression.
• Ensemble des standards contenant un intervalle de quantités connues. Les
données des réactions de la courbe standard sont utilisées pour générer la courbe
standard. La courbe standard est définie par le nombre de points dans la gamme,
le nombre de réplicats standard, la quantité de départ et le facteur de dilution.
Voir aussi gamme de dilutions standard.
CT
Acronyme de « cycle threshold » (cycle seuil).
CT automatique
Paramètre d’analyse selon lequel le logiciel calcule automatiquement le seuil et la
ligne de base dans la courbe d’amplification. Le logiciel utilise le seuil et la ligne de
base pour calculer le cycle seuil (CT).
Glossaire-4
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire
CT manuel
Paramètre d’analyse selon lequel l’utilisateur entre la valeur de seuil et sélectionne le
mode de calcul de la ligne de base (automatique ou manuelle). Le logiciel utilise la
valeur de seuil saisie et la ligne de base pour calculer le cycle seuil (CT).
Cycle seuil (CT)
Nombre de cycles de PCR pour lequel le ∆Rn correspond au seuil dans la courbe
d’amplification.
Delta Rn (∆Rn)
Abréviation utilisée pour « reporter normalisé corrigé d’après la ligne de base ».
Design Wizard
(Assistant de programmation) Fonction du logiciel StepOne™ qui permet de
configurer l’expérience avec par défaut les recommandations de configuration.
Diluant
Réactif utilisé pour diluer un échantillon ou un standard avant de l’ajouter à la réaction
de PCR. Le diluant peut être constitué d’eau ou de tampon.
Diluted Sample
Concentration (10✕
for Reaction Mix)
[Concentration de l’échantillon dilué (10✕ pour le mélange réactionnel)] Champ du
logiciel affiché dans l’onglet Sample Dilution Calculations (Calcul de dilution de
l’échantillon) de l’écran Reaction Setup (Préparation des réactions). Dans ce champ,
entrer la concentration de l’échantillon à ajouter au mélange réactionnel pour tous les
échantillons de l’expérience. « 10✕ for Reaction Mix » (10✕ pour le mélange
réactionnel) signifie que, pour le logiciel, l’échantillon ou le composant standard du
mélange réactionnel est à une concentration de 10✕. Par exemple, si la concentration
de l’échantillon dilué est de 50 ng/µL (10✕), la concentration de l’échantillon final
dans la réaction est de 5 ng/µL (1✕).
Droite de
régression
Dans les expériences de quantification absolue et de quantification relative par les
courbes standard, ligne la plus proche de la courbe standard. Formule de la droite de
régression :
CT = m [log (Qté)] + b
où m est la pente, b est l’intersection avec l’axe Y et Qté est la quantité standard.
Voir aussi coefficient de régression.
Échantillon
Cible testée.
Échantillon de
référence
Dans les expériences de quantification relative par les courbes standard et par la
comparaison des valeurs de CT (∆∆CT), échantillon utilisé comme base pour les
résultats de quantification relative. Également appelé « calibrateur ».
Échantillon d’ADN
(10✕)
Composant de la réaction affiché sur l’écran Reaction Setup (Préparation des
réactions). Le logiciel considère que l’échantillon d’ADN ajouté au mélange
réactionnel est à une concentration de 10✕. Par exemple, si le volume réactionnel est
de 20 µL, le volume d’échantillon calculé pour une réaction est de 2 µL.
Échantillon ou
standard (10✕)
Composant de réaction affiché dans l’onglet Reaction Mix Calculations (Calcul du
mélange réactionnel) de l’écran Reaction Setup (Préparation des réactions).
Le logiciel considère que l’échantillon ou le standard ajouté au mélange réactionnel
est à une concentration de 10✕. Par exemple, si le volume réactionnel est de 20 µL,
le volume d’échantillon ou de standard calculé pour une réaction est de 2 µL.
Écran tactile
Écran dont les touches tactiles permettent de contrôler l’instrument.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire-5
Glossaire
EFF%
Voir efficacité de l’amplification (EFF%).
Efficacité de
l’amplification
(EFF%)
Calcul de l’efficacité de l’amplification par PCR. L’efficacité de l’amplification
est calculée en utilisant la pente de la droite de régression dans la courbe standard.
