Thermo Fisher Scientific PrioCHECK EHDV Ab Serum Kit Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
PrioCHECK™ EHDV Ab Serum Kit
Test immunoenzymatique de détection spécifique des anticorps anti-EHDV dans le
sérum de ruminant
Référence Catalogue VETEHDV2
Technique
ELISA compétition (ou blocking)
– Plaques sécables
Partie Nº 100020243 Pub. Nº MAN0008627 Rév. B.0
Espèce
Matrice
Test
Protocole
Bovins
Cervidés
Sérum
Individuel
Incubation courte
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de
manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de
données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives
aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de
sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Informations générales
La maladie épizootique hémorragique (EHD en anglais) est une maladie infectieuse vectorielle, due à
l'infection par un virus (EHDV - Epizootic Hemorrhagic Disease Virus) de la famille des Reoviridae, genre
Orbivirus (comme le virus de la Bluetongue). Le nombre de sérotypes identifiés varient de 7 à 8. Le virus
de l'EHD peut atteindre les bovins et entrainer l'apparition de signes cliniques similaires à ceux observés
pour la Bluetongue chez les ovins. Les signes cliniques observés sont : fièvre, lésions érosives et
ulcératives des muqueuses oro-pharyngées, raideur, abattement, œdème de la peau. La transmission du
virus se fait presque exclusivement par piqûre infectante d'un petit diptère hématophage appartenant à la
famille des Ceratopogonidae, genre Culicoides. Le vecteur s'infecte par repas de sang pris sur un animal
infecté. Puis, il multiplie le virus jusqu'à une dose nécessaire pour sa transmission à d'autres animaux
réceptifs.
Il a été montré que Applied Biosystems™ PrioCHECK™ EHDV Ab Serum Kit est capable de détecter les
anticorps des différents sérotypes de l’EHDV et de ne pas détecter les 26 sérotypes du virus de la
Bluetongue. Ce kit possède aussi un haut niveau de sensibilité et de spécificité. Il est utilisable sur les
sérums individuels de bovins, cervidés.
Principe du test
Le test est basé sur le principe d’un ELISA compétition (ou blocking).
1. Les échantillons et les contrôles sont déposés dans la plaque sensibilisée avec de l'antigène (Ag)
EHDV. Les anticorps spécifiques anti-EHDV éventuellement présents se lient à l’Ag.
2. Après lavage, un conjugué (anticorps anti-EHDV) marqué à la peroxydase est ajouté et se fixe sur les
sites antigéniques laissés libres.
3. Le conjugué non fixé est éliminé par lavage avant addition d’un substrat chromogène. L’apparition
d’une coloration bleue est la conséquence de l'oxydation du substrat par la peroxydase du conjugué.
4. Après arrêt de la réaction, la coloration devient jaune. La lecture des résultats est réalisée par un
lecteur de plaques ELISA.
L'absence de coloration ou une très faible coloration indique un échantillon positif.
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Réactifs du kit et conservation
Composant
1 - Coated microplate EHDV
2 - Negative C. EHDV
3 - Positive C. EHDV
Description
Quantité
(192 tests)
Conservation
2 unités
5±3°C(1)
400 µL
400 µL
5±3°C
5±3°C(2)
Plaque sensibilisée EHDV, 12 barrettes de
8 cupules
Contrôle Négatif EHDV (NC)
Contrôle Positif EHDV (PC)
4 - Conjugate (100x) EHDV
Conjugué (100X) EHDV, 100 fois concentré
250 µL
A - Wash (10x)
B1 - Sample DB EHDV
B2 - Conjugate DB EHDV
C - Substrate
D - Stop
Adhésifs de plaques
Solution de lavage (10X), 10 fois concentrée
Diluant échantillon EHDV
Diluant conjugué EHDV
Solution Substrat
Solution d’arrêt
125 mL
40 mL
24 mL
24 mL
24 mL
4
(1)
(2)
(3)
5±3°C
TA(3)
Les barrettes non utilisées peuvent être stockées dans le sachet fermé avec dessicant (fourni dans le kit) à 5±3°C jusqu’à la
date de péremption du kit.
La solution de conjugué diluée est à utiliser immédiatement après préparation.
Température ambiante
Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fourni dans le kit
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
Micropipettes monocanales et multicanaux
Eau distillée ou déionisée
Plaques de prédilution
Réservoirs à usage unique
Embouts de pipette à usage unique
Incubateur de microplaque (37±2°C)
Lecteur ELISA équipé d’un filtre à 450 nm ou de filtres
à 450 et 620 nm
Précautions d’emploi
• Ne pas mélanger des réactifs provenant de différents lots de kits.
• Eviter la contamination des réactifs en utilisant du matériel de prélèvement à usage unique.
• Ne pas pipeter les réactifs avec la bouche.
Informations sur les échantillons
Des sérums frais, réfrigérés (8 jours à 5±3°C) ou congelés (1 an < −16°C) sont utilisables.
Les échantillons et les contrôles préalablement homogénéisés sont testés dilués au 1:20.
La limpidité du sérum ayant montrée dans certains cas un impact sur la spécificité du test, il est
recommandé de réaliser une centrifugation de 5 minutes à 3000 rpm avant de tester des échantillons
hémolysés.
NOTE : Il est fortement conseillé d’utiliser un traceur interne pour chaque manipulation. Une référence
interne (Réf. REHDV) est disponible.
Préparation des réactifs
• Les réactifs 1 - Coated microplate EHDV, B1 - Sample DB EHDV, B2 - Conjugate DB EHDV,
C - Substrate, et D - Stop sont prêts à l’emploi.
