Thermo Fisher Scientific PrioWESTERN BSE Kit Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
PrioWESTERN BSE Kit
Test pour la détection in vitro de PrPSc liée aux EST
Référence Catalogue PR12000
Pub. Nº MAN0013787 Rév. A.0
Au sein de l'Union Européenne, ce test est approuvé comme test rapide pour le programme de test de l'ESB chez les bovins mis en place conformément au Règlement (CE) No 999/2001.
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des
gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit
disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Les producteurs de tests rapides d’EST doivent avoir mis en place un système d’assurance qualité, reconnu par le Laboratoire de Référence de l’Union
Européenne (LRUE), qui garantisse que les performances du test ne varient pas. Des modifications concernant les outils d’échantillonnage ainsi que du
test rapide lui-même ou du protocole du test (y compris l’échantillonnage) peuvent seulement être apportées après notification préalable au Laboratoire
de Référence de l’Union Européenne (LRUE) et ne seront accordées qu’à condition que l’LRUE ait constaté que les modifications ne réduisent pas la
sensibilité, la spécificité ou la fiabilité du test rapide. Après accord de l’LRUE, les détails de la modification doivent être communiqués à la Commission
et aux Laboratoires Nationaux de Référence de l’Union Européenne.
Introduction
Divers tissus d'un animal infecté par les prions contiennent une variante pathologique, spécifique de la maladie, de la protéine prion normale (PrP). La
protéine prion modifiée est appelée PrPSc. L'isoforme normale de la PrP est appelée PrPC (forme cellulaire de la PrP).
La PrPSc se distingue de la PrPC normale par sa résistance aux protéases. Lors d'un traitement à la protéinase K, la PrPC est dégradée, tandis que la PrP Sc voit
sa taille diminuer de 32–35 kD à 27–30 kD. Le fragment PrPSc résistant aux protéases est appelé PrP27–30.
Applied Biosystems™ PrioWESTERN BSE Kit doit sa précision et sa fiabilité élevées au fait qu'il vérifie trois paramètres importants : résistance aux protéases,
patron de glycosylation et poids moléculaire plus bas du fragment PrPSc résistant aux protéases (27–30 kD) par rapport à la PrP normale non digérée.
Les propriétés uniques des solutions tampons utilisées dans le PrioWESTERN BSE Kit et la haute affinité de l'anticorps permettent d'effectuer le test directement
sur des homogénats de tissu et d'associer la fiabilité du Western blot à la rapidité requise pour un dépistage sur un grand nombre d'échantillons.
PrioWESTERN BSE Kit fut le premier kit de détection de l'ESB approuvé par les autorités suisses en 1998. En 1999, il fut officiellement validé par l'UE
comme le seul test à démontrer 100% de sensibilité et 100% de spécificité sans répétition.
Dans l'étude réalisée par le CRL (Laboratoire Central de Référence) en 2009 et portant sur la sensibilité analytique, il a été conclu que PrioWESTERN BSE
Kit avait une performance 100 fois supérieure au système de test le plus sensible.
Les données de validation de ce kit ont été certifiés par l'OIE, basée sur la révision d'experts, pour les objectifs suivants :
Prêt pour le diagnostic post-mortem de l'encéphalopathie spongiforme chez les bovins et pour les objectifs suivants :
1. Pour confirmer le diagnostic des cas suspects ou cliniques (inclut la confirmation d'un test de dépistage positif) ;
2. Pour estimer la prévalence de l'infection pour faciliter l'analyse des risques (les régimes de santé des enquêtes ou des troupeaux ou le contrôle des maladies,
des enquêtes, par exemple, mise en œuvre des mesures de lutte contre les maladies) et d'aider à la démonstration de l'efficacité des politiques de contrôle ;
3. Pour confirmer un résultat de test non négatif obtenu lors de la surveillance active avec un type de test différent.
Principe du test
Après le prélèvement et l'enregistrement des échantillons, ceux-ci sont analysés avec le PrioWESTERN BSE Kit. PrioWESTERN BSE Kit suit un protocole en
cinq étapes, consistant en une homogénéisation, une digestion par une protéase, une électrophorèse en gel, un transfert et une détection. Immunologique.
Une personne peut analyser 100 échantillons (en double) en 6–8 heures.
Les échantillons sont prélevés, enregistrés et un homogénat est préparé à partir d'un morceau de tissu cérébral bien défini. Un traitement à la protéinase K
dégrade complètement la PrPC tandis que la PrP Sc est réduite à un fragment de 27–30 kD. La réaction protéolytique est arrêtée et la PrPSc est détectée par le
test PrioWESTERN BSE Kit.
Les homogénats digérés sont soumis à une électrophorèse en gel et à un Western blot. Les membranes sont incubées avec un anticorps monoclonal-possédant une
haute affinité pour PrP-pour la détection de PrPSc résistant aux protéases. Le signal est visualisé au moyen du conjugué second anticorps-phosphatase alcaline (AP).
Contenu du kit (Suite à la page suivante)
Kit pour 100 échantillons (analyses en double). Tous les composants non ouverts ont une durée de conservation
de 1 an après leur production s'ils sont conservés à 5±3°C. Voir l'étiquette du kit pour la date effective de
péremption. Les stabilités des composants dilués, ouverts ou reconstitués sont indiquées ci-dessous.