Une pente proche de −3,3 indique une efficacité optimale (100 %) de l’amplification
par PCR. Plusieurs facteurs affectent l’efficacité de l’amplification :
• Intervalle des quantités standard – Pour obtenir des mesures d’efficacité
plus précises, utiliser un grand intervalle des quantités standard, de 5 à 6 logs
(x 105 à 106).
• Nombre de réplicats standard – Pour obtenir des mesures d’efficacité plus
précises, inclure les réplicats afin de diminuer les effets des imprécisions de
pipetage.
• Inhibiteurs de PCR – Présents dans la réaction, ils peuvent réduire l’efficacité
de l’amplification.
Essai
Dans le système StepOne™, réaction de PCR qui contient des amorces pour amplifier
une cible et un réactif pour détecter la cible amplifiée.
Essai SNP
Utilisée dans les réactions de génotypage, cette réaction de PCR contient deux
amorces pour amplifier le produit de la PCR et deux sondes pour détecter les
différents allèles du SNP.
Essais en stock
(Inventoried Assays) Essais TaqMan® Genomic Assays précédemment fabriqués,
conformes aux spécifications de contrôle qualité et conservés en stock.
Essais fabriqués
sur commande
(Custom Assays) Essais TaqMan® Genomic Assays fabriqués au moment de la
commande. Seuls les essais qui répondent aux spécifications de contrôle qualité pour
la fabrication sont fournis.
Étape
Composant du profil thermique. Une étape est définie par la température, la durée,
la variation de la température et l’état de la collecte des données. Dans les phases de
thermocyclage, une étape est également définie par l’état Auto∆.
Exclure un puits
Action effectuée après l’analyse pour exclure un ou plusieurs puits de toutes les
analyses avant de réanalyser les données.
Facteur de dilution
Valeur numérique qui définit la séquence des quantités dans la courbe standard.
Le facteur de dilution et la quantité de départ sont utilisés afin de calculer la quantité
standard pour chaque point de la courbe standard. Par exemple, si la courbe standard
est définie avec un facteur de dilution de 1:10 ou 10, la différence entre deux points
adjacents dans la courbe possède un facteur de 10.
Facteur de dilution
sérielle
Voir facteur de dilution.
Fichier
d’informations sur
l’essai (AIF)
Fichier de données inclus sur un CD-Rom expédié avec chaque commande d’essai.
Le nom du fichier inclut le numéro du code-barres inscrit sur la plaque de réactions.
Les informations contenues dans le fichier AIF sont délimitées par des tabulations.
Glossaire-6
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire
Fluorophore du
système
Fluorophore fabriqué par Applied Biosystems et précalibré sur le système StepOne™.
Fluorophores du système :
Fluorophore FAM™
Fluorophore JOE™
Fluorophore ROX™
Fluorophore SYBR® Green
Fluorophore VIC®
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne™.
•
•
•
•
•
Fluorophore
personnalisé
Fluorophore non fabriqué par Applied Biosystems. Il est possible d’utiliser des
fluorophores personnalisés pour effectuer des expériences de PCR en temps réel sur
le système StepOne™. Avant d’employer un fluorophore personnalisé, effectuer une
calibration spectrale des fluorophores personnalisés.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne™.
Fluorophore pur
Réactif qui contient le fluorophore. Les fluorophores purs sont utilisés pour effectuer
une calibration spectrale des fluorophores purs sur le système StepOne™. Voir aussi
fluorophore du système.
Fonction
Type de réaction effectuée dans le puits pour la cible ou l’essai SNP. Fonctions
disponibles dans les expériences du système StepOne™ :
• Inconnue
• Contrôle négatif
• Standard (expériences de quantification absolue et de quantification relative par
les courbes standard)
• Contrôle positif (réactions de génotypage)
• IPC (expériences de présence/absence)
• IPC bloqué (expériences de présence/absence)
Gamme
Voir gamme de dilutions standard.
Gamme de
dilutions standard
Dans les expériences de quantification absolue et de quantification relative par les
courbes standard, ensemble de standards contenant un intervalle de quantités connues.
La gamme de dilutions standard est préparée en diluant des standards en série. Par
exemple, la solution de standard est utilisée pour préparer le premier point de dilution,
le premier point de dilution est utilisé pour préparer le deuxième point de dilution, etc.
