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VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Guide d’interprétation pour le carcinome mammaire et gastrique Images de la page de garde et de la quatrième de couverture : Grappes de HER2 et de chromosome 17, amplifiées II VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Table des matières Introduction1 Description générale du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 1 Objectif du Guide d’interprétation 2 Utilisation prévue 2 Que pouvez-vous attendre du test par VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail en termes de performance dans votre laboratoire ? 3 Identification d’un profil de coloration approprié 4 Statut du gène HER2 4 Conformité des lames 9 Visualisation et comptage des signaux 12 Évaluation des lames 15 Exemples de profils de coloration du gène HER2 et du chromosome 17 dans des cas cliniques 17 Schémas de coloration courants 17 Autres observations 18 Aneusomie du chromosome 17 20 Amplification péricentromérique du chromosome 17 21 Contrôle qualité de la coloration ISH 22 Présence de noyaux de contrôle positif dans chaque échantillon 22 Lames de xénogreffe HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides 22 Éléments à prendre en compte avant l’analyse 24 Fixation24 Épaisseur des échantillons 25 Autres éléments à prendre en compte 26 Résolution des problèmes 27 Références34 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique III IV VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Introduction Description générale du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail est conçu pour détecter de manière quantitative, par microscopie optique, l’amplification du gène HER2 via une technique d’hybridation in situ (ISH) chromogénique double couleur dans des échantillons de tissus fixés au formol et inclus en paraffine, issus de carcinomes mammaires et gastriques humains, y compris de la jonction gastro-œsophagienne, après coloration sur les instruments BenchMark IHC/ISH. Ce produit doit être interprété par un anatomopathologiste qualifié, en conjonction avec un examen histologique, les informations cliniques pertinentes et des contrôles appropriés. Le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail détermine le statut du gène HER2 en détectant : (1) les copies du gène HER2 via une technique d’hybridation in situ à l’argent (SISH - Silver In Situ Hybridization) et (2) les copies du chromosome 17 (Chr17) par hybridation in situ chromogénique rouge (Red ISH) sur une seule lame. Avant d’interpréter les résultats, la coloration des noyaux de contrôle positif interne doit être évaluée par un lecteur qualifié et expérimenté en interprétation microscopique des échantillons de carcinomes mammaires et gastriques, en procédures ISH et en identification de copies uniques et amplifiées du gène HER2 (qui peuvent nécessiter un examen microscopique à un grossissement allant de 40x à 60x). Le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail est un mélange de sondes oligonucléotides qui ciblent spécifiquement le gène HER2 (également connu sous les noms de ERBB2 et NEU) situé sur le Chr17 humain (17q12) et la région centromérique du Chr17 qui sert de référence pour l’aneusomie. Le produit est un réactif de sonde prédilué destiné à être utilisé sur les instruments BenchMark IHC/ISH avec le kit de détection VENTANA Silver ISH DNP Detection Kit, le kit de détection VENTANA Red ISH DIG Detection Kit et l’algorithme d’évaluation développé par Ventana. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 1 Objectif du Guide d’interprétation Utilisation prévue Ce guide a pour but de fournir aux lecteurs un outil pour faciliter la détermination du statut du gène HER2 via l’interprétation des profils de coloration du HER2 et du Chr17 obtenus à l’aide du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. Les cas suivants illustrent la diversité des profils de coloration susceptibles d’être observés dans des échantillons de tissu mammaire ou gastrique après coloration au moyen du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail (Figures 2 à 23). Consultez la notice du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail correspondante (réf. 1018383) pour plus de détails sur l’utilisation prévue de ce produit. Ces images permettent à un nouvel utilisateur de se familiariser avec le spectre des profils de coloration possibles : la coloration d’une copie unique du gène HER2 et du Chr17, la coloration de copies multiples et de grappes, la polysomie du Chr17, ainsi que la coloration des artéfacts susceptibles d’être rencontrés. De plus, ces images aideront à déterminer la conformité des lames, le comptage des nombres de copies à l’aide d’un algorithme d’évaluation et la résolution des problèmes liés à l’analyse. Toute coloration effectuée dans le laboratoire de l’utilisateur final doit être interprétée en tenant compte des noyaux de contrôle positif interne qui sont présents dans chaque cas clinique. Pour plus d’informations, consultez la notice (réf. 1018383) disponible en ligne (www.ventana.com), ainsi que les sections Contrôle qualité et Conformité des lames du présent guide. Les images figurant dans le présent guide d’interprétation proviennent d’échantillons colorés à l’aide du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, développé et validé sur les BenchMark IHC/ISH Instruments. 2 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Que pouvez-vous attendre du test par VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail en termes de performance dans votre laboratoire ? Il est recommandé de fixer les tissus dans du formol neutre tamponné à 10 % (NBF) pendant 6 à 72 heures, de les inclure en paraffine et de réaliser des coupes d’environ quatre microns d’épaisseur.1-2 Les protocoles de coloration spécifiques pour le carcinome mammaire ou gastrique ont été optimisés pour ces conditions de fixation ; consultez la notice de la sonde (réf. 1018383) pour les paramètres du protocole. Des études indiquent que la majorité des résultats non concluants concernant le gène HER2 sont liés à des facteurs pré-analytiques, notamment une sous-fixation et une surfixation3, ainsi qu’un retard de fixation.4 Bien qu’il soit possible de mettre en œuvre de manière stricte les conditions de fixation appropriées,3 il est difficile de contrôler précisément le temps de fixation des tissus dans les laboratoires de référence recevant des échantillons provenant de diverses sources. Afin de compenser les variations liées aux tissus, notamment les facteurs pré-analytiques variables, cette analyse a été développée avec un certain nombre d’étapes de protocole personnalisables pour le prétraitement. Ces options peuvent permettre d’optimiser l’analyse selon les besoins en tenant compte de la spécificité des échantillons. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 3 Identification d’un profil de coloration approprié Statut du gène HER2 Chez l’homme, le gène HER2, situé sur le Chr17, code pour la protéine HER2. Une amplification du gène HER2 est observée dans environ 15 à 25 % des cas de carcinome mammaire et est associée à une agressivité de la tumeur.5-9 De nombreux essais cliniques ont démontré que l’amplification et/ou la surexpression du gène HER2 sont corrélées à des résultats cliniques médiocres chez la femme atteinte d’un carcinome mammaire invasif et rattachées à plusieurs facteurs pronostiques défavorables, notamment un statut négatif du récepteur des œstrogènes (ER), une fraction des cellules en phase S importante, un statut ganglionnaire positif, une mutation de la protéine p53 et un grade nucléaire élevé.10-11 De plus, de récentes études indiquent que le gène HER2 est surexprimé dans 24 % des cas de carcinome gastrique.12 Vous trouverez dans ce guide d’interprétation des exemples de colorations effectuées avec le cocktail VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail sur des carcinomes mammaires et gastriques (Figures 2 et 3). L’ensemble des instructions sur les éléments à prendre en compte avant l’analyse, sur le comptage et sur la résolution de problèmes dont il est question dans ce guide s’applique aux échantillons tissulaires de carcinomes mammaires et gastriques. Le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail a été conçu pour permettre de co-hybrider et de visualiser par microscopie optique le gène HER2 et le centromère du Chr17 sur une même