Composant
Description
1 : Concentré de tampon d'homogénéisation (5x)
Concentration 5x, diluer avant utilisation. Une bouteille contenant 200 mL
d'un tampon d'homogénéisation concentré 5x. Préparer la solution
d'homogénéisation d'utilisation diluée 1x en mélangeant 1 volume de
tampon d'homogénéisation (5x) et 4 volumes d'eau ultrapure. Durée de
conservation de la solution d'homogénéisation d'utilisation :
1 semaine à 5±3°C.
2 : Tampon de digestion (1x)
(Couleur du bouchon : jaune)
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 4 mL de tampon de digestion.
3 : Protéinase K
(Couleur du bouchon : blanc)
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 4 mL de protéinase K.
4 : Solution d'arrêt de la digestion (1x)
(Couleur du bouchon : rouge)
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 4 mL d'inhibiteur de protéinase K
pour l'arrêt de son activité protéolytique.
5 : Echantillon de contrôle
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 200 µL d'un contrôle fonctionnel
(PrPC normale) et de marqueurs de poids moléculaire
(97/66/45/30/20/14 kD) inclus dans du tampon de charge. Mélanger
avant l'emploi, par exemple en donnant un petit coup sur le tube.
6 : Tampon de charge (1x)
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 25 mL de tampon de charge pour
électrophorèse en gel SDS de polyacrylamide (PAGE). (Contient du
2-mercaptoéthanol. Les flacons ouverts dégagent une mauvaise odeur.
Toutefois, même si 100 flacons sont ouverts simultanément dans une
pièce normalement aérée, les concentrations dans l'air n'atteignent pas
le taux d'exposition à l'environnement sur la place de travail de
0.65 mg/m3 défini par l'American Industrial Hygiene Association.)
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Composant
Description
7 : Concentré de
tampon de blocage
PVDF (5x)
5x concentré, à diluer avant l'emploi. Un flacon contient
100 mL de tampon de blocage concentré qui bloque les sites
non spécifiques. Diluer 100 mL de tampon de blocage avec
de l'eau ultrapure dans un volume final de 0.5 litre.
8 : 1er anticorps 6H4
Un tube contenant 30 µL d'anticorps monoclonal anti-PrP
(IgG1 anti-PrP de souris). A diluer à 1:5000 (au cas où du
liquide reste collé aux parois ou au bouchon, le tube peut
être centrifugé).
9 : 2ème anticorps-AP
Un tube contenant 30 µL d'IgG-AP de chèvre anti-souris,
un anticorps dirigé contre l'IgG de souris et conjugué à la
phosphatase alcaline. A diluer à 1:5000 (au cas où du
liquide reste collé aux parois ou au bouchon, le tube peut
être centrifugé).
10 : Concentré de
tampon de
luminescence
10x concentré, à diluer avant l'emploi. Un flacon contient
27 mL de tampon concentré de luminescence. Diluer ce
tampon avec de l'eau ultrapure dans un volume final de
270 mL avant l'emploi.
Contenu
supplémentaire du kit
• Notice
• Etiquettes pour solutions diluées
Equipements additionnels nécessaires
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur
thermofisher.com. Les équipements en gras ont été homologués pour une
utilisation avec le PrioWESTERN BSE Kit. L'utilisateur assume sa
responsabilité s'il emploie d'autres équipements.
Use
Généralités
Homogénéisation
Description
Equipement de laboratoire correspondant aux directives
nationales de sécurité.
• Eau ultrapure : au moins équivalente aux eaux de grade 3
comme défini par ISO 3696 :1987 (E)
• Pipette monocanal (1–10 µL)
• Pipette monocanal (10–100 µL)
• Pipette monocanal (100–1000 µL)
• Pipette monocanal (1–5 mL)
• Pipette multicanaux (0.5–10 µL)
• Pipette multicanaux (10–100 µL)
• Embouts de pipette (tels que recommandés par le fabricant des
pipettes)
• Réservoirs à solution
• Plateaux pour incubation
• Tubes coniques de 15 mL
• Tubes coniques de 50 mL
•
•
•
•
•
Outil de découpe et pincettes
Balance
Distributeur pour le tampon d'homogénéisation 1x
Plaque à 96 puits de 1.2 mL (plaque matrice)
PrioGENIZER™, appareil d’homogénéisation avec six racks et
un plateau (Réf. PR10000) et flacons d’homogénéisation
PrioCLIP™ (Réf. PR10010)
ou
Homogénéisateur FASTH/MediFASTH ou FASTH2 et flacon
d’homogénéisation Prypcon (Syntec International)
ou
Omni Tissue Homogenizer (TH115, TH220) et Soft Tissue
Omni Tip™ Plastic Homogenizing Probes (32750) (Omni
International)
Digestion par la
protéase
• Plaques à 96 puits (puits de 0.2 mL ; utilisées comme plaques de
digestion)
• Film adhésif
• Incubateur pour plaques de microtitrage (montant jusqu'à 100°C
au moins)
Electrophorèse
en gel
• NuPAGE™ 12% Bis-Tris Protein Gels (17 puits)
(Réf. NP0349BOX)
• Solution tampon de migration pour NuPAGE™ MOPS/SDS
(Réf. NP0001 ou NP000102)
• Antioxydant pour NuPAGE™ (Réf. NP0005)
Transfert
Détection
immunologique
2
• Membrane PVDF, Immobilon-P 0.45 µm (EMD Millipore)
• Méthanol (approx. 98%)
• Tampon de transfert (10x) : 30.28 g Tris base/
144.13 g glycine/compléter à 1000 mL avec de l'eau ultrapure
• Solution saline tampon Tris (TBS, pH 7.4) :
8 g NaCl/0.2 g KCl/3 g Tris base. Compléter à 1000 mL avec
de l'eau ultrapure, ajuster le pH à 7.4 avec HCl
• Solution saline tampon Tris avec Tween (TBST) :
TBS avec 0.05% (v/v) Tween-20
• Ponceau S (20x) : 0.5% (w/v) Ponceau S/5% (v/v) acide acétique
Diluer à 1x avec TBST avant l'emploi
• Concentré CDP-Star (= substrat de la phosphatase alcaline)
(12.5 mM ; Réf. T2310) ou Roche Diagnostics GmbH (25 mM) ou
CDP-Star, prêt à l'emploi (0.25 mM; Réf. T2146)
• Hyperfilm ECL
Déroulement du test
Mesures de précaution
• Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon stricte.