Les volumes nécessaires à la préparation d’une gamme de dilutions standard sont
calculés en fonction du nombre de points de dilution, du nombre de réplicats standard,
de la quantité de départ, du facteur de dilution et de la concentration du standard dans
la solution mère. Voir aussi courbe standard.
Gène de ménage
Voir contrôle endogène.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire-7
Glossaire
Graphique de
discrimination
allélique
Affichage des données collectées pendant la lecture post-PCR. Le graphique de
discrimination allélique met en rapport le signal du reporter normalisé de la sonde
spécifique de l’allèle 1 et celui du reporter normalisé de la sonde spécifique de l’allèle 2.
ID d’essai
Valeur attribuée par Applied Biosystems aux essais TaqMan® Gene Expression
Assays et TaqMan® SNP Genotyping Assays.
Inconnue
(Unknown) Dans les expériences de quantification, fonction attribuée à la cible dans
les puits qui contiennent un échantillon avec des quantités de cible inconnues.
Dans les réactions de génotypage, fonction attribuée à l’essai SNP dans les puits qui
contiennent un échantillon avec un génotype inconnu.
Dans les expériences de présence/absence, fonction attribuée à la cible dans les puits
qui contiennent un échantillon pour lequel la présence de la cible n’est pas connue.
Intersection avec
l’axe Y
Coefficient de régression calculé d’après la droite de régression de la courbe standard.
L’intersection avec l’axe Y de cette droite correspond à la valeur Y au point
d’intersection entre la droite et l’axe Y.
IPC
Acronyme de « internal positive control » (contrôle positif interne). Dans les
expériences de présence/absence, fonction attribuée à la cible IPC dans les puits qui
contiennent un échantillon d’IPC.
IPC bloqué
Dans les expériences de présence/absence, fonction attribuée à la cible IPC dans les
puits qui contiennent un agent de blocage de l’IPC à la place de l’échantillon. Voir
aussi puits de contrôle négatif avec IPC bloqué.
IPC+
Assignation de présence/absence lorsque le contrôle positif interne (IPC) est amplifié.
Lecture en point
final
Voir lecture post-PCR.
Lecture post-PCR
Utilisée dans les réactions de génotypage et les expériences de présence/absence,
collecte des données de fluorescence qui se produit après l’amplification. Dans les
réactions de génotypage, les données de fluorescence collectées pendant la lecture
post-PCR sont affichées sur le graphique de discrimination allélique et utilisées pour
produire des assignations d’allèles. Dans les expériences de présence/absence, les
données de fluorescence collectées pendant la lecture post-PCR sont affichées sur la
courbe de présence/absence et utilisées pour produire des assignations de détections.
Également appelée « lecture en point final ».
Lecture pré-PCR
Utilisée dans les réactions de génotypage et les expériences de présence/absence,
collecte des données de fluorescence qui se produit avant l’amplification. Les données
de fluorescence collectées pendant la lecture pré-PCR sont utilisées pour normaliser
les données de fluorescence en lecture post-PCR.
Ligne de base
Dans la courbe d’amplification, une ligne correspond aux niveaux de fluorescence
d’un intervalle de cycles défini. Si la ligne de base est déterminée manuellement,
Applied Biosystems recommande de sélectionner les cycles de PCR précédents pour
déterminer la ligne de base.
Glossaire-8
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire
Ligne de base
automatique
Paramètre d’analyse selon lequel le logiciel calcule les valeurs de début et de fin de la
ligne de base de la courbe d’amplification. Le logiciel utilise la ligne de base et le seuil
pour calculer le cycle seuil (CT).
Ligne de base
manuelle
Paramètre d’analyse selon lequel l’utilisateur entre les valeurs de début et de fin de la
ligne de base de la courbe d’amplification. Le logiciel utilise la ligne de base et le seuil
pour calculer les valeurs CT.
Matrice génétique
Type d’acide nucléique à ajouter à la réaction de PCR. La matrice génétique
recommandée varie en fonction de l’application.
Mélange
amorce/sonde
Composant de la réaction de PCR constitué des amorces visant à amplifier la cible et
de la sonde TaqMan® conçue pour détecter l’amplification de la cible.