lame. Le gène HER2 est détecté par une sonde marquée au dinitrophényle (DNP) et visualisé à l’aide du kit de détection VENTANA Silver ISH DNP Detection Kit (Figure 1A). Le centromère du Chr17 est détecté à l’aide d’une sonde marquée à la digoxygénine (DIG) et visualisé à l’aide du kit de détection VENTANA Red ISH DIG Detection Kit (Figure 1B). Consultez les notices des kits de détection (réf. 1018384 et 1018385) pour de plus amples informations. Les lames colorées à l’aide du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail sont visualisées par microscopie optique, le gène HER2 apparaissant sous la forme de signaux noirs distincts (SISH) et le Chr17 apparaissant sous la forme de signaux rouges (Red ISH) dans les noyaux des cellules normales (servant de contrôle positif interne pour la coloration), ainsi que des cellules cancéreuses. Cette stratégie permet de déterminer le statut du gène HER2 à son état chromosomique, à l’aide d’un microscope optique standard à grossissement 20x, 40x ou 60x. Ventana Medical Systems, Inc. (« Ventana ») a développé un algorithme d’évaluation quantitative permettant de déterminer le statut du gène HER2 après coloration par le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. Cet algorithme est décrit de façon détaillée à la section Évaluation des lames (Figure 7). Le statut du gène HER2 est déterminé comme une fonction du rapport entre le nombre de copies du gène HER2 et le nombre de copies du Chr17 dans les noyaux des cellules issues d’un carcinome gastrique ou mammaire invasif. Le statut du gène HER2 peut être défini comme non amplifié (ratio HER2/Chr17 < 2,0 : Figure 2, cas 1) ou amplifié (ratio HER2/Chr17 ≥ 2,0 : Figure 2, cas 3). Il convient d’agir avec précaution pour les cas dont le ratio se situe entre 1,8 et 2,2.1 Les Figures 2, 3 et 6 reproduisent des exemples illustrant les différents statuts HER2. Figure 1. Cocktail de sondes et systèmes de détection A. Sonde HER2 marquée au DNP et VENTANA Silver ISH B. Sonde Chr17 marquée à la DIG et VENTANA Red ISH DIG DNP Detection Kit Detection Kit 3, 4, 5 : Silver Reagents A, B, C 1 : Anticorps anti-DNP marqué à l’HQ Signal SISH 2 : Anticorps HRP anti-HQ DNP Sonde HER2 marquée au DNP 4 3, 4, 5 : pH Enhancer, Naphthol, Fast Red 1 : Anticorps anti-DIG marqué au NP Signal Red ISH 2 : Anticorps AP anti-NP DIG Sonde Chr17 marquée à la DIG VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Figure 2. Cas représentatifs du statut du gène HER2 dans des carcinomes mammaires et gastriques Cas 1. Carcinome mammaire : gène HER2 non amplifié H&E 60x VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; des signaux SISH et Red ISH distincts sont visibles, à raison de 1 à 2 copies par cellule tumorale. Cas 2. Carcinome mammaire : non amplifié, plusieurs copies de HER2 et du Chr17 H&E 60x VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; plus de 2 signaux SISH et Red ISH présents dans certaines cellules tumorales. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 5 Cas 3. Carcinome mammaire : amplifié, avec grappes SISH (HER2) H&E 60x VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; des grappes SISH (HER2) sont présentes et évaluées par le lecteur. On observe 1 à 2 copies du signal Red ISH pour le Chr17. Cas 4. Carcinome mammaire : faiblement amplifié, avec plusieurs copies uniques du gène HER2 H&E 60x 6 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; on observe plus de 6 copies du gène HER2, mais seulement 1 à 2 copies du Chr17, en moyenne. Ce cas est faiblement amplifié. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Cas 5. Carcinome gastrique : non amplifié H&E 60x VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; des signaux SISH et Red ISH distincts sont visibles, à raison de 1 à 2 copies par cellule tumorale. Cas 6. Carcinome gastrique : non amplifié, plusieurs copies de HER2 et du Chr17 H&E 60x VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; plus de 2 copies du gène HER2 et du Chr17 dans certaines cellules. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 7 Cas 7. Carcinome gastrique : amplifié, avec grappes SISH (HER2) H&E 60x 8 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; des grappes SISH (HER2) sont présentes et évaluées par le lecteur. On observe 1 à 2 copies du signal Red ISH pour le Chr17. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Conformité des lames Avant de compter les signaux HER2 et Chr17 pour déterminer le statut du gène HER2, il est primordial de s’assurer que la zone cible invasive (tissu lésionnel) est correctement colorée et qu’elle répond aux critères décrits ci-dessous. Si la cible ne permet pas le comptage, l’utilisateur doit se reporter à la section Résolution des problèmes et évaluer les paramètres requis pour procéder à une nouvelle coloration du tissu du patient. Critère 1. La coloration des contrôles positifs internes doit être présente Les signaux HER2 et Chr17 présents dans les noyaux non néoplasiques (une à deux copies par cellule visibles sous forme de coloration de type « copies uniques » distinctes) jouent le rôle de contrôles positifs internes physiologiques « intra-lame » et doivent pouvoir être visualisés à un grossissement 20x, 40x ou 60x. L’utilisation d’un objectif 100x n’est pas recommandée. Cette coloration nucléaire distincte apparaît généralement dans les cellules normales situées dans et/ou autour de la zone cible, notamment dans les fibroblastes stromaux, les cellules endothéliales, les lymphocytes et les cellules épithéliales normales (voir Figure 3). Les artéfacts de troncature dans le plan de coupe ne permettent généralement pas de visualiser les signaux uniques HER2 ou Chr17 dans toutes les cellules présentes sur la lame, ni dans toutes les régions du tissu. Cependant, un comptage précis nécessite que les signaux de copies uniques soient visibles dans les cellules normales présentes dans et/ou autour de la zone cible. Au moins 50 % des noyaux cellulaires normaux doivent comporter au moins un signal SISH et au moins 50 % d’entre eux doivent comporter au moins un signal Red ISH (les signaux SISH et Red ISH ne doivent pas nécessairement se trouver dans les mêmes cellules) pour que la zone cible soit considérée comme adéquate. Si une zone cible donnée est considérée comme trop faiblement colorée pour être comptée, il est souvent possible de procéder au comptage d’une autre zone cible sur la même lame. Si la coloration de toutes les autres zones de taille supérieure est insuffisante, la lame est considérée comme inadéquate et ne peut pas faire l’objet d’un comptage. Critère 2. La coloration des cellules de carcinome mamaire ou gastrique invasif présentes dans la zone cible doit permettre un comptage À un grossissement 20x, 40x et/ou 60x, les cellules de carcinome mammaire ou gastrique invasif présentes dans la zone cible doivent inclure un ensemble comptable de signaux HER2 (SISH) et Chr17 (Red ISH). En raison de l’hétérogénéité biologique et du plan de coupe, il est possible que certains noyaux tumoraux ne contiennent pas de signal. Cependant, il est important que la zone cible contienne une région acceptable pouvant donner lieu au comptage. Si une zone cible donnée est considérée comme étant trop faiblement colorée pour être comptée, il est souvent possible de procéder au comptage d’une autre zone cible sur la même lame. Si la coloration de toutes les autres zones de taille supérieure est insuffisante, la lame est considérée comme inadéquate et ne peut pas faire l’objet d’un comptage. Critère 3. Le bruit de fond ne doit pas interférer avec le comptage Enfin, tout bruit de fond provenant des systèmes de détection SISH ou Red ISH devra être évalué pour déterminer s’il interfère avec le comptage des signaux SISH ou Red ISH spécifiques. Le bruit de fond associé à la coloration SISH apparaît généralement sous forme de « poussière » SISH qui se distingue des signaux spécifiques (Figure 18). Le fond rouge peut apparaître sous la forme d’une brume rouge ou, plus rarement, de signaux non spécifiques dont l’intensité est plus faible par rapport au signal spécifique (Figures 19 et 20). La Figure 3 contient des exemples de cas présentant une coloration du contrôle positif interne adéquate, qui serait considérée comme appropriée pour le comptage. La Figure 4 présente des exemples de cas inadéquats en raison de l’absence de coloration SISH ou Red ISH des noyaux de contrôle positif, ainsi que des noyaux tumoraux. Ces cas exigent donc une nouvelle coloration avant de procéder au comptage. La Figure 5 présente un cas inadéquat en raison de l’absence de coloration dans les noyaux de contrôle positif. Aucun comptage ne peut donc être effectué sur ce cas, qui doit faire l’objet d’une nouvelle coloration. Reportez-vous à la section Résolution des problèmes pour plus d’informations sur la répétition de la coloration des échantillons pour lesquels un comptage est impossible. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 9 Figure 3. Coloration adéquate dans les noyaux de contrôle positif interne Cas 8. Carcinome mammaire : non amplifié Cas 9. Carcinome mammaire : plusieurs copies du gène HER2 A A A A VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; non amplifié pour HER2. A : noyaux de contrôle positif interne. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; plusieurs copies du gène HER2. A : noyaux de contrôle positif interne. Cas 10. Carcinome mammaire : amplifié A A VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; HER2 amplifié avec des grappes SISH. A : noyaux de contrôle positif interne. 10 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Figure 4. Lame inadéquate en raison de l’absence de coloration SISH ou Red ISH Cas 11. Carcinome mammaire : coloration Red ISH inadéquate Cas 12. Carcinome mammaire : coloration SISH inadéquate A A VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; lame inadéquate en raison d’une coloration Red ISH faible ou inexistante dans les noyaux de contrôle positif interne et les noyaux tumoraux. A : noyaux de contrôle positif interne. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; lame inadéquate en raison de l’absence de coloration SISH dans les noyaux de contrôle positif interne et les noyaux tumoraux. A : noyaux de contrôle positif interne. Figure 5. Lame inadéquate en raison de l’absence de coloration des noyaux de contrôle positif Cas 13. Carcinome mammaire : coloration SISH et Red ISH inadéquate A VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; lame inadéquate en raison de l’absence de coloration SISH et Red ISH dans les noyaux de contrôle positif. A : les noyaux de contrôle positif interne montrent une coloration SISH et Red ISH faible ou inexistante, bien que les cellules tumorales soient colorées par les deux sondes. Ce cas ne peut être compté. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 11 Visualisation et comptage des signaux Figure 6. Visualisation des signaux Les signaux ISH sont visualisés sous forme de copies uniques, de copies multiples et de grappes (Figure 6 et Tableau 1). Les copies uniques présentes dans les cellules normales sont utilisées comme référence pour compter les signaux dans le noyau du carcinome. Les signaux doivent être visualisés à un grossissement 20x, 40x ou 60x. L’utilisation d’un grossissement 100x n’est pas recommandée. Cas 14. Carcinome mammaire : copies uniques Copie unique Un signal distinct est compté comme une copie unique du gène HER2 ou du Chr17. Les signaux uniques distincts visualisés dans les noyaux de contrôle positif interne correspondent à la taille d’une copie unique dans les cellules cancéreuses (Figures 2, 3 et 6). Les noyaux de contrôle positif interne se trouvent dans les cellules stromales normales adjacentes (par exemple, les fibroblastes/fibrocytes et les cellules endothéliales), les leucocytes (par exemple, les lymphocytes et les macrophages) et l’épithélium normal. Il est important de noter que la taille des signaux distincts correspondant à une copie unique du gène HER2 ou du Chr17 peut varier d’un échantillon de patient à un autre. De plus, les signaux SISH (noirs) sont généralement plus petits en taille et mieux visibles que les signaux Red ISH (rouges), en raison de différences liées à la taille des cibles et aux solutions chimiques de détection. C’est pourquoi il est important d’utiliser les signaux uniques visibles dans les noyaux de contrôle positif interne (contrôle physiologique) qui se trouvent à côté de la zone cible (lésion pathologique) comme référence pour évaluer la taille des signaux. Les signaux Red ISH peuvent apparaître plus importants que les signaux SISH, et être parfois de forme allongée ; leur taille peut également varier dans la zone cible et d’un échantillon à l’autre. Copies multiples Comme décrit ci-dessus, les signaux rouges (Red ISH) et les signaux noirs (SISH) distincts visualisés dans les noyaux de contrôle positif interne représentent la taille d’une copie unique dans les cellules de carcinome invasif. Les cas 2, 4, 6, 9, 15 et 18 présentés aux Figures 2, 3, 6 et 8 montrent un certain nombre de noyaux dans lesquels on observe plusieurs copies distinctes dans les noyaux du carcinome. 12 du gène HER2, non amplifiées VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; copies uniques du gène HER2, non amplifiées. Cas 15. Carcinome mammaire : plusieurs copies uniques du gène HER2, faiblement amplifiées VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; plusieurs copies uniques du gène HER2, faiblement amplifiées. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Grappes Une grappe est définie comme un certain nombre de signaux SISH se chevauchant dans le noyau et qu’il est difficile de distinguer individuellement. Comme elles sont difficiles à compter précisément, le nombre de copies du gène HER2 dans une grappe peut seulement être estimé. Par exemple, le nombre de signaux peut être évaluée à 6 dans une petite grappe et à 12 dans une grappe plus grosse. Il est possible d’observer dans un même noyau plusieurs petites grappes, plusieurs grosses grappes, un ensemble de petites et de grosses grappes et/ou des grappes et des signaux uniques. Les cas 3, 7, 10, 16 et 19 des Figures 2, 3, 6 et 8 illustrent des exemples de noyaux dans lesquels des grappes sont visibles. Plus rarement, des grappes de signaux Red ISH peuvent être observées, voir la section « Amplification péricentromérique du chromosome 17 ». Cas 16. Carcinome mammaire : grappes SISH, HER2 amplifié VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; grappes SISH, HER2 amplifié. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 13 Tableau 1 : Visualisation des signaux Si les noyaux se chevauchent, ne pas compter. Les petites grappes SISH ne peuvent être estimées que d’après la taille d’un signal unique. Utiliser les cellules stromales pour estimer la taille du signal (plus petite cellule). Par exemple, cette grappe peut être estimée comme correspondant à 6 signaux SISH ; en ajoutant les 2 autres signaux isolés, on obtient un total de 8. Compter comme 2 signaux rouges. Noter sur la feuille de notation la présence de grappes pour HER2. En l’absence de signaux, ne pas compter. Estimer la grosse grappe. Ici, la grappe peut être estimée comme correspondant à 12 signaux noirs ; en ajoutant les 4 autres signaux isolés, on obtient un total de 16. Compter les signaux rouges comme 2 copies du Chr17. Noter sur la feuille de notation la présence de grappes pour HER2. En présence d’un seul signal ou d’une seule couleur, ne pas compter. Un signal rouge proche d’un signal noir doit être compté comme un signal rouge et un signal noir. Il peut être nécessaire de recourir à un grossissement 60x pour distinguer et compter les signaux. Par conséquent, compter comme 4 signaux noirs et 2 signaux rouges. En cas de chevauchement des signaux les rendant impossibles à distinguer, ne pas compter ce noyau. Si les signaux sont à l’extérieur des noyaux, ne pas compter. La grappe de signaux noirs assombrit le signal/les signaux rouge(s). Un grossissement plus important (60x) peut être utilisé pour tenter de confirmer la présence ou l’absence de signaux rouges ; sinon, ne pas compter : toujours compter les noyaux comportant des signaux rouges francs. Noter sur la feuille de notation la présence de grappes SISH. Les noyaux présentant des signaux rouges visibles et en nombre plus élevé doivent être comptés comme des noyaux à grappes SISH. Compter comme 1 signal noir (HER2) et 1 signal rouge (Chr17). Si une « poussière » SISH de fond apparaît dans les noyaux, compter uniquement si l’on peut facilement distinguer les signaux noirs spécifiques (HER2) par rapport au fond. Compter comme 2 signaux noirs (HER2) et 2 signaux rouges (Chr17). Une brume rouge peut être observée mais ne doit pas être confondue avec des signaux. De petits signaux Red ISH légers peuvent être observés et représenter une liaison non spécifique de la sonde Chr17 à d’autres chromosomes. L’image montre 2 signaux rouges (Chr17) distincts et 2 signaux noirs (HER2). Compter comme 1 signal noir (HER2) et 2 signaux rouges (Chr17). Le signal noir est un doublet. Ne compter deux signaux adjacents de la même couleur que si la distance entre les signaux est supérieure ou égale au diamètre d’un seul signal. 