• Le PrioWESTERN BSE Kit doit être utilisé dans les laboratoires agréés.
• De plus, le PrioWESTERN BSE Kit ne peut être exécuté que par des
personnes ayant une formation générale sur le travail avec les prions et
ayant suivi en particulier une formation à l’utilisation du
PrioWESTERN BSE Kit.
• Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement
infectieux et tous les objets en contact avec les échantillons doivent être
considérés comme potentiellement contaminés.
Commentaires
Pour obtenir des résultats optimaux avec le PrioWESTERN BSE Kit, il est
recommandé de respecter les aspects suivants :
• Respecter rigoureusement le mode opératoire.
• Les embouts de pipettes doivent être remplacés pour chaque opération
de pipetage.
• Il est fortement recommandé d'utiliser des embouts-filtres pour les
pipettes ou des pipettes distinctes pour les différentes étapes. En outre,
la précision du volume de pipetage doit être contrôlée périodiquement.
Les directives nationales s'appliquent.
• Utiliser un réservoir distinct pour chaque réactif.
• Les composants du kit ne doivent pas être utilisés au-delà de leur date
de péremption ou si leur aspect a changé.
• Il ne faut pas utiliser en combinaison des composants de kits provenant
de lots ayant des numéros différents.
• Les instruments servant à couper et les pinces qui seront réutilisés doivent
être décontaminés selon les protocoles définies par les autorités nationales.
• Lorsque le PrioGENIZER™ est utilisé pour l'homogénéisation, n'utiliser
que le programme P0 PRIONICS TSE.
Prélèvement d'échantillons et homogénéisation
• Couper 0.45–0.70 g de tissu nerveux de la zone de préférence, du côté
gauche ou du côté droit du tronc cérébral, par exemple avec un scalpel.
Le prélèvement d'échantillons et les tests en laboratoire doivent respecter la
Réglementation (CE) No 999/2001, chaptire C, qui renvoie, pour ce qui est de
la récolte des échantillons, à la dernière édition de “Manual Standards for
Diagnostic Test and Vaccines of the International Office of Epizootic Diseases
(OIE)” stipulant que : “Le prélèvement de choix pour un test immunologique
devrait se situer sur l'obex ou aussi près que possible de celui-ci mais ne
devrait pas se trouver à plus de 1.5 cm devant l'obex”. La figure ci-dessous
montre, encadrée en 4, la zone de prélèvement d'échantillons.
Remarque : Après le prélèvement des échantillons, une semi-section
complète du tronc cérébral avec une région de l'obex intacte doit rester
disponible pour d'éventuels tests confirmatifs.
(1)
(2)
(3)
(4)
Moelle épinière
Cerveau
Région de l'obex
Zone à utiliser pour le
PrioWESTERN BSE Kit
(5) Zone à utiliser par le
Centre de Référence de
l'ESB
Medulla oblongata
L'échantillon est un morceau de tronc cérébral/moelle épinière
cervicale d'une longueur approximative de 8 cm.
Homogénéisation
Préparation
• Pour obtenir la solution d’utilisation du tampon d'homogénéisation,
diluer le tampon d'homogénéisation concentré 5x (composant 1) avec
de l’eau ultrapure (Annexe A).
Homogénéisation
• Transférer l’échantillon dans un récipient d'homogénéisation et peser
sur la balance (0.45–0.70 g).
• Ajouter dix fois le volume du tampon d'homogénéisation dilué 1x
(m/v ; par exemple 5 mL pour 0.50 g de tissu cérébral) et homogénéiser
l’échantillon en utilisant l'appareil d'homogénéisation PrioGENIZER™
(programme P0 Prionics TSE), ou FASTH/MediFASTH/FASTH2
(45±5 s, 20,000±1,000 rpm) ou l'appareil d'homogénéisation Omni
Tissue Homogenizer (60±10 sec à vitesse maximale).
PrioWESTERN BSE Kit Notice d’Utilisation
• Conserver deux échantillons de 1 mL par homogénat dans une plaque
matrice de 96 puits (à partir d'ici, chaque étape se fera avec deux
échantillons pour chaque homogénat original).