Mélange
d’amorces
Composant de la réaction de PCR qui contient les amorces sens et anti-sens visant à
amplifier la cible.
Mélange de sonde
Composant de la réaction de PCR qui contient une sonde TaqMan® conçue pour
détecter l’amplification de la cible.
Mélange
réactionnel
Solution qui contient tous les composants nécessaires à la réalisation de la réaction de
PCR, hormis la matrice génétique (échantillon, standard ou contrôle).
Méthode de
quantification
Lors des expériences de quantification, méthode utilisée pour déterminer la quantité
de cible des échantillons. Trois types de méthodes sont disponibles pour les
expériences de quantification : quantification absolue par les courbes standard,
méthode de comparaison des valeurs de CT (∆∆CT) et quantification relative par les
courbes standard.
Mix primers-sonde
Composant de réaction de PCR dans les essais Applied Biosystems TaqMan® Gene
Expression Assays et TaqMan® SNP Genotyping Assays. Il contient des amorces
conçues pour amplifier une cible et une sonde TaqMan® conçue pour détecter
l’amplification de la cible.
NFQ-MGB
De l’anglais « nonfluorescent quencher-minor groove binder » (quencher non
fluorescent – ligand du petit sillon). Molécules liées à l’extrémité 3′ des sondes
TaqMan®. Lorsque la sonde est intacte, le quencher non fluorescent (NFQ) empêche
le reporter d’émettre un signal de fluorescence. Puisque le NFQ n’émet pas de
fluorescence, il produit des signaux de bruit de fond plus faibles qui donnent une
quantification plus précise. Le ligand du petit sillon (MGB) augmente la température
de fusion (Tm) sans accroître la longueur de la sonde. Il permet également de
concevoir des sondes plus courtes.
Nom de
l’expérience
Nom saisi pendant la configuration de l’expérience, utilisé pour identifier cette
dernière. Le nom d’une expérience ne peut ni dépasser 100 caractères, ni comporter
les caractères suivants : barre oblique (/), barre oblique inverse (\), signe supérieur à
(>), signe inférieur à (<), astérisque (*), point d’interrogation (?), guillemets ("), ligne
verticale (|), deux-points (:) et point-virgule (;).
Numéro rs
Voir refSNP ID.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire-9
Glossaire
PCR en temps réel
Processus de collecte des données de fluorescence pendant l’amplification par PCR.
Les données de PCR en temps réel sont utilisées pour calculer le résultat des
expériences de quantification ou pour vérifier le résultat des réactions de génotypage
ou des expériences de présence/absence.
Pente
Coefficient de régression calculé d’après la droite de régression de la courbe standard.
La pente indique l’efficacité de l’amplification par PCR pour l’essai. Une pente de −
3,3 indique une efficacité d’amplification de 100 %. Voir aussi efficacité de
l’amplification (EFF%).
Phase
Composant du profil thermique. Une phase est composée d’au moins une étape.
Phase de courbe
de fusion
Phase du profil thermique avec une incrémentation de température pour générer une
courbe de fusion.
Phase de maintien
de la température
Phase du profil thermique qui inclut au moins une étape. Par exemple, il est possible
d’ajouter une phase de maintien de la température au profil thermique pour
activer/désactiver les enzymes ou incuber une réaction.
Phase de
thermocyclage
Phase répétée du profil thermique. Si la phase de thermocyclage est utilisée pour
effectuer la PCR, elle est appelée « phase d’amplification ».
Plan de plaque
Représentation de la grille de 48 puits (6 × 8) et du contenu de la plaque de réactions.
Le logiciel peut utiliser le plan de plaque comme outil de sélection pour attribuer des
contenus de puits, afficher des attributions de puits et montrer les résultats. Le plan de
plaque est affiché dans les écrans Design Wizard (Assistant de programmation),
Advanced Setup (Configuration avancée), Run (Démarrer) et Analysis (Analyse).
Le plan de plaque peut être imprimé, inclus dans un rapport, exporté ou enregistré
sous la forme d’une diapositive en vue de préparer une présentation.
Point
Point standard d’une courbe standard. La quantité standard de chaque point de la
courbe standard est calculée en fonction de la quantité de départ et du facteur de
dilution.