• Les réactifs 2 - Negative C. EHDV et 3 - Positive C. EHDV sont à tester comme les échantillons.
• La solution de lavage A - Wash (10x) est à diluer au 1:10 dans de l'eau distillée/déionisée.
Exemple : pour une barrette : 2 mL de solution A - Wash (10x) dans 18 mL d'eau ; pour une plaque :
25 mL de solution A - Wash (10x) dans 225 mL d’eau.
Mélanger après dilution. La solution Wash diluée peut être conservée 1 mois à 5±3°C.
NOTE : Du fait d’une forte concentration en sels, des cristaux peuvent se former dans la solution
A - Wash (10x). Les cristaux peuvent être dissous sous agitation. Il est recommandé d’homogénéiser la
solution avant dilution.
• Le réactif 4 - Conjugate (100x) EHDV est à diluer au 1:100 dans le réactif B2 - Conjugate DB EHDV.
Mélanger après dilution.
• La solution Conjugate EHDV diluée est à utiliser immédiatement après préparation.
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PrioCHECK™ EHDV Ab Serum Kit Notice d’Utilisation
Réalisation du test ELISA
NOTE : Porter les réactifs à température ambiante (21±4°C) avant la réalisation du test. La zone de
tolérance des temps d’incubation est de ±10%. Il est recommandé d’utiliser des réservoirs à usage unique
pour la distribution des composants.
1. Distribution des contrôles et des échantillons
Les échantillons et les contrôles sont à analyser au 1:20.
Dans une plaque de prédilution :
• Distribuer 7 µL de 3 - Positive C. EHDV dans les cupules A1 et B1 (par exemple).
• Distribuer 7 µL de 2 - Negative C. EHDV dans les cupules C1 et D1 (par exemple).
• Distribuer 7 µL de sérum à analyser dans les cupules suivantes.
• Distribuer 135 µL du réactif B1 - Sample DB EHDV dans les cupules contenant les contrôles et les
échantillons.
Agiter doucement la plaque.
Transférer 100 µL de chaque échantillon et contrôles pré-dilués de la plaque de prédilution dans la plaque
sensibilisée.
Tapoter les bords de la plaque ou l’agiter doucement afin de bien répartir les sérums sur toute la
surface des cupules puis couvrir la plaque à l’aide d’un adhésif de plaque. Incuber la plaque 15 minutes
à 37±2°C.
2. Lavages
Vider la plaque et réaliser 3 lavages avec la solution Wash diluée (voir « Préparation des réactifs ») à
raison de 300 µL par cupule. Vider et tapoter la plaque sur un papier absorbant pour éliminer toute trace
de liquide. Les lavages sont réalisables, au choix, manuellement ou au laveur automatique. Ne pas laisser
sécher les plaques.
3. Distribution du conjugué
Distribuer 100 µL de solution Conjugate EHDV diluée (voir « Préparation des réactifs ») dans chaque
cupule. Agiter doucement et couvrir la plaque à l’aide d’un nouvel adhésif de plaque. Incuber la plaque
30 minutes à 37±2°C.
4. Lavages
Réitérer l’étape « 2. Lavages » définie précédemment.
5. Révélation
Distribuer 100 µL de solution C - Substrate dans chaque cupule. Agiter doucement la plaque (2 secondes).
Incuber 8 minutes à température ambiante (21±4°C) et à l'obscurité. Ne pas couvrir la plaque.
Distribuer 100 µL de solution D - Stop dans chaque cupule et dans le même ordre que la solution
C - Substrate. Agiter doucement la plaque (2 secondes).
6. Lecture
Essuyer le dessous des plaques, avec un chiffon doux pour éliminer d’éventuelles poussières. Lire la
plaque au maximum 30 minutes après l’arrêt de la réaction, à 450 nm en monochromatisme ou à
450−620 nm en bichromatisme.
Calcul des résultats
Calculer la DO moyenne du PC (DOm PC), et celle du NC (DOm NC).
Pour chaque échantillon, calculer le pourcentage d’inhibition (% Inh) :
% Inh = [ (DOm NC − DO Éch) / DOm NC ] × 100
NOTE : Pour les échantillons négatifs, il est possible d’obtenir % Inh < 0.
Validation du test
Le test est validé si :
DOm NC > 0.600 et % Inh PC ≥ 60%
PrioCHECK™ EHDV Ab Serum Kit Notice d’Utilisation
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Interprétation des résultats
(1)
(2)
Résultats
Interprétation
% Inh < 55
Négatif
55 ≤ % Inh < 60
Douteux(1)
% Inh ≥ 60
Positif(2)
La positivité de l’échantillon va dépendre de l’épidémiologie dans le pays concerné.
Si l’EHDV a été déclaré dans le pays concerné, nous recommandons de retester en ELISA un échantillon douteux. Si le second
résultat est positif ou douteux, l’animal est considéré comme positif en EHDV. Si l’EHDV n’a jamais été déclaré dans le pays,
l’échantillon est à retester une seconde fois par ELISA et PCR. Nous recommandons un suivi pour cet animal.
Documentation et support
Service clientèle et assistance technique
Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion
Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à
l'assistance technique, notamment :
• Numéros de téléphone partout dans le monde
• Commande et Support web
• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques))
Remarque: Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter
chaque fabricant.
Produit à garantie limitée
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions
générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/
terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à
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Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008627 (français)
Rév.
Date
Description
Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la
B.0
13 octobre 2016
garantie, aux marques et aux logos.
A.0
6 novembre 2013
Base de référence pour l’historique de révision
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13 octobre 2016
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