• Les flacons d’homogénéisation PrioCLIP™ et Prypcon des échantillons
testés "TSE négatifs" peuvent être lavés pour être réutilisés (voir
protocole de lavage des flacons PrioCLIP™ et Prypcon, Annexe D).
Digestion par une protéase
Les quantités suivantes sont données pour 48 échantillons.
(Voir Annexe B pour les volumes requis pour un nombre d'échantillons
différent de 48.)
Préparation
• Ajuster la température de l’incubateur de la plaque de microtitrage à
48±1°C approximativement 1 heure avant utilisation.
• Ajouter 10 µL de tampon de digestion (composant 2) dans chaque puits
de la plaque de digestion.
Digestion par une protéase
• Transférer 100 µL (mélanger d'abord en aspirant et en évacuant au
moins trois fois avec la pipette) de chaque homogénat de la plaque
matrice dans le puits correspondant de la plaque de digestion, avec une
pipette multicanal. La plaque matrice peut ensuite être recouverte et
conservée jusqu'à 12 mois de −20°C à −80°C.
• Ajouter 10 µL de protéinase K (composant 3) à chaque puits de la
plaque de digestion et mélanger en aspirant/évacuant à la pipette au
moins trois fois.
• Placer un film de scellement sur la plaque de digestion.
• Digérer pendant 40±1 min à 48±1°C.
• Interrompre la réaction en ajoutant 10 µL de la solution d’arrêt de la
digestion (composant 4). Mélanger par pipetage au moins trois fois.
Electrophorèse en gel
Préparation
• Préparation des gels NuPAGE™ 12% à 17 puits : enlever délicatement le
peigne et la bande adhésive blanche au bas du gel.
• Chauffer l'échantillon de contrôle (composant 5) à 65±3°C pendant 2–5 min.
• Régler la température de l'incubateur pour plaque de microtitrage à
98±4°C, environ 1 heure avant l'utilisation.
Electrophorèse en gel
• Ajouter 100 µL de tampon de charge (composant 6) à l'homogénat
digéré dans la plaque de digestion et mélanger en pipetant au moins
trois fois.
• Faire bouillir les échantillons à 98±4°C pendant 5 min±30 s.
• La plaque de digestion peut être recouverte avec un film de scellement
et conservée jusqu'à 5 jours de −20°C à −80°C.
• Les échantillons préparés précédemment sont chauffés à to 65±3°C
pendant 2–5 min avant d'être déposés.
Dépôt des échantillons
• Déposer 10 µL de l'échantillon de contrôle dans le premier puits.
• Déposer 10 µL des échantillons chauffés par puits.
• Remplir la cuve intérieure et extérieure avec la solution tampon pour
électrophorèse 1x NuPAGE™ SDS-MOPS et ajouter 500 µL
d'antioxydant NuPAGE™ uniquement dans la cuve intérieure.
Electrophorèse
• Faire migrer sous une tension de 200 V jusqu'à ce que le front de
migration se trouve à 1–2 cm du bas du gel (environ 30 min).
Transfert
Préparation
• Laver la membrane PVDF (Millipore, Immobilon-P, 0.45 µm,
13 × 17 cm) dans du méthanol (environ 98%) pendant quelques
secondes. L'équilibrer pendant au moins 10 min dans le tampon de
transfert 1x (pour les volumes requis, voir Annexe B).
• Remplir la cuve de transfert avec le tampon de transfert 1x refroidi (5±3°C).
• Transférer à 150 V pendant 60±2 min à 5±3°C sous refroidissement
continu.
• Retirer la membrane et colorer les protéines présentes sur la membrane
au Rouge Ponceau S. Repérer la position des marqueurs moléculaires.
La décoloration se fait avec du TBST jusqu’à ce que la coloration rouge
ait disparu (environ 2 × 1 min).
Détection immunologique
Blocage
• Incuber la membrane dans un bac d’incubation en plastique avec
50±2 mL de tampon de blocage PVDF 1x (composant 7 ; voir Annexe A
pour le schéma de dilution) pendant 35±5 min à 22±3°C sur un
agitateur basculant avec agitation douce.
1er anticorps
• Diluer 10 µL du premier anticorps 6H4 (composant 8) dans 50±2 mL de
TBST (dilution 1:5000), y incuber la membrane pendant 60±5 min à
22±3°C (ou pendant 12–18 heures à 5±3°C) sous agitation douce sur un
agitateur basculant.
• Rincer 3x les membranes pendant environ 5 min avec du TBST.
2ème anticorps
• Diluer 10 µL du deuxième anticorps-AP (composant 9) dans 50±2 mL
de TBST (dilution 1:5000). Incuber pendant 30±1 min à 22±3°C sous
agitation douce.
• Rincer 5x les membranes pendant environ 5 min avec du TBST.
Détection
• Equilibrer la membrane pendant 5–10 min dans 50±2 mL de solution
tampon de luminescence 1x (composant 10 ; voir Annexe A pour le
tableau de dilution).
• Diluer 100 µL de CDP-Star (12.5 mM ; 50x) ou 50 µL (25 mM ; 100x)
dans 5 mL de tampon de luminescence 1x.
• Placer la membrane sur une plaque de verre. Répartir uniformément
5 mL de la solution CDP-Star diluée ou 5 mL de la solution prête à
l’emploi sur la membrane et incuber pendant 5±1 min à 22±3°C.