Profil de
thermocyclage
Définition du volume réactionnel et du profil thermique pour l’activité de
l’instrument.
Profil thermique
Partie du profil de thermocyclage qui précise la température, la durée, la variation de
la température et les points de collecte des données pour toutes les étapes et phases de
l’activité de l’instrument.
Puits de contrôle
négatif avec IPC
bloqué
Dans les expériences de présence/absence, puits qui contient un agent de blocage de
l’IPC à la place de l’échantillon dans la réaction de PCR. Aucune amplification ne
doit se produire dans les puits de contrôle négatif avec IPC bloqué car la réaction ne
contient aucun échantillon et l’amplification de l’IPC est bloquée. Également appelé
« contrôle sans amplification » (NAC).
Puits IPC à contrôle
négatif
Dans les expériences de présence/absence, puits qui contient un échantillon d’IPC et
un tampon ou de l’eau à la place de l’échantillon dans la réaction de PCR. Seul
l’échantillon d’IPC doit être amplifié dans les puits IPC à contrôle négatif car la
réaction ne contient aucun échantillon. Voir aussi IPC+.
Glossaire-10
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire
Quantification
absolue par les
courbes standard
Une des méthodes utilisées pour les expériences de quantification. Avec la
quantification absolue par les courbes standard, les résultats par rapport aux standards
sont utilisés pour déterminer les quantités absolues d’une cible dans les échantillons.
Quantification
relative par les
courbes standard
Une des méthodes utilisées pour les expériences de quantification. Avec la
quantification relative par les courbes standard, les résultats par rapport aux standards,
à un échantillon de référence et à un contrôle endogène sont utilisés pour déterminer
les quantités relatives d’une cible dans les échantillons.
Quantité
Dans les expériences de quantification, quantité de cible dans les échantillons.
La quantité absolue peut faire référence au nombre de copies, à la masse, à la molarité
ou à la charge virale. La quantité relative fait référence au facteur de variation entre la
quantité de cible normalisée dans l’échantillon et dans l’échantillon de référence.
Quantité de départ
Lors de la définition d’une courbe standard ou d’une gamme de dilutions standard,
correspond à la quantité la plus élevée ou la plus faible.
Quantité
normalisée
Quantité de cible divisée par la quantité de contrôle endogène.
Quantité standard
Quantité connue dans la réaction de PCR.
• Dans les expériences de quantification absolue par les courbes standard,
quantité de cible connue. Les quantités standard sont définies en plusieurs
unités : la masse, le nombre de copies, la charge virale ou d’autres unités de
mesure de la quantité de cible.
• Dans les expériences de quantification relative par les courbes standard, quantité
connue dans le standard. Par exemple, la quantité standard peut faire référence à
la quantité d’ADNc ou à la quantité de solution mère. Les unités ne sont pas
pertinentes pour les expériences de quantification relative par les courbes
standard car elles s’annulent dans les calculs.
Quencher
Molécule liée à l’extrémité 3′ des sondes TaqMan® pour empêcher le reporter
d’émettre un signal de fluorescence lorsque la sonde est intacte. Avec les réactifs
TaqMan®, la molécule NFQ-MGB peut être utilisée comme quencher. Avec les
réactifs SYBR® Green, aucun quencher n’est utilisé.
IMPORTANT ! Applied Biosystems déconseille d’utiliser le fluorophore TAMRA™
comme reporter ou quencher avec le système StepOne™.
QuickStart
(Démarrage rapide) Fonction du système StepOne™ qui permet de démarrer
l’expérience sans entrer les informations de configuration de la plaque.
Réactif
Composant de la réaction de PCR utilisé pour amplifier la cible et détecter
l’amplification. Plusieurs types de réactifs sont utilisés sur le système StepOne™ :
• Les réactifs TaqMan®
• Les réactifs SYBR® Green
• Les autres réactifs
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire-11
Glossaire
Réactif SYBR®
Green
Composant de la réaction de PCR constitué de deux amorces visant à amplifier la
cible et du fluorophore SYBR® Green conçu pour détecter l’ADN double brin.
Réactif TaqMan®
Composant de la réaction de PCR constitué des amorces visant à amplifier la cible et
de la sonde TaqMan® conçue pour détecter l’amplification de la cible.