14 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Évaluation des lames Un algorithme d’évaluation quantitative a été développé, optimisant la précision et l’efficacité de la détermination du statut du gène HER2. Une fois la zone cible adéquate identifiée, le lecteur consigne le nombre de copies HER2 et Chr17 présentes dans 20 noyaux représentatifs. Si le ratio HER2/Chr17 obtenu est compris entre 1,8 et 2,2 (inclus), il est recommandé au lecteur de procéder au comptage de 20 autres noyaux afin de calculer ce ratio sur 40 noyaux au total. Le statut du gène HER2 est alors déclaré comme non amplifié (HER2/Chr17 < 2,0) ou amplifié (HER2/Chr17 ≥ 2,0). La Figure 7 illustre le schéma de principe de l’algorithme d’évaluation. Figure 7. Schéma de principe de l’algorithme d’évaluation Départ Lame colorée HER2/Chr17 Lame conforme ? Non Non conforme Refaire la coloration avec une nouvelle lame Oui Identifier et sélectionner la zone cible Compter les signaux HER2 et Chr17 dans 20 noyaux Calculer le ratio HER2/Chr17 en divisant le nombre total de signaux HER2 dans la zone cible 1 par le nombre total de signaux Chr17 dans la zone cible 1 Le ratio HER2/Chr17 est-il compris entre 1,8 et 2,2 (inclus) ? Oui Non Compter 20 noyaux supplémentaires dans la zone cible 2 Calculer le ratio HER2/Chr17 en divisant le nombre total de signaux HER2 dans les zones cibles 1 et 2 par le nombre total de signaux Chr17 dans les zones cibles 1 et 2 Indiquer les résultats Non amplifiés Ratio HER2/Chr17 < 2,0 Amplifiés Ratio HER2/Chr17 ≥ 2,0 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 15 Résumé de l’évaluation Lorsqu’une zone cible présentant une coloration adéquate est localisée, seules les cellules tumorales invasives et représentatives contenant à la fois des signaux SISH (HER2) et Red ISH (Chr17) doivent être comptées. Le comptage des signaux ne doit pas avoir lieu dans les zones qui présentent les caractéristiques suivantes : faiblesse ou absence de signaux SISH ou Red ISH, absence de coloration des cellules de contrôle interne, compression ou superposition des noyaux, présence d’un bruit de fond Red ISH ou SISH excessif ou d’une nécrose. De plus, le comptage des signaux ne doit pas être effectué dans les noyaux non représentatifs de la population générale des noyaux tumoraux invasifs dans la zone cible. Par exemple, les noyaux anormalement gros (taille deux fois supérieure ou plus aux autres noyaux tumoraux présents dans le champ) ou trop petits (environ deux fois moins gros que les autres noyaux tumoraux) ne doivent pas être pris en compte. Enfin, compter uniquement les noyaux représentatifs des noyaux de carcinome invasif avec le plus grand nombre moyen de signaux SISH et Red ISH. L’hétérogénéité est discutée plus en détails à la section Autres observations. gène HER2 et du Chr17. 3. Pour chaque échantillon, identifiez au sein de la région invasive 20 noyaux représentatifs ayant les caractéristiques suivantes : • Les noyaux ne sont pas significativement plus gros ou plus petits que le diamètre médian des noyaux tumoraux moyens. • Les cellules choisies ne doivent pas se superposer à d’autres cellules, mais peuvent présenter un chevauchement minime. • En cas de chevauchement des signaux Red ISH et SISH, le lecteur peut être amené à examiner ces signaux à un grossissement 60x pour pouvoir les discerner. • Les noyaux trop digérés, qui présentent des « bulles », ou qui se trouvent dans des zones présentant une coloration non spécifique sur la lame, susceptibles de gêner le Pour évaluer une lame colorée avec le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, procédez comme suit : comptage, ne doivent pas être pris en compte. Reportez- 1. Examinez la lame colorée à l’hématoxyline-éosine (H&E) afin illustrations de ces types de noyaux. Consultez également de localiser les zones contenant des cellules de carcinome mammaire ou gastrique invasif. 2. Examinez la lame colorée HER2 Dual ISH correspondant à la coloration H&E et identifiez une zone cible contenant des cellules de carcinome mammaire ou gastrique invasif dans laquelle : vous à la section Résolution des problèmes pour voir des la section Facteurs pré-analytiques. • Les noyaux sont représentatifs des noyaux de carcinome invasif avec le plus grand nombre moyen de signaux SISH et Red ISH. • Notez la présence de grappes HER2 et estimez le nombre • la majorité des cellules de la zone choisie présentent des de copies d’après la taille d’une copie unique. Notez que le signaux d’hybridation SISH et Red ISH non obscurcis par un nombre le plus élevé de signaux Red ISH visibles dans les bruit de fond non spécifique ; noyaux incluant des grappes SISH doit être comptabilisé. • on observe des cellules du contrôle positif interne dans 4. Déterminez le nombre total de copies du gène HER2 et du chaque zone adjacente à la zone tumorale à évaluer Chr17 et calculez le ratio correspondant. Si le rapport est (Remarque : la coloration des cellules du contrôle positif compris entre 1,8 et 2,2 (inclus), vous devez procéder à un interne ne s’applique pas aux xénogreffes, car les xénogreffes nouveau comptage sur 20 autres noyaux, afin de calculer sont constituées de lignées de cellules tumorales humaines le ratio sur la base de 40 noyaux. cultivées chez la souris. Par conséquent, les cellules non tumorales sont des cellules de souris contenant des séquences HER2 et de Chr17 de souris qui ne seront détectées par aucune des deux sondes.) ; • la zone est considérée comme adaptée au comptage si plusieurs cellules normales (y compris les fibroblastes stromaux, les cellules endothéliales, les lymphocytes et autres cellules non néoplasiques) présentent une à deux copies du 16 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Exemples de profils de coloration du gène HER2 et du chromosome 17 dans des cas cliniques Les images suivantes (Figures 8 à 11) sont fournies pour illustrer divers profils de coloration susceptibles d’être obtenus au moyen du cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail sur des échantillons de carcinome mammaire ou gastrique. Ces images ont pour but de permettre au nouvel utilisateur du test de se familiariser avec les divers schémas de coloration qu’il est susceptible de rencontrer. Toute coloration réalisée dans le laboratoire de l’utilisateur final doit être interprétée par rapport aux noyaux de contrôle positif interne et aux contrôles effectués sur les cas cliniques au moment de leur évaluation (voir la section Contrôle qualité). Schémas de coloration courants Figure 8. Cas amplifiés, non amplifiés et copies multiples Cas 17. Carcinome mammaire : non amplifié H&E 60x VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; copies uniques du gène HER2, non amplifiées. Cas 18. Carcinome mammaire : plusieurs copies H&E 60x VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; plusieurs copies uniques du gène HER2, plusieurs copies distinctes du gène HER2 et du Chr17 qui doivent faire l’objet d’un comptage minutieux. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 17 Cas 19. Carcinome mammaire : amplifié H&E 60x VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; grappes HER2, amplifiées. Autres observations Les observations différant des schémas de coloration courants (Figure 8) pour la coloration du gène HER2 et du Chr17 peuvent être significatives d’un point de vue clinique et doivent être notées sous forme de commentaires dans le compte-rendu de l’anatomopathologiste. Hétérogénéité Les échantillons de tissu peuvent contenir des noyaux tumoraux mammaires ou gastriques présentant une hétérogénéité génétique du nombre de copies du gène HER2. Dans ces cas, on peut observer un mélange de noyaux amplifiés pour le gène HER2 et non amplifiés pour le gène HER2 (Figure 9). Ceci peut se voir parmi les cellules cancéreuses dans la même zone cible ou entre deux zones cibles différentes dans le tissu. Il est recommandé de choisir les noyaux présentant le plus grand nombre de copies HER2 pour le comptage. Une attention particulière doit également être accordée à la sélection des cellules présentant des nombres représentatifs de copies du Chr17. L’hétérogénéité du nombre relatif de copies doit être notée dans le rapport du patient. Figure 9. Hétérogénéité Cas 20. Carcinome mammaire A B VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; nombre de copies HER2 hétérogène dans une zone cible. A : grand nombre de copies du gène HER2 et polysomie apparente du Chr17. B : faible nombre de copies du gène HER2. Carcinome mammaire invasif et carcinome canalaire in situ D’un point de vue clinique, les copies du gène HER2 et du Chr17 ne doivent être comptées qu’en cas de carcinome invasif. La coloration d’un carcinome canalaire in situ (DCIS) dans des tissus mammaires ne doit pas faire l’objet d’un comptage. Il est conseillé au lecteur de se reporter à la lame H&E correspondante pour déterminer les zones cibles à compter sur la lame colorée VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail (Figure 10). 