• Enlever l’excès de liquide restant sur la membrane avec un papier
absorbant doux et recouvrir immédiatement la membrane avec du
cellophane. Exposer la membrane à un film Hyperfilm ECL jusqu’à ce
que le signal du contrôle positif soit intense et que le bruit de fond ou la
bande de la protéinase K apparaisse (environ 5 à 20 min). Exposer plus
longtemps ou moins longtemps pour obtenir un signal optimal.
Alternativement, un système de détection par caméra CCD peut être
utilisé (par ex. FluorChem™, Alpha Innotech Corp.).
Interprétation des résultats
La figure ci-dessous montre les résultats attendus pour des échantillons
négatifs pour l’EBS, positifs pour l’EBS, positifs pour la tremblante et des
échantillons témoins. L’échantillon témoin (K) contient l’isoforme normale
de la protéine prion (PrPC), visualisée via la détection immunologique. La
bande diffuse correspondante de 25–35 kD est due à la glycosylation de
PrPC, qui provoque une distribution hétérogène.
K
Transfert
Réalisation du sandwich de transfert
• Placer la membrane sur du papier Whatman imbibé de tampon de
transfert 1x ou d'eau ultrapure.
• Casser le carde en plastique du gel NuPAGE™. Enlever le haut du gel
contenant les puits et le bas au-dessous du front coloré. Placer le reste
du gel sur la membrane (éviter les bulles d'air). On peut placer jusqu'à
6 gels sur une même membrane de la taille ci-dessus (voir Annexe C).
• Recouvrir les gels avec du papier Whatman imbibé, puis avec la
deuxième éponge.
• Fermer la cassette de transfert et la placer dans la cuve de transfert. Les
protéines ont une charge négative et migrent vers le pôle positif (rouge)
de la cuve de transfert. S'assurer que la cassette est insérée avec la
membrane PVDF faisant face au pôle positif et les gels faisant face au
pôle négatif.
PrioWESTERN BSE Kit Notice d’Utilisation
N
N
ESB
fort
ESB
faible
D
31
kDa
A
B
C
Les échantillons négatifs (N) ne donnent pas de signal spécifique. La bande
à 31 kD (qui n’est pas toujours visible) résulte d’une fixation non spécifique
de l’anticorps secondaire à la protéinase K et elle peut servir de marqueur
additionnel pour l’orientation.
Les échantillons positifs (ESBfort ; ESBfaible) donnent des signaux en trois
bandes, la bande du haut (A) correspond à une protéine de poids moléculaire
d’environ 30 kD. L’intensité du signal de toutes les bandes (en particulier celle
des bandes du bas B et C) peut être plus faible que ce qui apparaît sur cette
figure mais la bande du haut (A) devrait toujours être clairement visible. La
3
flèche (D) illustre la différence de poids moléculaire entre la protéine prion
pathogène digérée et la protéine normale non digérée.
Si ce test est destiné à être utilisé pour le dépistage, un échantillon répété
réactif doit être confirmé par le laboratoire national de référence en utilisant
une méthode de confirmation supplémentaire. Si il est utilisé pour
confirmation, ce test ne peut être utilisé qu’en conjonction avec les
recommandations de l'OIE/LRUE.
Annexe A - Schémas pour la préparation des solutions
diluées
Solution d’homogénéisation 1x
Mélanger les volumes indiqués d’eau ultra pure et de tampon
d’homogénéisation 5x (composant 1) pour obtenir le volume désiré de
solution d’homogénéisation 1x :
Durée de conservation de la solution d’homogénéisation 1x : 1 semaine à 5±3°C.
Vol. du tampon
d’homogénéisation (1x)
250 mL
500 mL
1000 mL
=
=
=
Volume du tampon
d’homogénéisation concentré
(5x) (composant 1)
50 mL
100 mL
200 mL
Volume d’eau
ultrapure
+
+
+
200 mL
400 mL
800 mL
Tampon de blocage PVDF
Vol. de tampon
blocage PVDF (1x)
500 mL
Vol. de tampon de blocage
PVDF (5x) (composant 7)
100 mL
=
Vol. d’eau ultrapure
+
Taille du
plateau
(cm)
Grand
(22.4 × 15.6)
Grand
(22.4 × 15.6)
Moyen
(15 × 11.4)
Moyen
(15 × 11.4)
Petit
(5.5 × 9.5)
270 mL
=
+
CDP-Star
12.5 mM
25 mM
50 mL
10 µL
5 mL
100 µL
50 µL
50 mL
10 µL
4 mL
80 µL
40 µL
25 mL
5 µL
3 mL
60 µL
30 µL
25 mL
5 µL
3 mL
60 µL
30 µL
10 mL
2 µL
2 mL
40 µL
20 µL
Membrane
400 mL
Vol. d’eau ultrapure
Tampon de
luminescence
Schéma recommandé pour le placement de gels sur la membrane de
transfert.
• Plaque de 96 puits avec 48 échantillons en double, transférés sur six
gels à 17 puits.
• Les numéros indiquent les échantillons 1–48 (M = marqueur
moléculaire avec PrPC non digérée).
M, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7, 8, 8
M,17,17,18,18,19,19,20,20,21,21,22,22,23,23,24,24
243 mL
M, 9, 9,10,10,11,11,12,12,13,13,14,14,15,15,16,16
Gel 2
Gel 1
Mélanger les volumes indiqués d’eau ultra pure et de tampon de
luminescence (composant 10) pour obtenir le volume désiré de tampon de
luminescence (1x) :
Vol. de tampon de
luminescence (10x)
(composant 10)
27 mL
2ème
anticorps
Annexe C - Schéma de placement de gels sur la membrane
de transfert
Tampon de luminescence
Vol. de tampon de
luminescence (1x)
TBST
M,25,25,26,26,27,27,28,28,29,29,30,30,31,31,32,32
Gel 4
Gel 3
Tampon de migration pour NuPAGE SDS-MOPS 1x
™
Vol. de tampon de
migration NuPAGE™
SDS-MOPS (1x)
1000 mL
Vol. de tampon de migration
NuPAGE™ SDS-MOPS (20x)
=
Vol. d’eau ultrapure
50 mL
+
M,33,33,34,34,35,35,36,36,37,37,38,38,39,39,40,40
950 mL
Gel 5
Tampon de transfert
Vol. de tampon
de transfert (1x)
2000 mL
=
Vol. de tampon de
transfert (10x)
200 mL
+
Vol. d’eau
ultrapure
1600 mL
+
+
Vol. d’eau
ultrapure
950 mL
+
Vol. de méthanol
(98%)
200 mL
TBST
Vol. de TBST (1x)
1000 mL
Vol. de TBS (20x)
=
50 mL
50% Tween 20
1 mL
Ponceau S
Vol. de Ponceau S (1x)
1000 mL
=
Vol. de Ponceau S (20x)
50 mL
Vol. de TBST (1x)
950 mL
+
6
4
3
2
1
Taille du plateau
(cm)
Grand
(22.4 × 15.6)
Grand
(22.4 × 15.6)
Moyen
(15 × 11.4)
Moyen
(15 × 11.4)
Petit
(5.5 × 9.5)
Gel 6
Annexe D - Protocole de lavage des flacons
PrioCLIP™/Prypcon
Instructions générales
Traçabilité de l’échantillon
Les flacons d’homogénéisation PrioCLIP™/Prypcon doivent porter le
numéro de l’échantillon—apposé, par ex. à l’aide d’un marqueur ou
d’étiquettes résistants à l’eau—afin de garantir la traçabilité de l’échantillon.
Le marquage des flacons ne peut être ôté qu’après la remise des résultats.
Traçabilité de l’utilisation des PrioCLIP™/Prypcon
Annexe B - Volumes requis pour divers nombres
d’échantillons
No. de
gels
M,41,41,42,42,43,43,44,44,45,45,46,46,47,47,48,48
Taille de la
membrane
TBST
1er anticorps
13 × 17 cm
50 mL
10 µL
9 × 17 cm
50 mL
10 µL
13 × 8.5 cm
25 mL
5 µL
9 × 8.5 cm
25 mL
5 µL
4.5 × 8.5 cm
10 mL
2 µL
Les flacons d’homogénéisation ne doivent pas être utilisés plus de 5 fois.
Les flacons PrioCLIP™/Prypcon doivent être marqués d’un trait ou d’un
point à l’aide d’un marqueur résistant à l’eau après chaque utilisation.
Ne pas utiliser de désinfectants à base d’hypo-chlorite pour le lavage.
Préparation
• Remplir deux récipients d’une quantité suffisante d’eau désionisée (au
moins 25 L), afin de permettre l’immersion complète des flacons
PrioCLIP™/Prypcon durant les étapes du lavage.
Egouttement
• Vider les flacons contenant des homogénats "TSE négatifs" dans une
bouteille autoclavable thermo-résistante ou dans une boîte/flacon
jetable.
• Les flacons dont le contenu a été identifié comme « initialement
réactif » ne doivent pas être réutilisés et doivent être éliminés
conformément aux directives nationales de sécurité.
Lavage
• Immerger les flacons PrioCLIP™ /Prypcon vides dans un récipient
contenant de l’eau désionisée, rincer abondamment.
• Inspecter visuellement les flacons d’homogénéisation en cherchant des
détériorations éventuelles et une possible contamination par du tissu,
lors du transfert du premier récipient au second récipient. Eliminer tout
flacon d’homogénéisation PrioCLIP™/Prypcon abîmé ou contaminé.
• Immerger les flacons et les incuber pendant au moins 30 min à 22±3°C.
Séchage
• Sortir les flacons PrioCLIP™/Prypcon du récipient, secouer pour
éliminer l’eau résiduelle et les laisser sécher complètement à 22±3°C.
4
PrioWESTERN BSE Kit Notice d’Utilisation
• Il est également possible de faire sécher les flacons PrioCLIP™/Prypcon
dans une étuve de séchage. Placer les flacons sur une surface résistante
à la chaleur, les chauffer pendant 2 heures à 85±5°C et faire sécher
pendant une nuit à 50°C dans une étuve de séchage. Répéter l’étape de
chauffage (2 heures, 85±5°C).
• Contrôler visuellement les flacons PrioCLIP™/Prypcon. Eliminer les
flacons qui sont abîmés ou contiennent des résidus de liquide ou de tissu.
• Les flacons PrioCLIP™/Prypcon sont maintenant prêts à être réutilisés.