Réaction
échantillon/cible
Combinaison d’un échantillon et d’une cible dans une même réaction de PCR. Dans
l’assistant de programmation Design Wizard, chaque réaction de PCR ne peut
contenir qu’un échantillon et une cible.
Réaction
échantillon/essai
SNP
Combinaison d’un échantillon et d’un essai SNP dans une même réaction de PCR.
Chaque réaction de PCR ne peut contenir qu’un échantillon et un essai SNP.
Référence passive
Fluorophore qui émet un signal de fluorescence. Puisque le signal de référence passive
doit être cohérent sur tous les puits, il est utilisé pour normaliser le signal du reporter
afin de représenter les fluctuations de fluorescence provoquées par les différences
mineures de concentration ou de volume entre les puits. La normalisation du signal de
référence passive permet d’obtenir des données très précises.
refSNP ID
Numéro qui identifie le SNP de référence (refSNP). Généré par la base de données
des polymorphismes de nucléotides simples (dbSNP) de la variation de séquence
nucléotidique. Peut être utilisé pour rechercher un essai Applied Biosystems SNP
Genotyping Assay dans la boutique Applied Biosystems. Également appelé « numéro
rs ».
Rejeter un puits
Action effectuée par le logiciel pendant l’analyse pour retirer un ou plusieurs puits de
l’analyse en cours si une alerte spécifique est appliquée au puits.
Remote Monitoring
(Surveillance à distance) Fonction du logiciel qui permet d’afficher l’état d’un
instrument mis en réseau, d’envoyer des expériences à l’instrument et de télécharger
des expériences effectuées sur l’ordinateur.
Réplicat
Ensemble de réactions identiques dans une expérience.
Réplicats
Nombre total de réactions identiques contenant des composants et des volumes
identiques.
Reporter
Fluorophore utilisé pour détecter l’amplification. Si des réactifs TaqMan® sont
utilisés, le reporter est lié à l’extrémité 5′. Si des réactifs SYBR® Green sont utilisés,
le reporter est le fluorophore SYBR® Green.
Reporter dérivatif
(−Rn′)
Rapporté sur l’axe Y de la courbe de fusion. Le signal du reporter dérivatif est la
dérivée première négative de la fluorescence normalisée du reporter.
Reporter normalisé
(Rn)
Signal de fluorescence émis par le reporter normalisé par le signal de fluorescence de
la référence passive.
Reporter normalisé
corrigé d’après la
ligne de base (∆Rn)
Amplitude du signal de fluorescence normalisé généré par le reporter pendant
l’amplification par PCR.
Glossaire-12
∆Rn = Rn (valeur seuil) − Rn (ligne de base), où Rn = reporter normalisé.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire
Rn
Abréviation utilisée pour « reporter normalisé ».
Seuil
Niveau de fluorescence situé au-dessus de la ligne de base et dans la zone
d’amplification exponentielle de la courbe d’amplification. Le seuil peut être
déterminé automatiquement (voir valeur CT automatique) ou défini manuellement
(voir valeur CT manuelle).
Seuil de cycle
Voir cycle seuil (CT).
SNP
Acronyme de « single nucleotide polymorphism » (polymorphisme de nucléotide
unique). Les SNP peuvent comporter une base de différence ou une indel
(insertion/délétion).
Standard
Échantillon qui contient des quantités standard connues. Les réactions standard sont
utilisées dans les expériences de quantification pour générer des courbes standard.
Voir aussi courbe standard et gamme de dilutions standard.
Température de
fusion (Tm)
Point de la courbe de fusion pour lequel la valeur du reporter dérivatif est maximale,
signalant que l’ADN double brin amplifié se dissocie en ADN simple brin.
Tm
Acronyme de « melting temperature » (température de fusion).
Transcriptase
inverse
Composant de la réaction de PCR qui convertit l’ARN en ADNc. La transcriptase
inverse est ajoutée à la réaction de PCR pour effectuer la RT-PCR 1 phase.
Valeur R2
Coefficient de régression calculé d’après la droite de régression de la courbe standard.
La valeur R2 indique la proximité entre la droite de régression de la courbe standard
et les points de données CT des réactions standard. Par exemple, la valeur 1,00 indique
une corrélation parfaite entre la droite de régression et les points de données.
