Thermo Fisher Scientific VetMAX C. burnetii Feces Kit Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ C. burnetii Feces Kit
PCR temps réel TaqMan™ pour la détection de Coxiella burnetii
Référence Catalogue FQPE
Partie Nº 100020368 Pub. Nº MAN0008767 Rév. C.0
Technique
PCR temps réel (ADN)
– Duplex
– IPC exogène
Espèce(s)
Acides nucléiques isolés à partir des matrices
Test
Bovins
Petits ruminants
(ovins, caprins)
Fèces
Chiffonnettes
Individuel
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes
de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques
du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Informations sur le produit
Description du produit
Applied Biosystems™ VetMAX™ C. burnetii Feces Kit est un outil de diagnostic moléculaire permettant la détection par PCR temps
réel de la bactérie Coxiella burnetii.
Chaque échantillon d’ADN obtenu après extraction est analysé en monocupule : la même cupule est utilisée pour la détection
spécifique de l’ADN bactérien de Coxiella burnetii et pour la détection d’un IPC (Internal Positive Control). La positivité de l’IPC traduit
à la fois l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.
Il est utilisable sur ADNs bactériens extraits à partir de chiffonnettes et de fèces.
Les protocoles complets d’extractions des ADN bacteriens à partir de ces matrices sont disponibles sur demande au Support Technique.
Réactifs du kit et conservation
Le VetMAX™ C. burnetii Feces Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant les différents réactifs pour la détection en duplex
de Coxiella burnetii et d’un contrôle interne IPC. À réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre −30°C et −10°C. Après la
première utilisation d’un composant, le conserver selon les recommandations suivantes :
Article
Description
Pool de séquences (primers et sondes). Il contient :
• Le système de détection pour la cible Coxiella burnetii, comprenant
1 - Sequences Cox b. FE
une sonde TaqMan™ marquée FAM™ - TAMRA™.
(Tube vert)
• Le système de détection pour l’IPC, comprenant une sonde
TaqMan™ marquée VIC™ - TAMRA™.
2 - Master Mix Cox b. FE Mix pour PCR temps réel TaqMan™. Il contient le tampon et l’enzyme
(Tube blanc)
de PCR temps réel.
4d - EPC Cox b. FE
External positive control : Contrôle positif en Coxiella burnetii à
(Tube bleu)
extraire.
Internal positive control : Contrôle interne exogène, à ajouter dans
5 - IPC Cox b. FE
chaque échantillon et chaque témoin lors de l’étape de lyse de
(Tube jaune)
l’extraction.
Conservation
Volume
(100 réactions)
A réception
Après première
utilisation
2 × 100 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
2 × 625 µL
−30°C à −10°C
2°C à 8°C
400 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
2 × 500 µL
−30°C à −10°C
−30°C à −10°C
NOTE : Pour de petites séries d’extraction, il est conseillé d’aliquoter l’IPC Cox b. FE à la première utilisation, afin d’éviter plus de 3
cycles de congélation-décongélation (Sous un volume minimum de 50 µL).
Témoins d’extraction et d’amplification
Le VetMAX™ C. burnetii Feces Kit contient 2 témoins permettant la validation de l’extraction et de l’amplification des ADN bactériens :
4d - EPC Cox b. FE : contrôle positif en Coxiella burnetii
Contrôle positif à extraire en parallèle des échantillons lors de la première analyse.
Un résultat positif compris dans l’intervalle accepté de Ct permet de valider l’extraction et l’amplification de la cible Coxiella burnetii par
PCR temps réel.
Méthode d’extraction
Colonnes de silice ou billes magnétiques
Volume d’EPC à extraire
200 µL
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Volume d’élution
200 µL
5 - IPC Cox b. FE : contrôle interne d’extraction
Contrôle positif à ajouter dans chaque échantillon lors de l’étape de lyse de l’extraction des acides nucléiques.
Un résultat IPC positif avec une valeur comprise dans l'intervalle accepté de Ct dans un échantillon permet de valider l’extraction de
cet échantillon qu’il soit positif ou négatif pour le pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des
inhibiteurs.
Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :
NCS : contrôle négatif d’extraction
C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (le volume d’échantillon peut être remplacé
par le tampon utilisé lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les
échantillons : extraction des acides nucléiques (avec ajout d’IPC) puis PCR temps réel.
Un résultat négatif en Coxiella burnetii permet de valider le bon déroulement de la lyse et l’absence de contamination au cours de
l’extraction et de la PCR temps réel.
NC : contrôle négatif d’amplification
Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau
DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL.
Un résultat négatif pour Coxiella burnetii et IPC permet de valider l’absence de contamination au cours de la préparation des réactions
pour la PCR temps réel.
Matériel et réactifs requis pour la PCR temps réel non fournis dans le kit
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre
• Eau DNase/RNase-free
• Tampon TE 1X
• Tampon PBS 1X
• Un thermocycleur de PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :
– FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)
– VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm)
• Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé : Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits),
microtubes ou capillaires; films ou bouchons adaptés à la fermeture
Procédure d’analyse
Le volume réactionnel de la PCR temps réel est de 25 µL :
• Mix Cox b. FE : 20 µL par analyse. A reconstituer extemporanément avant la PCR temps réel.
• ADN extrait : 5 µL par analyse
Extraction des ADN bactériens
Il est nécessaire d’isoler les ADN à partir des échantillons pour l’analyse par PCR temps réel.
Ajouter 5 µL de 5 - IPC Cox b. FE par échantillon et contrôle à extraire et au NCS lors de l’étape de lyse de l’extraction des acides
nucléiques.
Avant d’utiliser ce kit pour la première fois, extraire 4d - EPC Cox b. FE selon la même méthode utilisée pour les échantillons. L’EPC
extrait peut être utilisé dans les PCR suivantes avec des échantillons qui ont été extraits selon la même méthode.
NOTE : Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ C. burnetii Feces Kit, merci de contacter le
Support Technique.
Reconstitution du mix réactionnel
Reconstituer le Mix Cox b. FE juste avant emploi, dans une pièce dédiée à la préparation des mix :
1. A la première utilisation, décongeler le tube de 2 - Master Mix Cox b. FE entre 2°C et 8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.
Le conserver et maintenir entre 2°C et 8°C à chaque utilisation suivante.
2. Décongeler le tube de 1 - Sequences Cox b. FE à température ambiante. Le replacer entre −30°C et −10°C après utilisation.
3. Reconstituer entre 2°C et 8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant, le mix réactionnel Mix Cox b. FE selon les tables de calcul
suivantes :
Composant
Pour N réactions(1)
1 - Sequences Cox b. FE
2 µL
N × 2 µL
2 - Master Mix Cox b. FE
12.5 µL
N × 12.5 µL
Eau RNase/DNase-free
5.5 µL
N × 5.5 µL
Volume total
20 µL
N × 20 µL
(1)
4.
Pour 1 réaction
Il est recommandé de prévoir une réaction supplémentaire par rapport au total de réactions qui seront réalisées lors des analyses (échantillons +
contrôles). Ne jamais mélanger les réactifs issus de lots de kits différents (se référer au Certificat d’Analyse).
Après reconstitution, procéder immédiatement à la PCR temps réel. Maintenir le tube de Mix Cox b. FE entre 2°C et 8°C, sur glace
ou sur un portoir réfrigérant jusqu’à utilisation.
Préparation de la PCR temps réel
1.
2.
2
Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible le contrôle positif (EPC) des autres échantillons.
Homogénéiser le tube Mix Cox. b FE par agitation douce, puis centrifuger brièvement.
VetMAX™ C. burnetii Feces Kit Notice d’Utilisation
3.
4.
Distribuer 20 µL de Mix Cox b. FE par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.
Ajouter les ADN des échantillons et contrôles au mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :
Type d’analyse
Echantillon pour analyse
Composant
Volume d’échantillon
ADN extraits de l’échantillon
5 µL
4d – EPC Cox b. FE
5 µL
NCS extrait
5 µL
Eau DNase/RNase-free
5 µL
Contrôle positif d’amplification
Contrôle négatif d’extraction (NCS)
Contrôle négatif d’amplification (NC)
5.
Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.
Amplification par PCR en temps réel
1. Créer les détecteurs suivants sur le thermocycleur :
COXB
Reporter
Quencher
FAM™
TAMRA™(1)
VIC™
TAMRA™(1)
IPC COXB
Référence passive :
(1)
2.
3.
Les fluorophores TAMRA™ et ROX™ sont à renseigner obligatoirement pour l’analyse par PCR temps réel si le thermocycleur est capable de les détecter.
Pour les autres thermocycleurs, l’absence de détection de ces fluorophores ne remet pas en cause l’analyse par PCR temps réel.
Attribuer pour chaque échantillon le détecteur COXB et le détecteur IPC COXB dans le puits utilisé pour l’analyse.
Créer le programme de PCR temps réel suivant pour l’analyse :
Répétitions de l’étape
Température
Etape 1
×1
50°C
2 minutes
Etape 2
×1
95°C
10 minutes
Etape 3
×40
95°C
15 secondes
60°C(1)
1 minute
(1)
4.
ROX™(1)
Durée
Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 1 minute.
Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la PCR temps réel.
Analyse des résultats
Analyse des données brutes
Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.
1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la PCR temps réel.
2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons pour chaque détecteur selon les
recommandations ci-après.
Validation du test
La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants :
Détecteur COXB
Détecteur IPC COXB
Validation
Ct = Ct QC Cox b. FE de 4d- EPC Cox b. FE ± 3Ct(1)
Ct < 40
PCR validée
NCS
Ct > 40
Ct < 40
Extraction validée
NC
Ct > 40
Ct > 40
Réactifs PCR validés
EPC Cox b. FE
(1)
Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.1 « EPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.
Interprétation des résultats
Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous :
Détecteur COXB
(1)
(2)
Détecteur IPC COXB
3Ct(1)
Interprétation
Ct < 40
Ct ≤ Ct IPC du NCS +
Ct > 40
Ct ≤ Ct IPC du NCS + 3Ct(1)
Coxiella burnetii non détecté
Coxiella burnetii détecté
Ct > 40
Ct > Ct IPC du NCS + 3Ct(1)
Non validé(2)
Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.2 « IPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.
L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la valeur non conforme de l’IPC.
Conduite à tenir pour les échantillons non validés
1. Diluer l’ADN de l’échantillon non validé au 1:10 en tampon TE 1X.
2. Faire une nouvelle analyse PCR sur 5 µL de cette dilution.
3. Si l’ADN dilué est positif en Coxiella burnetii ou négatif en Coxiella burnetii avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est alors validé.
4. Si l’ADN dilué est négatif en Coxiella burnetii avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non validé. Dans ce
cas, renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:10 dans du tampon PBS 1X avant extraction.
5. Si le résultat est toujours non validé, répéter l’analyse sur un nouveau prélèvement.
VetMAX™ C. burnetii Feces Kit Notice d’Utilisation
3
Documentation et support
Service clientèle et assistance technique
Support technique : rendez-vous sur
thermofisher.com/askaquestion
Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux
dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance
technique, notamment :
• Numéros de téléphone partout dans le monde
• Commande et Support web
• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également
appelées FS (Fiches Signalétiques))
Garantie produit limitée
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs
produits selon les termes et conditions générales de ventes
disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/
global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous
pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web
suivante : thermofisher.com/support.
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux
produits chimiques d'autres fabricants, contacter
chaque fabricant.
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois Dieu | 69380 Lissieu, France
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008767 (français)
Rév.
Date
C.0
31 juillet 2020
B.0
8 mai 2017
A.0
25 novembre 2013
Description
• Suppression des instructions pour l'application quantitative.
• Mise à jour des critères de validation de la cible IPC.
Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux
logos.
Base de référence pour l’historique de révision
Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les
conditions générales de toutes les licences à usage limité.
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TaqMan est une marque déposée de Roche, utilisée sous autorisation et licence.
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31 juillet 2020
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