Elimination des déchets
• Les homogénats et les solutions de lavage doivent être éliminés
conformément aux directives nationales de sécurité.
Un protocole de lavage détaillé pour PrioCLIP™/Prypcon (avec
illustrations) peut être demandé au Support Technique.
Annexe E - Certification par l’OIE : résumé des études de
validation
Caractéristiques analytiques
Sensibilité analytique
• Des séries de dilution furent testées dans le cadre de l’étude de
validation de l’Union Européenne. Sur 20 homogénats positifs testés à
une dilution de 10-1, 15 s’avérèrent positifs, deux douteux et trois
négatifs. Deux échantillons s'avérèrent également douteux à 10-2 et un
seul échantillon à une dilution de 10-2.5. [Les échantillons positifs furent
fournis par le Central Veterinary Laboratory (CVL), Weybridge : des
échantillons de tronc cérébral et de moëlle épinière furent sélectionnés à
partir de bovins présentant des signes cliniques d’ESB confirmés par un
examen histologique.]
Spécificité analytique
• Ceci n’a pas été spécifiquement examiné. Cependant, certaines études
de terrain, utilisant des échantillons prélevés sur des animaux trouvés
morts (animaux souffrant de troubles autres que l’ESB, par ex.
encéphalite, œdème cérébral, rage, listériose), ont constamment montré
que le PrioWESTERN BSE Kit dispose d’une bonne spécificité
analytique [cf. D. Heim et al. (2000) Surveillance of BSE. Arch Virol
Suppl. (16):127–33)].
Données de répétabilité
• Les tests effectués sur une période allant de 2002 à 2007 indiquent que
le kit pourrait détecter un échantillon positif pour l’ESB à une dilution
de 1:10.
• La répétabilité fut également étudiée lors d’un essai comparatif de trois
tests ESB (Enfer – Bio-Rad Te SeE – PrioWESTERN BSE Kit), réalisé par
le Laboratoire de Référence Européen de l’ESB (VLA, Royaume-Uni).
La cohérence entre les échantillons duplicats (n = 277) était élevée, à
l’exception de deux cas où le report d’un puits positif adjacent entraina
une petite bavure non spécifique dans l’un des puits adjacents d’un
échantillon négatif. Ceci était clairement différent des résultats positifs,
qui étaient de taille caractéristique, en forme de bandes et présentes à la
fois dans les deux puits dupliqués.
Caractéristiques du diagnostic
Détermination du seuil
Ce test ne donne pas de lecture quantitative. La réponse est qualitative et est
basée sur les deux critères de présence du signal et de sa position. Ceci permet
une discrimination aisée entre les vrais positifs et les (potentiellement) faux
positifs par suite de la PrP normale non digérée.
Estimations de la sensibilité diagnostique (SeD) et de la spécificité
diagnostique (SpD)
Trois études d’évaluation externes ont été décrites pour l’estimation de la
sensibilité et de la spécificité diagnostiques :
• Tests réalisés au Laboratoire de Référence Suisse de l'ESB
(NeuroCentre/Université de Berne) en février 2003 sur 38 échantillons
positifs (18 homogénats & 20 échantillons tissulaires) du RU/190
échantillons négatifs du programme de surveillance Suisse de l’ESB
(échantillons tissulaires de bovins de plus de 30 mois qui avaient été
testés négatifs par histologie/immunohistochimie).
ESB positif par IHC
ESB négatif par IHC
Test Positif par
38
PrioWESTERN BSE Kit
Test Négatif par
0
PrioWESTERN BSE Kit
Sensibilité diagnostique : 100%, CI [90.7 –100.0%]
Spécificité diagnostique : 100%, CI [98.1–100.0%]
PrioWESTERN BSE Kit Notice d’Utilisation
0
190
• Etude de terrain canadienne, 2003. Faisant suite à la détection du cas
référencé en mai 2003, 2036 cohortes de naissance et d’alimentation
furent testées par immunohistochimie (IHC) et par le PrioWESTERN
BSE Kit. Ce travail fût réalisé par les laboratoires de l’Agence
d’Inspection Alimentaire Canadienne à Lethbridge, Winnipeg, Nepean
et St-Hyacinthe.
ESB positif par IHC
ESB négatif par IHC
1
0
0
2036
Test Positif par
PrioWESTERN BSE Kit
Test Négatif par
PrioWESTERN BSE Kit
Spécificité diagnostique : 100%, CI [99.8–100.0%]
• Evaluation des tests pour le diagnostic de l’Encéphalopathie
Spongiforme Transmissible chez les bovins pour la Commission
Européenne, 1999. Tous les échantillons furent préparés par l’Institut
européen des mesures et matériaux de référence (IRMM) à Geed,
Belgique et présentés à l’analyse dans un format codé « aveugle » aux
différents participants (le PrioWESTERN BSE Kit était l’un des quatre
kits sélectionnés) : un total de 300 échantillons positifs (prélevés à partir
de bovins montrant des signes cliniques d’ESB et confirmés par examen
histologique – fournis par CVL Weybridge) et de 100 échantillons
négatifs (prélevés en Nouvelle Zélande à partir de bovins adultes sains
agés d’au moins 4 ans et confirmés négatifs par examen histologique).