Variation de la
température
Vitesse de variation de la température pendant la réaction de PCR. Excepté pour la
phase de courbe de fusion, la variation de la température est définie en pourcentage.
Pour la phase de courbe de fusion, la variation de la température est définie en
incrémentations de température. Dans la vue graphique du profil thermique,
la variation de la température est indiquée par une diagonale.
Vitesse de variation
de la température
Vitesse à laquelle la variation de la température se produit pendant la réaction de PCR.
Deux vitesses de variation de la température sont disponibles : Fast (Rapide) et
Standard.
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Glossaire-13
Glossaire
Glossaire-14
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Index
A
amorce
concentration par défaut 3-29
résumé des instructions de préparation 3-23
RT-PCR 1 étape 3-9
RT-PCR 2 étapes 3-9
structure secondaire 3-9
amplicon, sélection d’un petit 3-22
analyses en point final
présence/absence 5-4
autres réactifs basés sur le principe de la fluorescence 1-6
C
collecte des données 1-2
comparative CT experiments
Voir aussi expérience de quantification 3-6
conception d’une expérience
génotypage 4-14, 4-17
présence/absence 5-15
quantification 3-20
conditions de thermocyclage
quantification de l’ADN/ADNc 3-26
quantification de l’ARN 3-27
RT-PCR 1 étape 3-27
RT-PCR 2 étapes 3-28
consommables, compatibles 1-3
contamination d’ADN, limitation 2-7
contamination par transfert, limitation par l’UNG 2-7
contenu G/C et région d’amplification 3-22
contrôle endogène 3-6
contrôle négatif 3-5, 3-6, 3-7, 4-4, 5-4
contrôle positif 4-4
E
échantillon 3-5, 3-6, 4-4, 5-4
échantillon de référence 3-5, 3-6
essai Custom TaqMan Gene Expression Assay 3-18, 5-12
essai en stock 1-7
essai fabriqué sur commande 1-7
essai préconçu/validé 1-8
essai TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay 4-11
essai TaqMan Endogenous Control Assay 3-17
essai TaqMan Gene Expression Assay 3-16, 5-10
essai TaqMan PDARs for AD 4-12
essai TaqMan SNP Genotyping Assay 4-10
Essais Custom TaqMan SNP Genotyping Assays 4-15
expérience de présence/absence
composants 5-4
conception 5-15
définition 5-4
fonctionnement 5-5
incorporation d’un IPC 5-5
instructions de préparation des essais pour le type
d’essai Custom (Personnalisé) 5-15
réactif TaqMan 2-2
réalisation sans IPC 5-4
sélection des réactifs pour le type d’essai Custom
(Personnalisé) 3-24
sélection du master mix 5-14
type d’essai 5-5
expérience de quantification
comparaison 3-7
comparaison des valeurs de CT 3-6
conception 3-20
conclusions des instructions de préparation des
essais C-1
courbe standard 3-5
description 3-4
instructions de préparation des essais pour le type
d’essai Custom (Personnalisé) 3-20
PCR en temps réel 3-4
quantification relative par les courbes standard 3-5
réactif SYBR Green 2-4, 3-31
réactif TaqMan 2-2
sélection de la méthode de quantification 3-5
sélection des réactifs pour le type d’essai Custom
(Personnalisé) 3-24
sélection du master mix 3-19
sélection du type de réactif 3-12
type d’essai 3-12
expérience de quantification absolue par les courbes
standard
à propos de 3-5
composants 3-5
Voir aussi expérience de quantification 3-5
expérience de quantification relative par la méthode de
comparaison des valeurs de CT
à propos de 3-6
composants 3-6
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Index-1
Index
expérience de quantification relative par les courbes
standard
à propos de 3-5
composants 3-5
Voir aussi expérience de quantification 3-5
expérience en point final
génotypage 4-4
G
gamme de dilutions standard 3-5
I
instructions de préparation des essais
à propos de C-1
amorce et sonde 3-21, 3-23
conditions de thermocyclage 3-26
expérience de présence/absence 5-15