18 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Figure 10. Carcinome invasif et carcinome canalaire in situ dans des tissus mammaires Cas 21. Carcinome mammaire A B H&E 4x ; carcinome canalaire in situ et carcinome invasif. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 4x ; carcinome canalaire in situ (A) et carcinome invasif (B). (A) Carcinome canalaire in situ (B) Carcinome invasif VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; HER2 amplifié. Le carcinome canalaire in situ ne doit pas faire l’objet d’un comptage. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; HER2 amplifié. Le comptage est effectué dans le carcinome invasif. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 19 Aneusomie du chromosome 17 Monosomie La monosomie est un état dans lequel le noyau tumoral ne contient en moyenne qu’une seule copie du Chr17. On observe environ une copie du gène HER2 dans le cas 22 (Figure 11), mais il est à noter que Chr17 est également monosomique. Il s’agit donc ici d’une perte de matériel génétique du chromosome. Le compte-rendu du cas 22 doit donc mentionner une monosomie 17. Polysomie La polysomie est un état dans lequel le noyau tumoral contient au moins une copie excédentaire du chromosome par rapport à un noyau normal.13 Ces noyaux polysomiques peuvent inclure trois copies ou plus du Chr17 (Figure 11, cas 23). Ils ne doivent pas être confondus avec les noyaux diploïdes en division présents dans tout le tissu et qui contiennent trois à quatre copies du Chr17. Le cas 23 présente plusieurs copies du gène HER2, mais on observe également une polysomie du Chr17 concomitante. Figure 11. Aneusomie du chromosome 17 Cas 22. Carcinome mammaire Cas 23. Carcinome mammaire VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; monosomie. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; polysomie, Perte d’une copie de Chr17 et du gène HER2 associé. plusieurs copies distinctes du gène HER2 et du Chr17. Le comptage de ce cas en vue de déterminer le statut d’amplification doit être effectué avec précaution. 20 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Amplification péricentromérique du chromosome 17 Des cas d’« amplification » apparente, de grappes ou de polysomie du Chr17 (avec ou sans grappes HER2 évidentes) ont été signalés.13-14 Dans le cas 24, le gène HER2 est manifestement amplifié et le Chr17 montre également un profil de coloration en grappes pour le signal Red ISH (Figure 11). Même si le gène HER2 et le Chr17 apparaissent sous forme de grappes, il faut veiller à ne pas considérer ce cas comme une non‑amplification du gène HER2 avec un ratio d’environ 1,0. Dans les cas d’amplification évidente du Chr17, le lecteur doit indiquer le score VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail et les profils de coloration associés aux deux sondes, mais il doit également se reporter à l’immunohistochimie (IHC) lors de la consignation des résultats. D’après notre expérience, la majorité de ces cas où HER2 et Chr17 apparaissent en grappes ont tendance à présenter une surexpression de la protéine (3+ par coloration IHC), voir la Figure 11, cas 24b. Figure 11. Aneusomie du chromosome 17 (suite) Cas 24a. Carcinome mammaire Cas 24b. Carcinome mammaire VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; HER2 amplifié avec amplification péricentromérique du Chr17. IHC 60x ; coloration HER2/neu 4B5, 3+ par IHC, HER2 surexprimé. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 21 Contrôle qualité de la coloration ISH Présence de noyaux de contrôle positif dans chaque échantillon Lames de xénogreffe HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides Comme indiqué à la section Conformité des lames, les signaux normaux associés au gène HER2 (SISH) et au Chr17 (Red ISH) (une à deux copies par cellule) jouent le rôle de contrôles positifs internes « intra-lame » pour chaque cas et doivent être visibles dans l’échantillon. La coloration nucléaire spécifique du gène HER2 et du Chr17 doit être repérable dans diverses cellules, notamment les fibroblastes stromaux, les cellules endothéliales, les lymphocytes et les cellules épithéliales non néoplasiques. Néanmoins, il est possible que certaines cellules ne présentent pas de copies uniques du gène compte tenu de l’hétérogénéité biologique et du plan de coupe. Comme le gène HER2 et le Chr17 sont présents dans chaque cellule humaine, il n’y a pas de véritable contrôle négatif interne. Les lames de xénogreffe HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides doivent être utilisées lors de la première mise en place du test et/ ou lors des opérations de résolution de problèmes en association avec le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail sur les appareils BenchMark IHC/ISH. Un contrôle positif peut être inclus dans chaque cycle de coloration réalisé si l’utilisateur le souhaite. Les contrôles permettent de s’assurer que les réactifs et l’appareil fonctionnent correctement. Il est important de définir les conditions de coloration optimales sur des échantillons de contrôle avant d’analyser les échantillons prélevés sur le patient. Les contrôles positifs peuvent inclure des échantillons préparés de la même façon que les échantillons des patients à tester. Ces échantillons peuvent être utiles car ils servent de contrôles qualité à chaque étape de la procédure, de la préparation des échantillons pré-analytiques au processus de coloration. L’utilisation d’un échantillon préparé différemment des échantillons analysés fournira un contrôle pour les réactifs, l’instrument et les procédures employés, mais pas pour la fixation ni le traitement de l’échantillon. Ces contrôles ne doivent pas remplacer l’évaluation adaptée des contrôles positifs internes dans chaque échantillon de patient. Les lames de xénogreffe HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides contiennent trois noyaux xénogreffés différents fixés au formol et inclus dans un seul bloc de paraffine (Figure 12). Les lignées cellulaires (Calu-3, ZR-75-1 et MCF-7) ont été sélectionnées en fonction de leur caractérisation moléculaire du nombre de copies du gène HER2 et des taux de protéine (d’après la littérature) et correspondent à la plage des copies HER2 observées dans les échantillons cliniques (Figure 13). Notez que les xénogreffes contiennent une alternance de cellules hôtes de souris et de cellules cancéreuses humaines. Ces cellules ne se colorent pas de façon spécifique, le gène HER2 et le Chr17 humains n’étant pas détectables dans les cellules de souris. Les lames de xénogreffe peuvent être utilisées pour la résolution des problèmes liés aux instruments ou aux réactifs (voir la notice réf. 1004915 pour plus de détails). Figure 12. Présentation schématique d’une HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slide + 22 ZR-75-1 MCF 7 HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slide + Calu 3 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Figure 13. Profil de coloration caractéristique des lames de xénogreffe HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; Calu-3, amplifié pour HER2. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; ZR-75-1, environ 3 copies du gène HER2. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; MCF-7, environ 2 copies du gène HER2. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 23 Éléments à prendre en compte avant l’analyse La préparation de l’échantillon avant l’analyse est un facteur essentiel à prendre en compte avant d’utiliser un test d’hybridation in situ.1-4 Concernant le test réalisé avec le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, il est recommandé de fixer le tissu au formol neutre tamponné à 10 % (NBF) pendant 6 à 72 heures, puis de l’inclure en paraffine et de réaliser des coupes d’environ quatre microns d’épaisseur. Le cocktail de sondes VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail a été développé avec des options de prétraitement supplémentaires qui peuvent contribuer à optimiser l’analyse dans les différents laboratoires et à résoudre des problèmes rencontrés avec des tissus ou lames particuliers présentant une coloration sous-optimale. Il est conseillé à chaque laboratoire de procéder à des analyses nominales sur des échantillons de contrôle représentatifs, préparés dans les mêmes conditions que les échantillons cliniques à analyser. Cela permet d’optimiser les conditions de coloration spécifiques des différents laboratoires car les procédures exactes de préparation des échantillons peuvent varier. Il est possible que le test ne permette jamais une coloration adéquate de l’échantillon, si celui-ci est préparé dans des conditions non conformes aux recommandations. Pour toute information générale supplémentaire sur les étapes à réaliser avant l’analyse, reportez-vous aux recommandations ASCO/CAP Guideline Recommendations for HER2 Testing.1-2 Des études ont démontré que la majorité des résultats « non concluants » obtenus par hybridation in situ fluorescente (FISH) sur le gène HER2 sont liés à des facteurs pré-analytiques, notamment à une surfixation et à une sous-fixation,3 ainsi qu’à un retard de fixation.4 L’application stricte de procédures de fixation (par exemple, un processeur dédié visant à garantir une durée minimum de fixation de 6 h) a permis de réduire de 64 % le nombre de cas « non concluants », faisant chuter le taux d’échec de 10,8 % à 3,4 %.3 Fixation Pour les échantillons de biopsie fixés au NBF à 10 %, inclus en paraffine et coupés à environ 4 µm, une exposition au réactif Ventana ISH Protease 3 est recommandée pendant 20 minutes (c.-à-d. la condition pour des analyses nominales). Il est recommandé de procéder à la fixation uniquement avec du NBF à 10 % car certains fixateurs produisent une coloration variable avec les tests basés sur l’ISH (y compris le liquide de Bouin et l’alcool-formol-acide acétique (AFA)). Il convient de noter que l’hétérogénéité biologique et les différences de préparation des échantillons peuvent également avoir une incidence sur l’intensité du signal (c.-à-d. sur la taille des signaux SISH ou Red ISH). Ainsi, l’intensité du signal peut varier d’un cas à l’autre ou d’une sonde à l’autre sur un même cas. Pour chaque lame, les cellules de contrôle interne adjacentes à la zone cible et/ou qui se trouvent à l’intérieur servent de référence pour définir la taille des signaux, et la présence d’une à deux copies colorées du gène HER2 et du Chr17 doit être utilisée pour déterminer la conformité de la lame. 24 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Épaisseur des échantillons Des coupes dont l’épaisseur est supérieure à 4 μm peuvent exiger un prétraitement par protéase plus important, par exemple laisser incuber avec le réactif ISH Protease 3 pendant plus de 20 minutes. L’allongement de la durée d’incubation par protéase permet une détection plus efficace de l’ADN sur les échantillons les plus épais. Les coupes plus fines peuvent nécessiter un traitement par protéase plus doux (par ex., ISH Protease 3 pendant 8 minutes) en cas d’observation d’une coloration de fond excessive ou d’une digestion excessive au sein des noyaux (voir la section Résolution des problèmes). De plus, les coupes de plus de 4 µm peuvent présenter un plus grand nombre de « bulles dans les noyaux » que les coupes plus fines, en raison d’un excès de paraffine dans le tissu (Figure 14). Comme illustré à la Figure 15, la formation de bulles dans les noyaux peut se produire dans le contexte d’une sous-fixation (par ex., 1 à 3 heures avec du formol) qui est une bulle moins visible et plus « floue ». Il est possible de remédier à ce problème dans le cas d’une fixation de 3 heures en modifiant le traitement par conditionnement cellulaire/protéase, mais une fixation d’une heure seulement est probablement irrémédiable. Des bulles peuvent se former dans les noyaux dans des proportions moindres assez fréquemment, ce qui n’affecte généralement pas le comptage. Figure 14. Incidence de l’épaisseur du tissu sur la coloration Cas 25 : Carcinome mammaire A VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; épaisseur de VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; deux fois coupe recommandée de 4 μm. l’épaisseur recommandée (8 μm) : bulles dans les noyaux. Notez que la formation de bulles est plus importante sur la coupe épaisse en raison de l’excédent de paraffine. Figure 15. Exemple de « bulles dans les noyaux » Cas 26. Carcinome mammaire VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; « bulles dans les noyaux ». VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 25 Autres éléments à prendre en compte Type d’échantillon Qualité générale de l’échantillon Il est important de prendre en compte le type d’échantillon qui sera testé (par exemple, du tissu provenant d’une ponctionbiopsie ou d’une excision-biopsie). Il peut être nécessaire d’optimiser le pré-traitement ISH sur chaque type d’échantillon si des différences en termes de qualité de coloration sont observées. La qualité de la coloration peut être médiocre si les tissus contiennent des zones d’artéfacts d’écrasement, des portions nécrosées ou si la morphologie tissulaire est globalement mauvaise. Il est recommandé de vérifier la coloration H&E de chaque cas afin d’évaluer la morphologie globale de l’échantillon. Figure 16. Morphologie nucléaire de mauvaise qualité due à une Équilibre entre morphologie nucléaire et fixation insuffisante et à une digestion excessive par la protéase intensité des signaux Cas 27. Carcinome mammaire Sur des échantillons préparés différemment de la procédure recommandée, il est souvent possible de pouvoir obtenir une coloration adéquate en optimisant simplement le traitement par ISH Protease et/ou les temps de conditionnement cellulaire. Il se peut toutefois que l’utilisation prolongée d’ISH Protease 3 affecte négativement la morphologie du noyau et entraîne une contrecoloration faible du noyau. Le lecteur doit avoir conscience de cela et juger de l’intensité des signaux par rapport à la morphologie et à la contre-coloration des noyaux. Par ailleurs, l’intensité de la coloration du gène HER2 ou du Chr17 peut faiblir en cas d’application d’un traitement par protéase trop fort. A VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; digestion excessive. A : noyaux trop digérés. 26 Une morphologie nucléaire de basse qualité due à une digestion excessive par la protéase (Figure 16) est généralement liée à une « sous-fixation » (< 6 heures) Ceci peut entraîner une perte de signal due à la digestion du matériel nucléaire. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Résolution des problèmes Coloration faible ou inexistante • Les cas qui ne présentent aucune coloration ou une faible coloration du gène HER2 et du Chr17, au point d’empêcher le comptage des signaux, indiquent généralement un ou plusieurs problème(s) lié(s) à la préparation pré-analytique de l’échantillon. Assurez-vous que la durée de fixation, le type d’échantillon et l’épaisseur de coupe sont appropriés. Si les noyaux sont intacts, prolongez le temps d’incubation en prétraitement. • Si la coloration de l’échantillon est satisfaisante pour une sonde mais pas pour l’autre (le gène HER2 est bien coloré mais le Chr17 ne présente qu’une coloration pâle ou inexistante), ceci peut indiquer un problème lié aux réactifs utilisés. Dans ce cas, assurez-vous que les distributeurs ne sont pas obstrués et que les conteneurs de liquide en vrac étaient correctement remplis lors de l’analyse. Vérifiez également que la procédure de déshydratation suivie était appropriée, les bains d’alcool, l’acétone et les incubations longues au xylène étant connus pour dissoudre les signaux Red ISH. Si les signaux SISH sont faibles ou flous, assurezvous qu’un milieu de montage compatible a bien été utilisé pour préserver les signaux (voir la notice des sondes réf. 1018383). • Après avoir écarté ces facteurs, les paramètres de pré-traitement liés aux durées d’incubation par protéase et/ou aux temps de conditionnement cellulaire proposés par le protocole de coloration peuvent être corrigés à la hausse, car ces paramètres sont généralement la méthode la plus efficace pour remédier à une coloration insuffisante (Figure 17). Les temps de prétraitement ne doivent être prolongés que si les noyaux semblent intacts et si une contre-coloration des cellules cancéreuses est visible. Si les noyaux montrent une digestion excessive et une perte de signal liées à cet effet, diminuez la durée d’incubation par protéase (exposition à ISH Protease 3 pendant 8 ou 12 minutes). Figure 17. Exemple de coloration répétée réussie après prolongation du traitement par protéase Cas 28. Carcinome mammaire VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; coloration Red ISH inadéquate. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; coloration inadéquate. La prolongation de l’incubation par la protéase « démasque » l’ADN cible. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; incubation excessive par la protéase entraînant une digestion excessive des noyaux. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 27 Absence régulière de coloration permettant un Figure 18. Poussière SISH comptage dans les cellules de contrôle positif Cas 29. Carcinome mammaire interne Tous les échantillons humains contiennent des cellules normales qui servent de contrôles positifs internes (reportez-vous à la section Conformité des lames). La présence d’une coloration appropriée dans ces cellules normales (contrôle « intra-lame ») indique une coloration adéquate. De nombreux échecs de coloration impliquant une absence totale de coloration, y compris dans ces noyaux de contrôle positif interne, peuvent indiquer un problème au niveau de l’appareil ou des réactifs. Lorsqu’un problème de ce type est suspecté, il est conseillé de lancer une analyse des échantillons de contrôle positif ou des lames de xénogreffe HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides afin de résoudre le problème. Coloration non spécifique et bruit de fond Certains cas présentent un niveau acceptable de bruit de fond Red ISH ou SISH, qui n’interfère pas avec le comptage des signaux spécifiques (Figures 18 et 19). Toutefois, si les lames montrent un bruit de fond excessif qui gêne le comptage des signaux spécifiques (c. -à-d. poussière ou brume dans les noyaux), il est conseillé de recourir à un traitement par protéase plus doux (par exemple, ISH Protease 3 pendant 8 minutes ou 12 minutes). Si le signal SISH est fort, accompagné de poussière ou de brume rouge, et/ou si les noyaux présentent également des signaux Red ISH non spécifiques d’intensité nettement plus faible que les signaux Red ISH spécifiques (Figure 19), l’augmentation de la température de lavage stringent à 76 °C ou 78 °C atténue le bruit de fond rouge non spécifique (brume rouge). La brume rouge se remarque particulièrement dans les tissus « sous-fixés ». La Figure 19 illustre un niveau modéré à sévère de poussière ou de brume rouge dans le noyau ou autour de celui-ci. Il existe également de petits signaux rouges non spécifiques qui ne doivent pas être inclus dans le comptage. C B A B B VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; exemple de poussière SISH dans le noyau, qui masque partiellement le noyau (A). De nombreux noyaux ne sont pas concernés et peuvent facilement être comptés (C). Il existe également une coloration SISH et Red ISH non spécifique de cellules nécrosées (B), qui peuvent être ignorées. Figure 19. Bruit de fond rouge/brume rouge non spécifique Cas 30. Carcinome mammaire VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; brume/bruit de fond rouge non spécifique. 28 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique La Figure 20 illustre un bruit de fond rouge non spécifique sous forme de signal nucléaire dans les cellules tumorales et dans les cellules normales. Ce signal est plus faible que le signal Red ISH spécifique pour le Chr17, mais son extension significative interfère avec le comptage des signaux Red ISH spécifiques. Même si une coloration nucléaire est observée, Ventana recommande d’identifier une autre zone pour le comptage. Figure 20. Bruit de fond rouge non spécifique Cas 31. Carcinome mammaire A B VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; bruit de fond rouge non spécifique sous la forme d’un signal nucléaire dans les cellules tumorales (A) et dans les cellules normales (B). Ce signal est plus faible que le signal Red ISH spécifique pour le Chr17, mais son extension significative interfère avec le comptage des signaux Red ISH spécifiques. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 29 Précipitation des lames Si des zones de précipitations brunes ou noires marquées sont visibles sur ou autour des noyaux, Ventana recommande d’identifier une autre zone pour le comptage ou de colorer une deuxième lame (Figure 21). Certains artéfacts de précipitation peuvent être provoqués par un mauvais positionnement de l’étiquette de la lame. Les étiquettes de lames à code-barres doivent être appliquées sans dépasser du bord de la lame en verre. Il faut éviter d’effectuer un double étiquetage ou de réappliquer l’étiquette sur la lame. Vérifiez que l’appareil et les distributeurs de réactifs fonctionnent correctement et que les conteneurs des réactifs en vrac sont bien remplis. Assurez-vous également que les distributeurs sont munis de leur couvercle car l’acétate d’argent s’oxyde avec le temps. Le Tableau 2 vous aidera à résoudre certains des problèmes décrits ci-dessus en vous fournissant davantage d’explications. Pour de plus amples informations, consultez la procédure étape par étape du manuel de l’opérateur de l’instrument ou contactez votre représentant local. Figure 21. Précipitation Cas 32a. Carcinome mammaire Cas 32b. Carcinome mammaire VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; précipitation modérée autour des noyaux. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 20x ; zone de noncoloration adjacente à la zone de précipitation. Cas 33a. Carcinome mammaire Cas 33b. Carcinome mammaire VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; précipitation marquée autour des noyaux. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 20x ; précipitation sur une grande surface de la lame. 30 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Tableau 2. Description d’une coloration sous-optimale et suggestions de modification du test En cas de coloration faible Modification(s) nécessaire(s) au niveau de la procédure pour obtenir la coloration voulue ou inexistante 1. 2. Coloration Red faible ou inexistante 3. 4. 5. 6. 1. 2. Coloration SISH faible ou inexistante 3. 4. 5. 6. Si un bruit de fond est visible 2. 3. 1. Bruit de fond SISH non spécifique Précipitation Formation de bulles Vérifiez que les distributeurs de réactifs fonctionnent correctement (c. -à-d. qu’ils ne sont ni obstrués ni vides) et que les conteneurs de solution en vrac sont remplis. Si la coloration est toujours faible ou inexistante, passez à l’étape 2. Assurez-vous que le type de fixation, la durée de traitement et l’épaisseur des coupes sont adaptés à un test ISH. Assurez-vous d’utiliser un milieu de montage SISH compatible (voir la notice des sondes) afin de préserver le signal SISH. Si la coloration est toujours faible ou inexistante, passez à l’étape 4. Augmentez la durée de CC1 au-delà de 16 min. Augmentez la durée de CC2 au-delà de 16 min pour le carcinome gastrique et au-delà de 24 min pour le carcinome mammaire. Augmentez la durée du traitement par ISH Protease 3 au-delà de 16 min pour le carcinome gastrique et au-delà de 20 min pour le carcinome mammaire si la morphologie nucléaire est intacte. Modification(s) nécessaire(s) au niveau de la procédure pour obtenir la coloration voulue 1. Bruit de fond Red ISH non spécifique Vérifiez que les distributeurs de réactif fonctionnent correctement (c. -à-d. qu’ils ne sont ni obstrués ni vides) et que les conteneurs de solution en vrac sont remplis. Si la coloration est toujours faible ou inexistante, passez à l’étape 2. Assurez-vous que les lames colorées n’ont pas été déshydratées dans des bains d’alcool ou des lavages longs au xylène, ces procédures dégradant les signaux Red ISH. Si la coloration est toujours faible ou inexistante, passez à l’étape 3. Assurez-vous que le type de fixation, la durée de traitement et l’épaisseur des coupes sont adaptés à un test ISH. Augmentez la durée de CC1 au-delà de 16 min. Augmentez la durée de CC2 au-delà de 16 min pour le carcinome gastrique et au-delà de 24 min pour le carcinome mammaire. Augmentez la durée du traitement par ISH Protease 3 au-delà de 16 min pour le carcinome gastrique et au-delà de 20 min pour le carcinome mammaire si la morphologie nucléaire est intacte. 