ESB positif par histologie
ESB négatif par histologie
300
0
0
1000
Test Positif par
PrioWESTERN BSE Kit
Test Négatif par
PrioWESTERN BSE Kit
Sensibilité diagnostique : 100%, CI [98.8 –100%]
Spécificité diagnostique : 100%, CI [99.6–100.0%]
Concordance entre les tests
La concordance entre le PrioWESTERN BSE Kit avec l’examen histologique
et l’IHC est élevée.
Reproductibilité
Durant l’évaluation de terrain de l’Union Européenne en 2004, des
échantillons furent testés à l’aide du PrioWESTERN BSE Kit. Ces résultats
furent comparés avec les résultats atteints avec d’autres tests en cours
d’évaluation. Les échantillons furent divisés en trois catégories :
échantillons positifs, échantillons négatifs et échantillons de faible qualité.
• Un total de 335 échantillons positifs à l’ESB fut testé dans trois
laboratoires (VLA, Newcastle, RU - Analytico Food BV, Heerenveen,
Pays-Bas et Laboratorio Central de Veterinaria, Algete, Espagne).
• Un total de 24.534 échantillons négatifs à l’ESB fut testé dans huit
laboratoires (Analytico Food BV, Heerenveen, Pays-Bas ; Institut für
Veterinärmedizin, Mödling, Autriche ; Instituut voor Dierhouderij en
Diergezondheid, Lelystad, Pays-Bas ; Laboratorio EET, Leon, Espagne ;
Labor Dr. Guenteert, Luzern, Suisse ; Instituto Zooprofilatiico
Sperimentale del Piemonte, Turin, Italie ; Irish Equine Centre, Kildare,
Irlande ; Arthus Biotech GmbH, Hamburg, Allemagne).
• En plus, 423 échantillons de faible qualité furent testés dans deux
laboratoires (VLA, Newcastle, RU et NeuroCentre, Berne, Suisse).
Les résultats inter-laboratoires de tous les échantillons testés furent
identiques pour le PrioWESTERN BSE Kit. Les concordances avec les autres
tests en cours d’évaluation furent très élevées, à l’exception d’un
échantillon faiblement positif détecté par le PrioWESTERN BSE Kit et qui
n’avait pas été identifié comme positif lors de l’utilisation du test CediTect.
Source : Rapport : The Field Trial of Seven New Rapid Post Mortem Test
for the Diagnosis of Bovine Spongiform Encephalopathy in Bovines ;
IRMM ; 12 Novembre 2004.
Applications
PrioWESTERN BSE Kit est actuellement utilisé à la fois par les Laboratoires
de Référence et de routine à travers le monde entier.
Les laboratoires d’essai devraient participer à des essais d’aptitude et des
programmes de formation des laborantins organisés par les Laboratoires de
Référence de l’OIE.
Annexe F - Règles de sécurité
Les laboratoires sont tenus de se conformer aux Consignes Nationales de
Sécurité. Pour orientation, une directive de sécurité concernant la
manipulation des protéines prions a été publiée par l'ACDP (Advisory
Committee on Dangerous Pathogens): “Transmissible spongiform
encephalopathy agents: safe working and the prevention of infection”,
Department of Health, London, Grande-Bretagne (on peut se le procurer à
l'adresse suivante: Stationery Office, ISBN 0113221665.
(https://www.gov.uk/government/publications/guidance-from-the-acdptse-risk-management-subgroup-formerly-tse-working-group)
5
Annexe G - Référence
1. Oesch B, Doherr M, Heim D, Fischer K, Egli S, Bolliger S, Biffiger K,
Schaller O, Vandevelde M, Moser M (2000) Application of Prionics
Western blotting procedure to screen for BSE in cattle regularly
slaughtered at Swiss abattoirs. Arch Virol 16:189–195.
2. Doherr MG, Oesch B, Moser M, Vandevelde M, Heim D (1999 Dec 4)
Targeted surveillance for bovine spongiform encephalopathy.
Veterinary Record 145:672.
3. Schaller O, Fatzer R, Stack M, Clark J, Cooley W, Biffiger K, Egli S,
Doherr M, Vandevelde M, Heim D, Oesch B, Moser M (1999 Nov)
Validation of a Western immunoblotting procedure for bovine PrPSc
detection and its use as a rapid surveillance method for the diagnosis of
bovine spongiform encephalopathy (BSE). Acta Neuropathol (Berl)
98(5):437–43.
4. Calavas D, Ducrot C, Baron T, Morignat E, Vinard JL, Biacabe AG,
Madec JY, Bencsik A, Debeer S, Eliazsewicz M (2001 Jul 14) Prevalence
of BSE in western France by screening cattle at risk: preliminary results
of a pilot study. Vet Rec 149:55–56.
5. Heim D, Wilesmith JW (2000) Surveillance of BSE. Arch Virol
(16):127–33.
6. (2012) Bovine Spongiform Encephalopathy. Manual of Diagnostic Tests
and Vaccines for Terrestrial Animals OIE Chapter 2.4.6.
7. European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy (2009) Scientific
Opinion on Analytical sensitivity of approved TSE rapid test, EFSA
Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). EFSA Journal 7(12):1436.
Validé et certifié par l'OIE comme étant propres aux fins définies dans la
présente notice.
Numéro d'enregistrement : 20080102
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
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3 avril 2019
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• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches
Signalétiques))
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Garantie produit limitée
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selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site
www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous
avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à
l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.
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