expérience de quantification 3-20, C-1
optimiser la concentration de sonde 3-33
optimiser les concentrations d’amorces 3-29
réaction de génotypage C-2
sélection des réactifs 3-24
IPC 5-4, 5-5
L
liaison de fluorophore, méthodes de 2-4
limitation de l’amorce, essai multiplex 3-11
logiciel Primer Express
essai SNP 1-9
expérience de présence/absence 5-15
expérience de quantification 3-20
petit amplicon 3-22
M
master mix
sélection pour une expérience de
présence/absence 5-14
sélection pour une expérience de quantification 3-19
sélection pour une réaction de génotypage 4-13, 4-17
matrice d’optimisation des amorces
utilisation 3-29
matrice de limitation des amorces
définition des limites B-1
exemple de limitation B-2
N
non-spécificité, dans une réaction de génotypage 4-5
O
optimisation 3-33
Index-2
P
PCR en temps réel
expérience de quantification 3-4
processus de détection TaqMan 2-2
PCR multiplex
amorce d’ARNr B-1
comparaison simplex 3-11
description 3-10
limitation de l’amorce 3-11
PCR, pratiques générales 2-8
petit amplicon, sélection 3-22
produit non spécifique, contamination avec le fluorophore
SYBR Green 2-7
Q
quantification de l’ADN/ADNc, conditions de
thermocyclage 3-26
quantification de l’ARN
conditions de thermocyclage 3-27, 3-28
RT-PCR 1 étape 3-25
RT-PCR 2 étapes 3-25
R
réactif
autres réactifs basés sur le principe de la
fluorescence 1-6
éléments à prendre en compte 2-6
réactif SYBR Green 1-6
réactif TaqMan 1-6, 2-2
sélection 1-6, 2-5
sélection du type d’essai Custom (Personnalisé) 3-24
réactif SYBR Green
développement 2-4
éléments à prendre en compte pour la sélection 2-6
fonctionnement 2-5
optimisation d’une expérience de quantification 3-31
réactif TaqMan
application 2-2
développement 2-2
éléments à prendre en compte pour la sélection 2-6
fonctionnement 2-2
réactif TaqMan Exogenous Internal Positive Control
Reagent 5-13
réactif Universal Master Mix
polymérase, avantages 3-26
réaction de génotypage
composants 4-4
conception 4-14, 4-17
conclusions des instructions de préparation des
essais C-2
description 4-4
fonctionnement 4-4
instrument 4-4
non-spécificité 4-5
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Index
réactif TaqMan 2-2
sélection du master mix 4-13, 4-17
type d’essai 4-6
région d’amplification
contenu G/C 3-22
extrémité 3’ de l’amorce 3-22
extrémité 5’ de la sonde 3-22
recherche 3-21
sélection 3-21
température de fusion 3-22
réplicats 3-5, 3-6, 4-4, 5-4
RT-PCR
1 étape 3-8
2 étapes 3-8
comparaison des méthodes 3-7, 3-10
RT-PCR 1 étape
à propos de 3-8
amorces utilisées 3-9
quantification de l’ARN 3-25
RT-PCR 2 étapes
à propos de 3-8
amorces utilisées 3-9
quantification de l’ARN 3-25
U
UNG, limitation de la contamination par transfert 2-7
W
workflow Advanced Setup (Configuration avancée) 1-6,
1-7, 1-8
workflow de l’assistant de programmation Design
Wizard 1-6, 1-7, 1-8
S
sonde
optimisation de la concentration de sonde 3-33
résumé des instructions de préparation 3-23
sonde TaqMan MGB disponible 2-4
sonde TaqMan MGB 2-3
standard 3-5
structure secondaire et choix de l’amorce 3-9
système StepOne
application 1-5
collecte des données 1-2
consommables 1-3
type d’essai 1-7
type de réactif 1-6
T
température de fusion et région d’amplification 3-22
transcriptase inverse MultiScribe, définition 3-26
type d’essai
essai en stock/fabriqué sur commande 1-7
essai personnalisé 1-8, 1-9
essai préconçu/validé 1-8
expérience de présence/absence 5-5
expérience de quantification 3-12
réaction de génotypage 4-6
sélection 1-7
type d’essai Custom (Personnalisé) 1-8, 1-9
expérience de présence/absence 5-15
expérience de quantification 3-20
Guide des réactifs du système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOne™
Index-3
Index
Index-4
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