2. 3. 1. 2. Assurez-vous que les lames utilisées sont des lames chargées positivement (Superfrost Plus ou équivalent) et que l’échantillon est fixé et coupé de façon adéquate pour effectuer un test ISH. Si le bruit de fond Red ISH peut être distingué des signaux Red ISH spécifiques, procédez au comptage de la lame sans prendre en compte les signaux Red ISH non spécifiques. Si le bruit de fond Red ISH dans le noyau interfère avec le comptage, recommencez la coloration en appliquant une température de lavage stringent de 76 °C ou 78 °C. La diminution du conditionnement cellulaire ou du temps d’incubation par protéase permet également d’atténuer le bruit de fond rouge. Assurez-vous que les lames utilisées sont des lames chargées positivement (Superfrost Plus ou équivalent) et que l’échantillon est fixé et coupé de façon adéquate pour effectuer un test ISH. Si le bruit de fond SISH peut être distingué des signaux SISH spécifiques, procédez au comptage de la lame sans prendre en compte les signaux SISH non spécifiques. Si le bruit de fond SISH dans le noyau interfère avec le comptage, recommencez la coloration en raccourcissant le traitement par protéase ou le conditionnement cellulaire. Si des artéfacts de précipitation gênent le comptage, recommencez la coloration. Assurez-vous que les étiquettes à code-barres des lames sont centrées et appliquées sur la lame en verre sans dépasser. Ne pas étiqueter en double ni réappliquer les étiquettes à code-barres. Si la présence de bulles gêne le comptage, assurez-vous que l’épaisseur des coupes et les procédures effectuées avant l’analyse sont conformes aux recommandations. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 31 Tableau 3. Modification des options de procédure logicielle de coloration et incidence sur le test Plage de réglage associée Option de procédure disponible à l’option de procédure Résultat de la modification du réglage logicielle de coloration Coché/non coché La cuisson peut favoriser l’adhérence des tissus fraîchement coupés sur la lame. 16 à 40 min L’augmentation de la durée de cycle entraîne une intensification de la coloration des signaux Red ISH et SISH. La diminution de la durée entraîne un affaiblissement de l’intensité des signaux. 16 à 40 min L’augmentation de la durée de cycle entraîne une intensification de la coloration des signaux Red ISH et SISH. La diminution de la durée entraîne un affaiblissement de l’intensité des signaux. ISH-Protease 3 8 à 24 min Augmente la coloration des signaux Red ISH et SISH, mais les longues durées peuvent influer sur la morphologie. La diminution de la durée affaiblit le bruit de fond et le signal. Température de lavage stringent 72 °C à 78 °C Une température de 76 °C ou 78 °C réduit les signaux Red ISH non spécifiques. Cuisson Cell Conditioning 1 Cell Conditioning 2 Atténuation du signal SISH Formation de bulles dans les noyaux L’oxydation (qui se manifeste par un changement de couleur du noir à l’orange), l’atténuation et/ou la disparition des signaux SISH peuvent être liées à l’utilisation de certaines marques de milieu de montage. Les milieux de montage suivants sont connus pour leur pouvoir oxydant : EUKITT (EMS), Entellan (Merck), Entellan NEW (Merck), HSR (Sysmex) et Malinol (Muto Chemical). Reportezvous à la notice des sondes pour en savoir plus sur la compatibilité des milieux de montage. Si le milieu de montage que vous utilisez ne figure pas dans cette liste, nous vous conseillons de vérifier sa compatibilité avec la technique de détection SISH avant de vous en servir sur des échantillons de patient. Des études internes ont démontré que l’atténuation des signaux SISH apparaît généralement dans un délai allant de quelques heures à une semaine. Comme décrit à la section Autres éléments à prendre en compte avant l’analyse, certains noyaux peuvent présenter des « bulles ». Ceci peut se produire à des niveaux relativement bas de fixation et sur un grand nombre de cas différents, est généralement dû à un excédent de paraffine et/ou à des différences en termes de traitements pré-analytiques, et n’a aucune incidence sur le comptage. La formation de bulles dans les noyaux est plus fréquente sur les coupes plus épaisses (> 6 μm). Contre-coloration faible ou inexistante Pour les cas qui ne présentent pas de contre-coloration nucléaire ou présentent une coloration faible (ce qui rend difficile le discernement des bords des noyaux), recommencez la coloration avec une nouvelle lame et utilisez un prétraitement plus doux (p. ex. , ISH Protease 3 pendant 8 ou 12 min ou un conditionnement cellulaire plus court). Une contre-coloration faible peut indiquer que l’échantillon n’a pas été préparé comme recommandé (c. -à-d. une digestion excessive due à une sous-fixation). Reportez-vous également à la section Autres éléments à prendre en compte avant l’analyse pour plus d’informations sur l’équilibre entre la morphologie des noyaux et l’intensité des signaux. 32 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique Zones faiblement ou non colorées Dans certains cas, la lame peut comporter des zones présentant une faible coloration ou une absence de coloration. Si la zone est limitée et si la lame comporte d’autres zones de coloration adéquates, procéder au comptage dans ces zones (Figure 22). Figure 22. Cas 35. Carcinome mammaire A A VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 20x ; zone sans coloration (A). D’autres zones correctement colorées peuvent être présentes et c’est là qu’il faut procéder au comptage. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 40x ; zone sans coloration (A). D’autres zones correctement colorées peuvent être présentes et c’est là qu’il faut procéder au comptage. Chevauchement des signaux Figure 23. Comme indiqué dans le Tableau 1, certains signaux peuvent être important et se chevaucher. Le signal Red ISH en particulier peut être important et provoquer un chevauchement, ce qui rend les signaux Chr17 indiscernables et complique le comptage (Figure 23). Le comptage doit cibler les noyaux présentant des signaux Chr17 distincts. Cas 36. Carcinome mammaire VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 60x ; signaux Red ISH importants, se chevauchant parfois. Compter les noyaux présentant des signaux Chr17 distincts. VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 33 Références 1. Wolff AC, Hammond ME, Allison KH, et al. Human 10. Press MF, Bernstein L, Thomas PA, et al. HER-2/neu epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: gene amplification characterized by fluorescence in situ American Society of Clinical Oncology/College of American hybridisation: poor prognosis in node-negative breast Pathologists clinical practice guideline focused update. Arch carcinomas. J Clin Oncol. 1997;15(8):2894-2904. Pathol Lab Med. 2018;142: 1364-1382. 2. 11. Gusterson BA, Gelber RD, Goldhirsch A, et al. Prognostic Bartley AN, Washington MK, Colasacco C, et al. HER2 importance of c-erbB-2 expression in breast cancer. testing and clinical decision making in gastroesophageal International (Ludwig) Breast Cancer Study Group. J Clin adenocarcinoma: guideline from the College of American Oncol. 1992;10(7):1049-1056. Pathologists, American Society for Clinical Pathology, and the American Society of Clinical Oncology. J Clin Oncol. 2016; 35: 446-464. 3. scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52(7):797-805. 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Cancer Res. 1993;53(20):4960-4970. 34 VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail pour le carcinome mammaire et gastrique 35 Roche Diagnostics GmbH Sandhoferstrasse 116 DE-68305 Mannheim Germany www.roche.com www.ventana.com © 2019 Ventana Medical Systems, Inc. et Roche Diagnostics International, Inc. Tous droits réservés. VENTANA, BENCHMARK et le logo VENTANA sont des marques commerciales de Roche. Toutes les autres marques sont la propriété de leurs détenteurs respectifs. 1018386FR Rev A 31-03-2019 ">
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